日本落葉松瞬時轉化體系的優化及初步應用

摘要：[目的]優化農桿菌介導的日本落葉松胚性愈傷組織瞬時轉化體系。[方法]以液體增殖培養7d的日本落葉松胚性愈傷組織為受體材料，利用攜帶β-葡糖醛酸酶基因（GUS）的pCAMBIA1305.1載體進行瞬時轉化，根據GUS的表達量及酶活性，篩選最佳侵染液濃度、侵染時間和共培養時間。并利用篩選出的轉化體系，分析落葉松scarecrow-like6（LaSCL6）啟動子的活性。[結果]瞬時轉化后，GUS表達明顯。當侵染液濃度OD600為0.2，侵染5 min，共培養72 h時，GUS的表達量最高，△cT值為-2.274 2；當侵染液濃度OD600為0.05，侵染5 min，共培養72 h時，GUS酶活性最高，為25.7286 U·L-1。LaSC/6啟動子的活性是CaMV35S啟動子的1.55倍。[結論]綜合考慮GUS的表達量和酶活性，當侵染液濃度OD600為0.05，侵染5 min，共培養24 h時，GUS的表達量和酶活性較高，這一條件可以用來進行日本落葉松胚性愈傷組織的高效轉化。

關鍵詞：落葉松；瞬時轉化；胚性愈傷組織；GUS；啟動子

中圖分類號：S722;S791.223 文獻標識碼：A 文章編號：1001-1498（2024）03-0129-07

瞬時表達分析是一種快速研究基因功能的方法，T-DNA雖然未被整合到宿主基因組上，但在其進入宿主細胞后，仍可以進行轉錄和翻譯，在轉化后12 h左右即可檢測到目的基因的表達。瞬時轉化體系以其快捷、高效的優勢被廣泛應用于外源基因表達分析、基因沉默、啟動子分析、蛋白互作等許多植物分子生物學領域。瞬時表達系統的受體材料主要包括愈傷組織、原生質體、葉片等。與其它受體材料相比，愈傷組織具有成本低、轉化效率高、能夠大量增殖培養等優勢，因此，以愈傷組織為受體材料的瞬時轉化體系在植物基因功能研究中具有重要的應用價值。但是，瞬時轉化過程中一些參數和培養條件會影響轉化效率，如農桿菌菌液的濃度、侵染時間和共培養時間等。因此，轉化條件的探索對轉化體系的建立及轉化效率的提高至關重要。

日本落葉松（Larix kaempferi （Lamb.） Carr.）具有材質優良、抗病性強和用途廣等特點，是我國重要的人工造林樹種。隨著日本落葉松基因組的測定，日本落葉松中越來越多重要的基因被鑒定出來，因此，基因功能的解析已成為當前日本落葉松研究的主要目標。遺傳轉化技術是研究基因功能的重要手段，其中根癌農桿菌介導的遺傳轉化是最常用的轉基因方法之一。自從Rossi等于1993年在煙草中首次成功建立以來，該技術目前已在多種植物中成功應用。遺傳轉化包括穩定轉化和瞬時轉化，目前，已經建立了農桿菌介導的日本落葉松胚性愈傷組織穩定轉化體系，對于其瞬時轉化體系的研究仍未見報道。

本研究以農桿菌介導的日本落葉松胚性愈傷組織穩定轉化體系為基礎，利用攜帶β-葡糖醛酸酶基因（GUS）的pCAMBIA1305.1載體進行瞬時轉化，通過分析侵染液濃度、侵染時間和共培養時間對GUS表達量和酶活性的影響，篩選高效的瞬時轉化條件，為日本落葉松基因及其啟動子的功能研究提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 植物材料與培養條件

實驗材料為本實驗室保存的由日本落葉松未成熟種子誘導的胚性愈傷組織。在固體增殖培養基上每隔15 d繼代一次，在液體增殖培養基上每7d繼代一次。增殖培養在暗環境（25+2℃）下進行。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA提取

使用CTAB植物基因組DNA快速提取試劑盒（ZP309K-2，北京莊盟國際生物基因科技有限公司）進行總DNA的提取，具體操作按照說明書進行。通過瓊脂糖凝膠電泳確定DNA的質量，使用分光光度計對DNA的濃度進行檢測。合格的DNA于-80℃冰箱保存。

1.2.2 落葉松scarecrow-like 6（LaSCL6）啟動子克隆及載體構建

利用日本落葉松基因組數據[16]，選取LaSCL6起始密碼子上游2 500 bp序列進行引物設計。以DNA為模板，利用引物5＇-AAACCCTCGTCATGGATTTG-3’和5’-TGACAGCAAAACCAAAAA-3’進行PCR擴增。PCR產物切膠回收后進行TA克隆和測序驗證。以測序正確的質粒為模板，利用分別帶有HindⅢ和Nco Ⅰ酶切位點的引物5'-GACCTGCAGGCATGCAAGCTTAAACCCTCGTCATGGATTTG-3’和5'-TTACCCTCAGATCTACCATGGTGACAGCAAAACCAAAAA-3’進行PCR擴增（下劃線表示酶切位點序列）。利用HindⅢ和Nco Ⅰ酶分別消化pCAMBIA1305.1載體和PCR產物，酶切產物切膠回收后進行連接和轉化，測序驗證后獲得PLaSCL6：：GUS重組質粒。

1.2.3 侵染

通過凍融法將攜帶GUS的pCAMBIA1305.1載體（35S：：GUS）和重組質粒（PLaSCL6：：GUS）轉入根癌農桿菌GV3101感受態細胞中。取200”μL菌液，涂于含50 mg·L-1卡那霉素的固體Luria-Bertani（LB）培養基上，28℃倒置培養2d。挑取單菌落于含50 mg·L-1卡那霉素的液體LB培養基中，28℃，200 rpm搖床上震蕩培養至OD600為0.6～0.8。菌液4℃，4 000 rpm，離心10 min后，棄上清，收集菌體。使用含20 mg·L-1乙酰丁香酮的液體增殖培養基重懸菌體，使菌液OD600分別為0.05、0.1和0.2（表1），此時得到的溶液即為侵染液。

胚性愈傷組織液體增殖培養7d后，使用抽濾脫菌裝置抽干水分，置于侵染液中進行侵染，侵染時間分別為1、5和10 min（表1）。侵染之后使用抽濾脫菌裝置將混合物抽干，之后將愈傷組織轉移至含有20 mg·L-1乙酰丁香酮的固體增殖培養基BM中，23℃，黑暗條件下分別共培養24、48和72 h（表1），隨后收集材料，-80℃保存。

1.2.4 RNA提取、半定量RT-PCR和定量RT-PCR（qRT-PCR）

以瞬時轉化的胚性愈傷組織為材料，使用RNA提取試劑盒提取總RNA（ERl01，北京全式金生物技術），具體操作按照說明書進行。使用核酸檢測儀及瓊脂糖凝膠電泳進行RNA濃度及純度檢測。使用反轉錄試劑盒（P10720，北京全式金生物技術）將檢測合格的RNA反轉錄為cDNA。以cDNA為模板進行半定量RT-PCR和qRT-PCR檢測，LaEFIA1為內參基因，引物序列為5’-GACTGTACCTGTTGGTCGTG-3‘和5’-CCTCCAGCAGAGCTTCAT-3’。以pCAMBIA1305.1載體中的GUS作為檢測基因，引物序列為5’-CGAAGCGAGCAATGTGATGG-3’和5’-GATCCGCAAGACGCATCAAC-3’。

半定量RT-PCR反應體系：1μLcDNA，12.5 μLKOD酶，引物各0.75μL，10μL RNase-freeH2O。反應條件：94 CC 2 min; 98℃10 s，55 ℃5s，68℃15 s，32個循環；68℃2 min。PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

qRT-PCR反應體系：12.5 μL TB GreenPremix Ex TaqTM，2UL cDNA，引物各0.5 μL，9.5UL RNase-free H2O。反應條件：95℃30 s；95℃5s．60℃30 s，40個循環；95℃10 s；65℃5s；95℃5s。每個反應進行3次重復，表達量以ACT值體現，結果以平均值±標準差（Mean±SD）的形式表示。

1.2.5 GUS酶活性檢測

將-80℃保存的實驗樣品置于液氮中研磨成粉末，以1：9的比例置于0.01 mol·L-1 PBS緩沖液中，充分混勻后，4℃離心15 min，5 000 rpm，取上清移入新的管中，放到冰上備用。之后使用分光光度計檢測上清中總蛋白含量，隨后置于-20℃備用。使用β-葡萄糖苷酸酶酶聯免疫分析試劑盒（LB5023A，武漢力博瑞生物科技有限公司）進行GUS酶活性檢測，具體操作步驟按照說明書進行。使用酶標儀在450 nm波長下測定標準品與待測樣品的吸光度，以標準品的濃度為橫坐標，OD450處的值為縱坐標，使用Excel繪制出標準曲線。根據待測樣品的OD450處的值計算樣品相應的濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品總蛋白的濃度。每個樣品檢測3次，檢測結果以平均值±標準差（Mean±SD）的形式表示。

1.2.6 順式作用元件分析

使用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對啟動子CaMV35S和P/aSC/6的順式作用元件進行分析。使用TBtools軟件繪制啟動子元件圖。

1.3 數據處理與分析

采用SPSS軟件進行顯著性分析。柱狀圖使用Origin 2021軟件繪制。

2 結果與分析

2.1 日本落葉松胚性愈傷組織中GUS的瞬時表達

使用載體35S：：GUS，以OD600=0.1的侵染液侵染10 min，共培養48 h為條件進行瞬時轉化。半定量RT-PCR結果顯示，在轉化的材料中可以檢測到GUS的擴增片段，而在未轉化的材料中未檢測到（圖1A）。qRT-PCR分析也進一步驗證了半定量RT-PCR的結果（圖1B）。這兩個結果表明，以OD 600=0.1的侵染液侵染10 min，共培養48 h為瞬時轉化條件，載體35S：：GUS可以導入日本落葉松胚性愈傷組織的細胞中，且CaMV35S啟動子可以驅動GUS的表達。

2.2 侵染液濃度、侵染時間及共培養時間對GUS表達量和酶活性的影響

侵染液濃度、侵染時間和共培養時間分別設計了3個梯度，使用載體35S：：GUS進行瞬時轉化。qRT-PCR結果顯示，GUS在不同的條件下均能表達，但表達量差別明顯（表1）。當侵染液OD600=0.2，侵染5 min，共培養72 h時，GUS的表達量最高，ACT值為-2.274 2：當侵染液OD600=0.05，侵染1 min，共培養24 h時，GUS的表達量最低，ACT值為-11.630 0。GUS酶活性在所有材料中均能被檢測到，但在不同的條件下，其大小不同（表1）。當侵染液OD600=0.05，侵染5 min，共培養72 h時，GUS酶活性最高，為25.728 6 U·L_1；當侵染液OD600=0.2，侵染5 min，共培養48 h時，GUS酶活性最低，為12.045 3 U·L-1。GUS表達量較高的5個材料是處理4、10、15、24和27，而酶活性較高的5個材料是處理3、4、5、6和17。這些結果表明，處理4中，即以侵染液OD600=0.05，侵染5 min，共培養24 h為轉化條件時，GUS的表達量和酶活性都比較高。

2.3 CaMV35S和PLaSCL6啟動子活性分析

分別使用載體35S：：GUS和重組質粒PLaSCL6：：GUS，以OD600=0.05的侵染液侵染5min，共培養24 h為條件進行瞬時轉化。半定量RT-PCR結果表明，兩種轉化材料中都可以檢測到GUS的擴增片段，但轉PLaSCL6：：GUS的材料中電泳條帶相對較亮（圖2A）。qRT-PCR結果進一步表明，轉PLaSCL6：：GUS的材料中GUS表達量是轉35S：：GUS的1.55倍（P＜0.01）（圖2B）。

2.4 CaMV35S和PLaSCL6啟動子元件分析

根據預測結果，P/aSCL6上調控元件的數量和種類均要明顯多于CaMV35S。P/aSCL6具有132個調控元件，而CaMV35S僅有28個調控元件（圖3A）。PLaSCL6上TATA-box有45個，而CaMV35S上僅有3個。此外，PLaSCL6中包含19種順式作用元件，而CaMV35S上有11種，它們共有的調控元件有7種，分別是激素響應元件（ABRE、TGA-box、）、光響應元件（G-box）、參與MejA反應的元件（CGTCA-motif、TGACG-motif）、-30附近的核心啟動子元件（TATA-box）和常見的順式作用元件（CAAT-box）（圖3B）。此外，PLaSCL6上還包含多種其它順式作用元件，如激素響應元件（GARE-motif、P-box、CGTCA-motif、TGACG-motif）、光響應元件（AE-box、Box 4、Box Ⅱ、G-Box、I-box）、厭氧誘導必須的調控元件ARE、干旱誘導相關元件MBS和參與防御和應激反應的調控元件TC-rich-repeats等。

3 討論

植物的遺傳轉化受到多種因素的影響，要建立一個高效的瞬時轉化體系，需對影響遺傳轉化的多種因素進行全面的探索與優化。彭綠春等認為菌液濃度對云南杜鵑（Rhododendron yunnanenseFranch.）愈傷組織中GUS的瞬時表達有顯著影響。侵染時間、共培養時間也是影響轉化效率的重要因素，因為侵染時間過長容易導致外植體死亡，而侵染時間過短則受體材料上不能夠附著足夠的菌液，共培養時間的長短又直接影響著目的基因的整合和轉化。本研究以日本落葉松胚性愈傷組織為受體材料，探討了農桿菌介導的瞬時轉化體系中侵染液濃度、侵染時間和共培養時間對轉化效率的影響。從GUS的表達量和酶活性來看，不同組合處理后轉化效率差別較大。綜合分析后，發現以侵染液濃度OD600為0.05，侵染5 min，共培養24 h為轉化條件時，GUS的表達量和酶活性都比較高。研究結果也再次表明掌握好侵染液濃度、侵染時間和共培養時間有助于提高瞬時轉化效率。另外，上述條件不僅可以用來進行日本落葉松胚性愈傷組織的瞬時轉化，也為其它針葉樹瞬時轉化體系的建立和優化提供參考。

啟動子是調控基因表達的重要元件，它的調控作用是由多層次、多因素共同作用的結果。對啟動子結構、功能和作用機制的研究不僅有利于了解基因調控模式和信號傳遞途徑，而且對于了解植物的生長發育機制和對外界環境的響應具有重要意義。由于對日本落葉松基因的啟動子研究不夠深入，導致其在應用中具有不確定性。有些外源啟動子在轉基因植物中不一定能夠誘導目的基因高效表達。例如，外源性啟動子hsr203J在柑橘（Citrussinensis Osbeck）中并未被激活。落葉松P LkF3H2啟動子的活性在本生煙草（Nicotianabenthamiana Domin）中略弱于CaMV35S啟動子，并且隨著PLkF3H2啟動子長度的縮短，其活性降低。因此，在未來日本落葉松啟動子的克隆及應用研究仍然是重中之重。上述轉化條件在啟動子活性檢測上的成功應用證明了該轉化體系的高效性和穩定性。在此基礎上發現CaMV35S活性低于PLaSCL6，這可能與PLaSCL6是落葉松內源啟動子有關，也可能與P/aSCL6較CaMV35S具有更多的順式作用元件有關（圖3）。這一結果不僅驗證了上述轉化體系的有效性，也為日本落葉松遺傳轉化提供了一個候選啟動子。

4 結論

本研究分析了日本落葉松胚性愈傷組織瞬時轉化過程中侵染液濃度、侵染時間及共培養時間對轉化效率的影響。結果表明，當OD600=0.2的侵染液侵染5 min，共培養72 h時，GUS的表達量最高，ACT值為-2.2742；當OD600=0.05的侵染液侵染5 min，共培養72 h時，GUS酶活性最高，為25.7286 U·L-1。綜合考慮GUS的表達量和酶活性，當OD600=0.05的侵染液侵染5 min，共培養24 h時轉化效率較高，這一條件可以用來進行日本落葉松胚性愈傷組織的高效轉化。研究結果優化了日本落葉松瞬時遺傳轉化體系，不僅為日本落葉松的基因功能研究提供了技術支持，也為其它針葉樹遺傳轉化體系的建立和完善提供了參考。

（責任編輯：張研）

基金項目：國家自然科學基金面上項目“落葉松miR171-LaSC/6調控體胚發生的分子機理”（32271904）。