Gh_D11G050000參與棉花黃萎病抗性的功能分析

收稿日期：2024-04-01" " "第一作者簡介：黃俊森（1998―），男，碩士研究生，huangs19980403@163.com。" *通信作者：高俊山，gaojsh@ahau.edu.cn；楊代剛，yangdaigang@caas.cn；馬雄風，maxf_caas@163.com

基金項目：棉花生物育種與綜合利用全國重點實驗室自主課題：單細胞多組學解析棉花黃萎病防御機制（CB2021E02）；新疆維吾爾自治區重點研發任務專項：“雙30A”早熟機采棉品種選育與配套技術研究（2022B02052-2）；新疆維吾爾自治區昌吉回族自治州科技支撐產業高質量發展專項：多耐受性高品質棉花新品種選育及配套栽培技術示范推廣（2021Z01-01）；國家棉花產業技術體系中早熟品種改良崗位科學家（CARS-15-07）；新疆維吾爾自治區棉花產業技術體系資源研究與育種（早熟棉）崗位專家

摘要：【目的】克隆Gh_D11G050000基因，解析其在棉花黃萎病抗性反應中的功能和作用機制，為開展棉花抗病分子育種提供理論依據。【方法】利用生物信息學方法分析Gh_D11G050000基因的序列特征和系統進化關系。通過實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction， qRT-PCR）分析該基因的表達模式以及大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）侵染后的表達量變化。利用病毒誘導的基因沉默（virus-induced gene silencing， VIGS）技術初步驗證該基因的功能。通過轉錄組測序分析和相關基因的表達量測定初步解析其抗病機制。【結果】Gh_D11G050000與Gh_A11G049600和Gr_11G034620蛋白的親緣關系最近。qRT-PCR分析發現，Gh_D11G050000在棉花根部的表達量最高；該基因的表達量在大麗輪枝菌侵染后顯著增加。Gh_D11G050000沉默植株對大麗輪枝菌的抗性減弱，具體表現為莖稈維管束褐變加重，有病菌繁殖的莖段數量明顯增加，病株率和病情指數顯著升高。轉錄組及qRT-PCR分析表明，Gh_D11G050000沉默棉株中茉莉酸、乙烯信號通路和木質素合成途徑中相關基因的轉錄水平降低。【結論】Gh_D11G050000通過影響木質素合成基因、茉莉酸和乙烯信號通路相關基因的表達正調控棉花對黃萎病的抗性。

關鍵詞：陸地棉；黃萎病；Gh_D11G050000；抗病基因；病毒誘導的基因沉默；茉莉酸；乙烯；木質素

Functional analysis of Gh_D11G050000 involved in cotton resistance to Verticillium wilt

Huang Junsen1， 2， Wang Xingxing2， Yang Li2， Pei Xiaoyu2， He Kunlun2， Liu Yangai2， Zhang Fei2， Zhang Xianliang2， Wang Jun1， Ma Xiongfeng2*， Yang Daigang2*， Gao Junshan1*

（1.School of Life Sciences， Anhui Agricultural University， Hefei 230000， China; 2. Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences/State Key Laboratory of Cotton Bio-breeding and Integrated Utilization/Key Laboratory for Cotton Genetic Improvement， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Anyang， Henan 455000， China）

Abstract： [Objective] This study aims to provide a theoretical basis for molecular breeding of disease-resistant cotton by cloning Gh_D11G050000 gene， and to analyze its function and mechanisms in cotton resistance to Verticillium wilt. [Methods] Bioinformatic method was utilized to analyze the sequence characteristics and phylogenetic relationship of Gh_D11G050000. Quantitative real-time polymerase chain reaction （qRT-PCR） was employed to investigate the expression pattern of this gene， and it's expression level changes after infected by Verticillium dahliae. The function of this gene was validated using virus-induced gene silencing （VIGS） technique. Transcriptome sequencing analysis and the detection of relative expression levels of related genes were conducted to explore the mechanisms of disease resistance. [Results] Gh_D11G050000 exhibited close relationship with Gh_A11G049600 and Gr_11G034620 protein. qRT-PCR analysis revealed that Gh_D11G050000 was highly expressed in cotton roots， and the expression level of Gh_D11G05000 was significantly increased after V. dahliae infection. Gh_D11G050000 silenced cotton plants showed reduced resistance against V. dahliae， characterized by aggravated browning of stem vascular bundles， increased the number of stem segments with bacterial propagation， as well as significantly increased the rate of diseased plants and disease index. Transcriptome analysis combined with qRT-PCR demonstrated that Gh_D11G050000 silenced cotton plants showed decreased transcription levels for several genes in jasmonic acid （JA） signaling pathway， ethylene （ET） signaling pathway， and lignin synthesis pathway. [Conclusion] Gh_D11G050000 positively regulates cotton resistance to Verticillium wilt by influencing the expression of several genes involved in lignin synthesis， JA， and ET signaling pathways.

Keywords： upland cotton; Verticillium wilt; Gh_D11G050000; resistance gene; virus-induced gene silencing; jasmonic acid; ethylene; lignin

棉花（Gossypium）作為全球重要的經濟作物，為紡織業提供了所必需的天然纖維，對國計民生具有戰略意義[1]。棉花的產量和纖維品質經常受到各種生物和非生物脅迫的影響，其中黃萎病（Verticillium wilt）危害尤甚。新疆棉花種植面積占我國棉花種植面積的80%以上，每年有50%～70%的棉田受到黃萎病的侵害，輕則減產20%，重病田減產可高達50%，這對我國棉花產業造成了嚴重影響[3]。我國棉花黃萎病主要由大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）引起[2]，這是1種典型的土傳維管束真菌病害。大麗輪枝菌寄主范圍非常廣泛，包括番茄、土豆、油菜和黃瓜等，這種微生物很難控制。即使面臨干燥、高溫等逆境條件，大麗輪枝菌能以微菌核形式來抵抗惡劣的環境，在土壤中存活20年以上，只要有適宜的環境，便會萌發成菌絲入侵宿主并迅速傳播[4]。

近年來，關于棉花黃萎病抗性機制的研究取得了諸多進展。研究發現，植物激素介導的信號轉導通路起至關重要的作用，特別是茉莉酸（jasmonic acid， JA）、乙烯（ethylene， ET）等[5]。JA是1種脂源性的植物激素，能夠調控植物生長發育和免疫的多個方面[6]。當植物受到病原體的侵染時，病原相關分子模式誘導的免疫反應機制（pathogen-

associated molecular patterns-triggered immunity， PTI）和病原菌效應蛋白誘導的免疫反應機制（effector-triggered immunity， ETI）會引發免疫反應來調節JA的合成[7]，JA含量也會在短時間內迅速上升[8]。研究表明，棉花對黃萎病的抗性與JA信號通路相關基因GbWRKY1、GhCYP82D、GhLac1和GhJAZ2有關[9-12]。Gao等[13]利用大麗輪枝菌侵染海島棉（G. barbadense），鑒定出擬南芥（Arabidopsis thaliana）SSI2的同源基因GbSSI2，利用病毒誘導的基因沉默（virus-induced gene silencing， VIGS）技術抑制該基因的表達，發現JA含量及其相關信號通路基因的表達量下降，棉花對黃萎病的抗性降低。GhHB12響應大麗輪枝菌侵染和JA信號，可抑制JA響應基因GhJAZ2和GhPR3的表達，但不影響棉花的整個JA信號通路[14-15]。ET不僅在種子休眠萌發、果實成熟、葉片衰老脫落等生理過程中起作用，還參與植物對病原菌的防御反應[16-18]。黃萎病菌侵染可引起棉花中ET含量和ET合成相關基因表達量的增加。對海島棉根系蛋白質組的比較研究發現，在接種黃萎病菌后，ET合成酶含量和下游響應基因的表達量都明顯增加[19]。因此，研究JA和ET信號通路對于解析棉花抗病機制可能具有重要作用。

木質素合成是苯丙烷代謝途徑的1個關鍵分支，木質素主要由木質醇單體聚合而成。研究表明，棉花的木質素含量與其對黃萎病的抗性呈正相關關系[20-21]。沉默GhUMC1基因會導致木質素合成基因C4H、HCT、CCoAOMT和CAD的表達量顯著降低，導致木質素含量降低，棉花對黃萎病的抗性減弱[22]。但并非所有的木質素合成相關基因都會增強棉株對黃萎病的抗性。熊顯鵬[23]通過比較2種黃萎病抗性極端的棉花材料，發現Gh4CL30參與木質素和酚類物質的生物合成，當該基因被沉默時，類黃酮、木質素和紫丁香基木質素單體的含量降低，從而增強棉花對大麗輪枝菌的抗性。綜上，木質素可調控棉花對黃萎病的抗性，但其具體的作用機制尚不清楚。

本實驗室前期通過對中棉113兩葉一心期的幼苗進行黃萎病菌強致病力落葉分離株V991處理并進行轉錄組測序分析，篩選到1個響應黃萎病菌的陸地棉（G. hirsutum）基因Gh_D11G 050000。基于此，本研究成功克隆了該基因，并對其在黃萎病菌誘導條件下的表達模式進行研究。通過VIGS技術初步驗證該基因的功能，分析了Gh_D11G050000基因沉默棉株中JA、ET信號通路以及木質素合成相關基因的表達量變化，初步解析該基因的抗病機制，為棉花抗黃萎病育種提供基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料及生長條件。陸地棉抗黃萎病品種中棉113、本氏煙草（Nicotiana benthamiana）均由中國農業科學院棉花研究所棉花資源創新與育種課題組提供。在人工氣候培養室中（溫度為25 ℃，相對濕度保持在70%，16 h光照/8 h黑暗）生長。

1.1.2 黃萎病菌。大麗輪枝菌V991由中國農業科學院棉花研究所棉花資源創新與育種課題組提供。在含有馬鈴薯葡萄糖的瓊脂固體培養基上于25 ℃培養V991，隨后收集菌絲體并轉移至察氏培養基中繼續培養（溫度26 ℃、轉速180 r·min－1）5 d左右，將孢子懸浮液的最終濃度調整為1×107 mL－1。

1.2 基因克隆及生物信息學分析

利用棉花功能基因組數據庫CottonFGD（https：//cottonfgd.org/）獲取Gh_D11G050000的完整序列。參考Liu等[24]的方法，使用Primer Premier 5軟件設計特異引物，以中棉113根部cDNA為模板擴增該基因的編碼序列（coding sequence， CDS）。采用ProtParam在線網站（https：//

web.expasy.org/protparam/）預測蛋白的理化性質。在SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）網站預測蛋白質的三維結構。

從CottonMD數據庫（https：//yanglab.hzau.edu.cn/CottonMD/population_about）獲得Gh_

D11G050000同源蛋白序列，包括3個陸地棉蛋白（Gh_A11G049600、Gh_D10G099100和Gh_

A10G081800）、4個達爾文氏棉（G. darwinii）蛋白（Gd_A11G053800、Gd_D11G053100、Gd_

D10G109300、Gd_A10G109800）、4個黃褐棉（G. mustelinum）蛋白（Gm_D11G051700、Gm_

A11G052600、Gm_D10G107600和Gm_

A10G103800）、3個毛棉（G. tomentosum）蛋白（Gt_A11G054400、Gt_D10G110700和Gt_A10G

109300）、2個特納氏棉（G. turneri）蛋白（Gtur_01g

300500、Gtur_00g284980）、2個雷蒙德氏棉（G. raimondii）蛋白（Gr_11G034620、Gr_10G010510）、

2個草棉（G. herbaceum）蛋白（Ghe11G05410、Ghe10G17360）、2個亞洲棉（G. arboreum）蛋白（Ga10G2050、Ga10G2046）、1個瑟伯氏棉（G. thurberi）蛋白（Gothu.00016924-RA）。使用MEGA 11軟件構建系統進化樹，自展值（bootstrap value）設置為1 000，其他參數采用系統默認值[25]。

使用MEME在線工具（http：//meme-suite.org/

tools/meme）預測蛋白質的保守結構域。利用PlantCARE（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/

webtools/plantcare/html/）在線網站預測Gh_

D11G050000起始密碼子上游2 000 bp區域內的順式作用元件。在WoLF PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/）在線平臺預測蛋白的亞細胞定位情況。

1.3 基因相對表達量分析

中棉113生長至兩葉一心期，取其根、莖和葉，并用V991孢子懸浮液進行傷根法處理，分別收集處理后0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h的根系，迅速用錫箔紙包裹后放入液氮中，隨后將樣品轉移至－80 ℃條件下進行長期保存。

將儲存的樣品研磨后利用北京天根生化科技有限公司的多糖多酚總RNA提取試劑盒RNAprep Pure提取RNA，然后使用北京全式金生物技術公司的反轉錄試劑盒EasyScript○R" One-Step gDNA Removal和cDNA Synthesis

SuperMix反轉錄為cDNA，并存儲于－20 ℃條件下備用。使用Primer Premier 5軟件設計特異引物。選擇陸地棉泛素基因GhUBQ7作為內參基因。引物序列見附表1。使用北京全式金生物技術公司的熒光定量試劑盒TransStar○R" "Top Green qPCR SuperMix進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction， qRT-PCR）。配制20 μL的反應體系：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，正反向引物各0.4 μL；cDNA模板2 μL；無菌水7.2 μL。反應程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火，延伸34 s，循環40次；95 ℃變性15 s，60 ℃延伸60 s，95 ℃變性15 s。采用2－△△Ct法[26]計算目標基因的相對表達量，至少進行3次重復。

1.4 亞細胞定位

將Gh_D11G050000的CDS全長克隆到pBI101-35S-GFP載體中，并使用pBI101-35S-

GFP載體作為對照。將上述載體分別轉化至農桿菌GV3101感受態中，待煙草生長出4～5片真葉時，選擇植株中部偏上且較薄的葉片，將農桿菌均勻地注入煙草葉片內；注射完成后將煙草置于室溫、黑暗條件下培養36～48 h，隨后使用激光共聚焦顯微鏡觀察煙草葉片中綠色熒光蛋白（green fluorescent protein， GFP）信號，至少進行3次重復。

1.5 VIGS實驗

參考Liu等[24]的方法構建VIGS載體，首先采用Primer Premier 5軟件設計特異性引物，然后將目標基因片段連接至pTRV2載體。采用凍融法分別將TRV2：：Gh_D11G050000載體、陽性對照載體TRV2：：GhPDS、TRV2載體和TRV1載體轉化至農桿菌GV3101，于－80 ℃條件下保存備用。將TRV2：：GhPDS、TRV2：：Gh_D11G050000和TRV2的農桿菌懸浮液分別與TRV1的農桿菌懸浮液按照體積比1∶1混合，將混合好的菌液分別注射到2片子葉剛剛平展的棉花幼苗子葉中，盡量減少對植株的損害，在黑暗條件下培養24 h后轉移至正常光照條件下培養。

1.6 黃萎病抗性鑒定

待TRV：：GhPDS棉株出現白化表型時，用qRT-PCR檢測TRV：：Gh_D11G050000和TRV：：00空白對照葉片中Gh_D11G050000的相對表達量。選取長勢一致的實驗組和對照組棉花幼苗各6株采用傷根法接種V991懸浮液。接種后7 d、14 d、21 d和28 d，調查棉株的發病情況，病情分級參考《棉花抗病蟲性評價技術規范 第5部分：黃萎病》（GB/T 22101.5－2009）[27]，參考高升旗等[28]的方法計算病株率和病情指數。

在接菌后14 d提取莖段的基因組DNA作為模板，利用真菌特異引物ITS1-F和大麗輪枝菌特異引物STVe1-R，用qRT-PCR技術檢測V991 DNA的相對豐度，以GhUBQ7作為內參基因。另外，進行剖稈實驗以觀察大麗輪枝菌在維管束中的生長狀況。

真菌恢復培養：接種V991后21 d，將莖段均勻放置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上，以培養基中線為分界線，兩邊各放置8個TRV：：00和TRV：：Gh_D11G050000莖段，在25 ℃恒溫培養箱中培養3～5 d，其間每天觀察表型并拍照，至少進行3次重復。

1.7 轉錄組測序

黃萎病菌V991侵染后24 h，取TRV：：00和TRV：：Gh_D11G050000的根莖混樣進行RNA測序，每個處理進行3個生物學重復。使用1 μg總RNA構建測序文庫，在上海派森諾生物科技有限公司使用Illumina平臺進行測序。Clean data使用HISAT2映射到陸地棉參考基因組（CRI v1版本）[29]，匹配的Clean data使用StringTie工具[30-31]進行組裝和定量。根據每個基因的長度，確定每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的片段（fragments per kilobase of transcript per million mapped reads， FPKM），并用于評估基因的表達水平。通過使用DESeq2 R程序進行差異表達分析[32]。篩選差異表達基因時，以Fold Change≥2和FDR＜0.05作為標準。使用基于Wallenius非中心超幾何分布的GOseq R軟件包進行基因本體（gene ontology， GO）富集分析[33]。采用KOBAS軟件進行京都基因和基因組數據庫（Kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG）通路富集分析[34]。

1.8 抗病性相關基因的表達分析

在接種V991后24" h取TRV：：Gh_D11G050000和TRV：：00的根系，用qRT-PCR檢測相關基因的表達水平。包括JA信號通路相關基因，GhOPR3-1、GhOPR3-3、GhMYC2、GhLOX6-1、GhLOX3-2、GhLOX2-2、GhJAZ1、GhAOS2和GhAOC3；ET信號通路相關基因GhACO1-1、GhAOC1-2、GhACS6a、GhACS6b、GhEIN3-1、GhEIN3-3、GhERF1-1、GhERF1-2和GhERF1A；木質素合成相關基因GhF5H-3、GhCoMT-1、

GhCoMT-2、GhCCoAoMT-2、GhCCoAoMT-3和

GhHCT-1。引物序列見附表1，以GhUBQ7為內參基因，方法同1.3，至少進行3次重復。

1.9 數據處理與分析

用Microsoft Excel 2019進行數據整理，采用SPSS 19.0軟件進行方差分析，使用鄧肯氏新復極差法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 Gh_D11G050000生物信息學分析

序列分析發現，Gh_D11G050000基因含有1個外顯子，沒有內含子，其CDS全長為303 bp，編碼100個氨基酸。以中棉113 cDNA為模板PCR擴增出長度約為300 bp的片段（附圖1）。蛋白質理化性質分析發現，丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺占比相對較高，均為8%；蛋白分子式為C492H783N150O150S7，分子量約為11 437.97 Da；該蛋白不穩定系數為73.63，屬于不穩定蛋白。根據預測結果，Gh_D11G050000是1種親水性蛋白，無信號肽或跨膜結構。經預測，Gh_D11G050000蛋白的三維結構含有無規則卷曲和1個α-螺旋（附圖2）。

2.2 Gh_D11G050000蛋白系統進化樹及保守結構域分析

蛋白序列系統進化分析表明，Gh_

D11G050000同源蛋白可分為4個亞組，分別包括10個、9個、1個和5個蛋白，Gh_D11G050000與Gh_A11G049600和Gr_11G034620的親緣關系最近（圖1A）。

經預測，Gh_D11G050000及其24個同源蛋白共含有9個保守基序，將這些保守基序命名為Motif 1～Motif 9。第1亞組的蛋白均含有Motif 1、Motif 2和Motif 3，第2亞組的蛋白均含有Motif 1、Motif 2和Motif 4。進化樹中所有蛋白都含有Motif 1（圖1B）。Motif 1的氨基酸序列標識圖見圖1C。

2.3 啟動子順式作用元件分析

Gh_D11G050000基因的啟動子區存在響應植物激素信號的順式作用元件，如赤霉素應答元件TATC-box、脫落酸應答元件ABRE，這暗示了Gh_D11G050000可能受到這些植物激素的調控。此外，還發現了一些與光響應、非生物脅迫等相關的順式作用元件，如光應答作用元件G-Box、低溫應答作用元件LTR、參與干旱誘導的MYB結合位點MBS（附表2）。表明Gh_

D11G050000基因可能在植物對逆境的響應中發揮重要作用。

2.4 Gh_D11G050000基因表達模式分析

兩葉一心期，Gh_D11G050000基因在棉花根部的表達量最高，其次是主莖，而在葉中的表達量較低（圖2A）。Gh_D11G050000基因在接種黃萎病菌后12 h表達量急劇上升，在24 h達到峰值，而在48 h表達量明顯降低（圖2B），說明Gh_D11G050000基因受黃萎病菌誘導表達。

2.5 Gh_D11G050000蛋白的亞細胞定位分析

經預測，Gh_D11G050000蛋白定位在細胞核中。為驗證Gh_D11G050000蛋白在細胞中的位置，構建熒光蛋白表達載體35S：：Gh_D11G050000-

GFP，并將其用于浸染煙草葉片下表皮。結果表明，Gh_D11G050000與GFP的融合蛋白在細胞膜和細胞核中均能檢測到綠色熒光，這證明Gh_D11G050000蛋白在煙草葉片的細胞核和細胞膜上共定位（圖3）。

2.6 沉默Gh_D11G050000基因降低棉花對黃萎病的抗性

為探究Gh_D11G050000基因在棉花抵御黃萎病菌侵害中的作用，通過VIGS技術初步驗證該基因的功能。侵染后14 d，陽性對照TRV：：GhPDS棉花幼苗的真葉出現白化現象（圖4A）。qRT-PCR結果表明，TRV：：Gh_D11G050000植株中Gh_D11G050000的表達量極顯著下降（圖4B）。

在接種黃萎病菌后21 d，與TRV：：00相比，TRV：：Gh_D11G050000植株出現了更為嚴重的葉片萎蔫、變黃甚至落葉現象（圖4C），TRV：：Gh_D11G050000莖稈維管束褐變更嚴重（圖4D）。真菌恢復培養實驗顯示，TRV：：Gh_D11G050000有病原菌繁殖的莖段數量明顯超過TRV：：00（圖4E），這表明大麗輪枝菌在沉默植株中的侵染程度更加嚴重。真菌DNA相對豐度檢測結果顯示，TRV：：Gh_D11G050000植株中黃萎病菌DNA相對豐度約為對照組的35倍，差異極顯著（圖4F）。在接種大麗輪枝菌后7 d、14 d、21 d和28 d，TRV：：Gh_D11G050000棉株的病情指數和病株率均顯著高于TRV：：00（圖4G～H）。以上結果表明，沉默Gh_D11G050000基因會降低棉花對黃萎病的抗性。

2.7 Gh_D11G050000抗病機制探究

此外，我們還對黃萎病菌處理下VIGS植株（TRV：：00和TRV：：Gh_D11G050000）的根莖混樣進行了轉錄組分析。與對照組TRV：：00相比，TRV：：Gh_D11G050000共鑒定出688個差異表達基因（differentially expressed gene， DEG），包括373個上調基因和315個下調基因（圖5A）。植物對黃萎病菌的防御機制受一系列轉錄因子的調節。DEG中共有18個轉錄因子（圖5B），其中乙烯響應因子（ethylene response factor， ERF）和TCP（1種植物特有的轉錄因子）的數量（均為5個）明顯多于其他轉錄因子。

GO富集分析顯示，DEG共分為3類，分別是生物學過程、細胞組分和分子功能（圖5C）。主要富集在天冬氨酸型內肽酶活性、植物細胞壁組織結構、亞精胺生物合成過程、激素應答等。推測細胞壁首先在防御黃萎病菌中發揮屏障作用，然后各種激素、酶等相繼發揮作用共同抵御黃萎病侵害。KEGG富集分析顯示，大多DEG富集在雙組分系統、MAPK信號通路、植物晝夜節律、淀粉和蔗糖代謝及α-亞麻酸代謝途徑（圖5D），表明Gh_D11G05000可能參與調節這些代謝途徑，以幫助棉花應對黃萎病菌侵害。

qRT-PCR結果表明，在接種黃萎病菌后24 h，與對照組TRV：：00相比，TRV：：Gh_D11G050000植株根系中JA信號通路相關基因（GhAOC3、GhAOS2、GhLOX2-2、GhLOX3-2、GhLOX6-1、GhMYC2、GhOPR3-1、GhOPR3-3和GhJAZ1）、ET信號通路相關基因（GhACO1-1、GhACO1-2、GhACS6a、GhACS6b、GhEIN3-1、GhEIN3-3、GhERF1-1、GhERF1-2和GhERF1A）和木質素合成相關基因（GhCCoAoMT-2、GhCCoAoMT-3、GhCoMT-1、GhCoMT-2、GhF5H-3和GhHCT-1）的表達量均顯著或極顯著降低（圖6）。

3 討論

近幾十年來，雖然我國大力推廣抗蟲抗病棉，并且選育出了大批優良品種，但黃萎病仍然是制約棉花生產的重要病害之一。Chen等[35]研究發現，大麗輪枝菌與植物共同進化，因此，了解棉花與大麗輪枝菌的互作機制對于增強棉花持久抗性具有重要意義。前人從棉花的組織結構特征、植物激素介導的抗病信號通路等方面分析了棉花與大麗輪枝菌的關系[9-12， 19-23]。本研究發現，Gh_D11G050000啟動子區存在赤霉素、脫落酸、低溫和光等應答元件，表明該基因可能通過脫落酸和赤霉素信號參與植物生長發育和對逆境脅迫的應激反應。VIGS實驗證實Gh_D11G050000沉默棉株對黃萎病的抗性顯著降低，表明Gh_D11G050000正調控棉花黃萎病抗性。

作為植物免疫的中樞調節因子，植物激素在植物的生長發育、抗病反應中發揮重要的作用[36]。目前大多數研究更傾向于認為黃萎病菌的寄生方式是半活體營養型[37]，而JA、ET在植物對死體和半活體病原菌的抵御中發揮重要作用[38-39]。當植物感知到黃萎病菌入侵時，α-亞麻酸作為JA的合成前體，依次經過脂氧合酶（lipoxygenase， LOX）、丙二烯氧化物合酶（allene oxide synthase， AOS）、丙二烯氧化物氧環酶（allene oxide cyclase， AOC）等的催化，生成12-氧-植物二烯酸，接著被轉運到過氧化物酶體中，經一系列催化反應生成JA。本實驗中，Gh_D11G050000可以調節JA信號通路相關基因的轉錄水平，在Gh_

D11G050000表達被抑制時，JA信號通路相關基因（GhAOC3、GhAOS2、GhLOX2-2、GhLOX3-2、GhLOX6-1、GhMYC2、GhOPR3-1、GhOPR3-3和GhJAZ1）的表達量顯著下降，暗示Gh_

D11G050000影響JA信號通路上游相關基因的表達。植物在受到環境脅迫后ET的合成會迅速增加，氨基環丙烷-1-羧酸合成酶（aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase， ACS）是ET合成的限速酶，ACS的活性直接影響植物體內ET含量。在植物體內，當ET含量較高時，EIN2就會被去磷酸化和分解，其中的1個C末端片段會與EBF1和EBF2轉錄本的3’非翻譯區結合，從而激活EIN3和EIL1的轉錄，進而誘導下游轉錄因子ERF的表達。本研究發現，當Gh_

D11G050000表達被抑制時，ET信號通路相關基因（GhACO1-1、GhACO1-2、GhACS6a、GhACS6b、GhEIN3-1、GhEIN3-3、GhERF1-1、GhERF1-2和GhERF1A）的表達量顯著下降，轉錄組分析結果顯示Gh_D11G050000基因沉默棉株中多個ERF轉錄因子呈現下調表達，暗示Gh_D11G050000通過調節ET信號通路來抵御黃萎病菌的侵害。

植物細胞壁在抵御病原體入侵過程中發揮著重要作用。在大麗輪枝菌侵染棉花時，導管中的木質素和萜類化合物的合成增多，導致導管阻塞。隨著木質素的沉積，細胞壁發生木質化，從而提高細胞壁的強度，增強植物對黃萎病的抗性[28]。目前，已發現多個參與木質素生物合成的酶。在苯丙烷代謝途徑中，莽草酸/奎寧酸羥基肉桂酰轉移酶（shikimate/quinate hydroxycinnamoyl transferase， HCT）、咖啡酰輔酶A-O-甲基轉移酶（caffeoyl coenzyme A-O-methyltransferase， CCoA-

oMT）、咖啡酸-O-甲基轉移酶（caffeic acid O-

methyl-transferase， COMT）和阿魏酸-5-羥化酶（ferulate-5-hydroxylase， F5H）等酶起到了關鍵性作用。本研究表明，與TRV：：00相比，接菌后TRV：：Gh_D11G050000植株中木質素合成相關基因（GhCCoAoMT-2、GhCCoAoMT-3、GhCoMT-1、GhCoMT-2、GhF5H-3和GhHCT-1）的表達量均顯著下降。轉錄組KEGG富集分析結果顯示，大量DEG富集在苯丙烷代謝通路中。根據以上結果推測Gh_D11G050000通過苯丙烷代謝通路參與調節木質素的生物合成，進而影響棉花對黃萎病的抗性。

木質素的合成代謝可能與JA的生物合成與分解有關。JA合成及信號轉導相關基因的表達變化可能會影響木質素的代謝過程，反之，木質素的代謝變化也可能對JA的合成及其信號轉導產生影響[40-41]。在棉花中敲除GhLOX2，并接種大麗輪枝菌，發現JA信號通路相關基因的表達受到抑制，植株體內木質素含量和H2O2含量降低[42]。本研究發現Gh_D11G050000影響JA、ET信號通路和木質素合成相關基因的表達量，但在Gh_D11G050000的影響下，木質素與其他調節因子的協同或拮抗關系尚不清楚，仍需進一步探究。

4 結論

Gh_D11G050000受黃萎病菌誘導表達。Gh_

D11G050000蛋白定位于煙草葉片的細胞核和細胞膜上。利用VIGS技術沉默Gh_D11G050000可以降低棉花對大麗輪枝菌的抗性。接種V991后，基因沉默棉株中ET、JA信號通路和木質素合成相關基因的表達量均顯著低于對照組。說明Gh_D11G050000通過正調控木質素合成基因和JA、ET信號通路相關基因的轉錄水平增強陸地棉對大麗輪枝菌的抗性。

附圖附表：

詳見本刊網站（http：//journal.cricaas.com.cn/）本文網頁版。

附表 1 本研究所用的引物信息

Table S1 Information of primers used in this study

附圖 1 中棉113中Gh_D11G050000的PCR擴增結果

Fig. S1 PCR results of Gh_D11G050000 gene in Zhongmian 113

附圖 2 Gh_D11G050000蛋白三維結構預測

Fig. S2 Prediction of 3D structure of Gh_D11G050000

附表2 Gh_D11G050000啟動子區順式作用元件預測

Table S2 Prediction of cis-acting elements in the promoter of Gh_D11G050000

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（責任編輯：王小璐" " 責任校對：秦凡）" " "●