“PCR擴增DNA片段及凝膠電泳鑒定”實驗改進與優化

摘要：本文通過優化實驗步驟、精簡操作環節、巧用實驗裝置、可視實驗結果、創新數據分析等對PCR擴增DNA片段及凝膠電泳鑒定實驗進行優化。實驗改進能更好地優化課堂教學結構，幫助學生建立科學探究的基本方法，提升實驗數據的分析能力，從而有效提升學生的生物學學科核心素養。

關鍵詞：PCR;凝膠電泳；內參照；人類SRY基因

文章編號：1003-7586（2024）02-0062-03 中圖分類號：G633.91 文獻標識碼：B

“PCR擴增DNA片段及凝膠電泳鑒定”實驗是浙科版普通高中教科書《生物學·選擇性必修3·生物技術與工程》（以下簡稱“教材”）第4章第1節內容，本實驗是基于學生對DNA雙螺旋結構及半保留復制過程等模塊知識的延伸和實踐應用。實際教學中常因實驗步驟繁瑣、實驗耗時長、對教師操作要求高等原因，使得實驗“開展率”較低。為了突破教學難點，對本實驗進行改進和優化，通過優化實驗步驟、精簡操作環節、創新實驗裝置、可視實驗結果、巧用數據分析等，讓學生更好地體會生物學學科的實用性，在解決實際問題的過程中激發學生對生命科學的熱愛。

1 教材實驗問題

本活動包含“PCR擴增DNA片段”和“瓊脂糖凝膠電泳與鑒定”兩個實驗。在實際操作過程中存在以下問題：實驗耗時長，PCR擴增、制膠、電泳、染色和脫色等步驟至少需3h；實驗缺少對照導致結果不夠嚴謹；條帶大小判斷較主觀，對DNA Marker條帶利用不充分；靜置脫色較慢，實驗效率較低；凝膠背景模糊。同時，教材中實驗以驗證性實驗的形式呈現，留給學生主動思考和探究的內容較少。基于以上原因，對本實驗進行改進和優化，以提升實驗的可操作性和科學性。

2 實驗操作過程

2.1 實驗原理

SRY基因是啟動男性睪丸發育的主要基因。人類SRY基因位于Y染色體短臂Yp11.3，僅含一個外顯子，無內含子。本實驗選擇人類基因組為模板進行PCR擴增，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）基因為內參照。結果同時擴增出SRY和GAPDH基因條帶，為男性樣品，僅有GAPDH基因條帶，則為女性樣品。

2.2 實驗器材

PCR儀、無菌PCR管、移液槍、電泳儀、電泳槽、凝膠槽、離心機、EP管、細胞裂解液、瓊脂粉、電泳緩沖液、無水酒精、亞甲基藍、上樣緩沖液、DNA Marker5000、蛋白酶K緩沖液、TE緩沖液，引物如表1所示。

2.3 口腔上皮細胞基因組粗提取

實驗前選取興趣小組男女生志愿者各一名，用生理鹽水漱口1 min。將漱口水轉移至離心管中，13 000轉離心1 min，棄上清液。每個離心管內分別加入200 μL細胞裂解液和50 μL蛋白酶K吹打混勻。13 000轉離心1 min，上清液轉移至無菌離心管，加入400 μL無菌水放人-20℃冰箱保存。

2.4 PCR擴增DNA片段

實驗前隱去基因組性別標記，用“甲”和“乙”代替。學生四人一組，每人取兩支無菌PCR管，分別用于擴增SRY和GAPDH基因片段，每人擴增模板需取自同一性別樣品。為方便結果對比，組內兩人取“甲”為模板，另兩人取“乙”為模板。向無菌PCR管中依次加入模板、引物、Taq酶等試劑，最后將全班的PCR管放人PCR儀中，按圖1設定反應程序進行擴增。

2.5 凝膠電泳及染色觀察

制膠：稱取瓊脂粉1.0 g，加到盛有100 mL電泳緩沖液的三角瓶中。用封口膜封緊，微波爐加熱至充分溶解，倒入凝膠槽并立即插上膠梳。冷凝后輕拔膠梳，取出凝膠置于電泳槽內，上樣孔靠近負極側，往電泳槽內加入電泳緩沖液，使之剛好沒過凝膠。

上樣：PCR擴增實驗完成后取出PCR反應管，每管加入10 μL上樣緩沖液，吹打混勻。每塊凝膠的第一個上樣孔內加入20 μL DNA Marker 5000，其余上樣孔依次加入20 μL樣品。

電泳：連接好電泳儀電極，蓋好電泳槽蓋，恒壓150V條件下電泳18 min。

染色：電泳結束后，將凝膠轉移至濃度0.1%亞甲基藍染液中，染液沒過凝膠，染色8 min。

脫色：取出凝膠，加入75%酒精脫色1.5 min;倒去酒精；加入蒸餾水放置搖床中脫色至出現藍色條帶，觀察并分析實驗結果，并在組內、組間交流討論。

3 實驗改進與優化

3.1 縮短實驗時間，提高實驗效率

本實驗開出率較低，主要是因為實驗耗時較長。浙科版新版教材選擇擴增酵母菌的某基因片段，其長度長達841 bp，整個實驗流程下來至少需4個課時，課程安排較為困難。實驗改進后選擇擴增人類SRY和GAPDH部分基因，長度分別為239 bp和554bp。變性、退火、延伸時長均從1min縮短至30 s，預熱和終延伸時長縮短至3 min。興趣小組在預實驗時對比30輪和33輪循環擴增結果發現無明顯差異，故循環減少至30輪。以上改進從整體上縮短了實驗時間，同時也提升了實驗的可操作性。

3.2 引入內參照，確保實驗科學性

對照原則是中學生物學實驗設計中最常用的原則，引入對照組能使實驗更為科學嚴謹。實驗前，教師布置相關問題：為何還要同時擴增GAPDH基因片段？能否僅根據SRY基因片段進行性別判定？學生討論得知人為操作因素會影響實驗結果，不能僅參照SRY基因片段，所以引入內參照對實驗來說至關重要。本次實驗引入GAPDH基因作為內參照，GAPDH基因男女性均有，為管家基因（Housekeeping），序列高度保守，幾乎在所有組織中呈高水平、恒定表達，常用作蛋白質、RNA、DNA等分子生物學相關實驗的標準化內參照。實驗中每個學生都完成兩個PCR反應體系，從某小組實驗結果（見圖2A）明顯能看出“A1號”和“A4號”為“男性”樣品；“A2號”和“A3號”為“女性”樣品，該小組成員都擴增出GAPDH基因片段，說明本組操作較為規范。

3.3 合并樣品上樣，增強實驗現象

預實驗中學生常因移液槍使用不夠熟悉，易將上樣孔戳穿導致樣品外溢，再次上樣時發現上樣孔“不夠用”，重新制膠又需較長時間。如果SRY和GAPDH基因擴增產物上樣到不同泳道，則會導致實驗現象不夠直觀。針對以上問題，教師提問：能否將不同基因片段合并混勻后加入到同一上樣孔中？電泳時不同基因片段是否會相互干擾？學生根據所學知識討論得出：影響電泳的主要因素是基因片段長度、形狀和所帶電荷數，不同基因片段混合后電泳不會相互影響，電泳是分離基因片段的常用方法。本次改進既節約上樣孔，又使得實驗現象更直觀，能直接對同一泳道中兩個條帶進行觀察比較（見圖2B）。

3.4 建構數學模型，表征實驗結果

觀察條帶時，學生主要通過比對臨近Marker條帶的大小，粗略估算出條帶長度。教師提問：①如果DNA條帶位于兩條Marker條帶中間，如何準確計算其長度？②實驗中有8個Marker條帶，多數學生僅用到兩條條帶，其他條帶是否蘊含有重要信息？③已知DNA片段長度的對數值與電泳遷移距離呈負相關，能否利用構建數學模型的方法準確計算片段長度？在分析討論以上問題后，組內學生測量上樣孔與各Marker條帶的距離，即遷移距離，計算全班的數值平均值計入表2。

運用Excel軟件對Marker遷移距離和片段長度的對數值進行散點圖繪制，選中“散點”并添加“趨勢線”獲得如圖3所示曲線。結果顯示R2值達到0．9939，說明趨勢線與數據的擬合度較好。將目的條帶遷移距離代入公式換算，得出片段長度分別約為250bp和549 bp，與實際長度239 bp和554 bp較為接近。以上改進既克服了片段估算的盲目性，使實驗更加嚴謹，又提升了學生構建數學模型的能力。

3.5 巧用實驗器材，提升實驗效果

因儀器設備限制，鼓勵學生充分利用現有設備提升實驗效果。如在觀察染色結果時，凝膠中殘留亞甲基藍且凝膠厚度不均導致背景較深，從而影響觀察和拍照效果。學生提議將凝膠放置于更為平整的臺燈面上方，手動調整臺燈亮度，使得條帶更為清晰干凈（見圖4）。脫色處理時，教材建議將凝膠放入蒸餾水中靜置脫色。預實驗時對比靜置脫色和搖床轉動脫色的效果，結果顯示搖床中脫色使得條帶更加清晰，并且可通過調節搖床轉速和溫度提升脫色效率。

4 實驗小結

通過優化和改進實驗步驟，有效解決了教材中實驗操作耗時長、實驗現象不明顯、實驗結果不理想等問題，避免了因實驗不成功而降低學生學習積極性的情況。根據實驗情況及時調整實驗步驟，如“口腔上皮細胞基因組粗提取”實驗可在課前完成，將基因組凍存于-20℃冰箱，PCR擴增和凝膠電泳及觀察可在“連堂課”完成，其中PCR擴增時長約45 min。在等待PCR擴增的過程中，可配制電泳緩沖液、亞甲基藍染液和凝膠等。此外，由于本活動中需手動測量DNA遷移距離，導致測距誤差較大，可以匯總全班數據取平均值以減小實驗誤差。

實驗教學不僅是生物學課程的特點，更是促成學生達成生物學學科核心素養的重要支撐，本實驗過程中教師需要有效組織學生合作交流，發展科學思維，培養質疑精神，提升創新能力。

基金項目：2022年度浙江省教師教育規劃課題“基于課程綜合化的高中生物學情景教學與實踐”（ZX2022041）。