孑遺植物水松不同季節根際微生物群落結構和功能特征

摘要：[目的]探索水松根際微生物群落結構和功能及隨季節變化的規律。[方法]采用PCR-DGGE和Biolog-ECO微平板法測定不同季節水松根際土壤理化性質、微生物群落結構和功能，通過主成分分析和冗余分析等方法解析根際微生態各環境因子的內在規律。[結果]水松根際微生物群落中優勢細菌為α-變形菌（Alphapro-teobacteria）、酸桿菌（Acidobacteria）和δ-變形菌（Deltaproteobacteria），優勢真菌為糞殼菌（Sordario-mycetes）。夏季水松根際微生物量和微生物多樣性最高。根際微生物的碳代謝能力在夏季最強，冬季最弱，大致表現為夏季gt;秋季gt;春季gt;冬季，速效氮可能是微生物群落碳代謝功能的主要驅動因子。[結論]水松根際微生物群落多樣性和碳代謝能力在夏季最優，在冬季最差。季節因素顯著影響著根際微生物群落結構和功能，開展相關研究時應充分考慮季節因素造成的波動。

關鍵詞：水松；根際微生物；季節動態；PCR-DGGE; Biolog-ECO

中圖分類號：Q145+．2 文獻標識碼：A 文章編號：1001-1498（2024）03-0118-11

孑遺植物水松（Glyptostrobus pensilis（Staunton ex D．Don）K．Koch）又名水帝松、水杉松、水樅等，是杉科水松屬中的唯一物種；水松因其古老而珍貴的基因被譽為植物界的活化石，具有極高的科研價值。水松曾是北半球的重要物種，廣泛分布于北半球，但第四紀冰期以來，其種群迅速衰弱，正面臨滅絕風險，目前已被列為國家一級瀕危保護植物，被國際自然資源保護聯盟（IUCN）列為極危種。水松相關研究在質量和數量上遠落后于其他杉科喬木，為數不多的研究集中在種群生態學和遺傳生態學等領域，至今仍未見根際微生物群落的報道。

根際土壤是指植物根系周圍數毫米范圍內受根系活動強烈影響的土壤，是根系-土壤-微生物互作的主要區域。雖然前人對植物根際開展過大量研究，但它仍是一個蘊藏著龐大未知信息的“黑匣子”。根際微生物是根際土壤中最活躍的部分，是土壤中有機質轉化和養分元素循環的引擎，是物質循環和能量流動的主要驅動因素。近年來，因根際微生物的重要性逐漸受到學界廣泛重視，有學者將根際微生物稱為“植物的第二基因組”，認為應該將植物和根際微生物視作一個宏生物體來研究。與腸道菌群類似，植物根際微生物群落也由數量龐大，種類繁多，功能各異的微生物組成，它們參與并影響著植物的養分吸收和抗逆性調節過程，在植物生命的全過程都扮演重要角色，發揮關鍵作用。植物能通過定向招募具有特定功能的微生物組以增強其特定功能，例如招募特基拉芽孢桿菌、叢植菌根真菌能夠促進植物生長、提高植物的抗旱性及養分吸收能力。根際微生物群落災變則會引起一系列病害，導致植物生產力下降甚至死亡。因此根際微生物群落健康和多樣性對土壤生態系統服務的功能和穩定性至關重要，是土壤肥力和健康評價的重要指標。

土壤微生物群落的研究方法眾多，傳統平板培養法只能對0.1%～10%的土壤微生物進行研究，具有較大局限性。隨著分子生態學技術的發展，PCR-DGGE和Biolog-ECO微平板等能夠忽略微生物培養限制的研究技術逐漸取代了傳統方法，并被廣泛應用于生態學研究。變性梯度凝膠電泳（Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）以甲酰胺和尿素為變性劑，將不同長度和堿基序列的DNA片段分離，染色處理后能夠獲取微生物群落結構信息，具有操作簡便、檢測閾值低、重復性高和結果準確可靠等優點。Srivastava等利用DGGE技術揭示了印度稻田土壤微生物群落的優勢菌群及其與土壤理化性質間的相關性規律。Biolog Eco微平板法通過量化微生物群落對31種碳源代謝能力獲取其特定的“代謝指紋”，能夠表征微生物群落的碳代謝特征，具有操作簡便，靈敏度高等優點。Feigl等利用Biolog-ECO微平板監測赤泥添加對土壤微生物群落碳代謝特征的影響，確定了合適赤泥添加比例。

基于此，本研究以不同季節水松為研究對象，從根際-土壤-微生物角度切入，采用PCR-DGGE和Biolog-ECO微平板等技術對水松根際微生物群落特征及其季節動態變化規律開展研究，揭示不同季節水松根際微生物群落結構和碳代謝功能特征，尋找根際微生態中驅動根際微生物群落變化的關鍵環境因子，為水松進一步的研究提供有益理論參考。

1 材料和方法

1.1 研究地概況

本試驗采樣地點位于福建省寧德市屏南縣上樓村（26°58＇N，118°57＇E），閩東北鷲峰山脈中段，東峰尖北麓的一片沼澤地中，該林是世界上林地面積最大、種群數量最多的天然水松林。林中生長著72株水松，胸徑多在40～70 cm之間，樹高多為15～20 m，平均樹齡約為418歲。該區域屬亞熱帶季風氣候，年平均氣溫為15℃，年積溫5 214.2℃，年平均降水量約為1 800 mm，氣候溫暖濕潤，雨水充沛，四季分明，冬無嚴寒，夏無酷暑。水松林位于山谷地帶，林下土壤細膩肥沃，植被物種豐富，伴生植物有柳杉（Cryptomeriafortunei Hooibrenk ex Otto et Dietr．）、馬尾松（Pinus massoniana Lamb.）等。

1.2 樣品采集

參考吳則焰的調查結果，選擇5株具有代表性的（長勢良好，胸徑20～60 cm之間）水松為研究對象，表征林中72棵水松。分別于2021年12月25日（冬季）、2022年3月16日（春季）、2022年6月12日（夏季）和2022年9月30日（秋季）采集土壤樣品。用鏟子去除土壤表面的腐質層，挖取0～20 cm深度的水松根系，輕輕抖落表面土壤，收集附著在根系上的土壤為根際土壤，于室內風干至可過篩狀態，除去殘留的根系和小石子，置于4℃冰箱保存，用于后續試驗測定。

1.3 土壤理化性質測定

含水量采用烘箱烘干法測定；pH采用電位法（水土比為2.5：1）測定；速效氮（AN）采用堿擴散法測定；速效磷（AP）采用NaHCO3法測定；速效鉀（AK）采用醋酸銨-火焰光度法測定；土壤以HC104-H2S04法處理后，全氮（TN）和全磷（TP）采用全自動間斷化學分析儀測定，全鉀（TK）采用火焰光度法測定。具體步驟參照鮑士旦的方法。

1.4 土壤酶活性測定

纖維素酶和蔗糖酶采用3，5-二硝基水楊酸比色法測定；脲酶采用苯顯色法測定；酸性磷酸酶采用對硝基苯磷酸二鈉比色法測定；過氧化氫酶采用高錳酸鉀滴定法測定。具體步驟參照關松蔭的方法。

1.5 微生物量測定

微生物量碳、氮含量的測定采用氯仿熏蒸法。具體步驟參照吳金水的方法。

1.6 微生物群落結構測定

使用土壤DNA提取試劑盒（OMEGA，美國）提取土壤DNA。PCR反應體系均為50 μL：1.25 μL 100 mol·L-1上下游引物，25 μL 2×HieffRobust PCR MasterMix．10ng DNA模板，ddH2O補齊至50μL。細菌第一輪PCR引物為27F和1 492R，PCR擴增程序：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸1min，循環35次；72℃終延伸5 min。第二輪PCR引物為GC-357F（5'-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGG GCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和518R（5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’），PCR擴增程序：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，48℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環35次；72℃終延伸5 min。真菌PCR引物為GC-Fung（5’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCATTCCCCGTTACCCGTTG-3’）和NS1（5’．GTAGTCA TATGCTTGTCTC-3’），PCR擴增程序：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環35次；72℃終延伸10 min。使用膠回收試劑盒（OMEGA，美國）回收目的基因。細菌凝膠的變性梯度為45%～60%，丙烯酰胺凝膠強度為8%，在80 V，60℃條件下電泳12 h。染色采用銀染法：①加入固定液（10%乙醇，0.5%冰醋酸），100 r·min-1振蕩15 min，用雙蒸水清洗；②加入染色液（AgNO3 0.2%，甲醛0.1%），避光條件下100 r·min-1振蕩15 min，用雙蒸水清洗；③加入顯色液（NaOH 1.5%，甲醛0.1%），100 r·min-l振蕩15 min，用雙蒸水清洗。使用凝膠成像儀（BIO-RAD，美國）掃描凝膠圖片。使用軟件Quantity One將圖片信息轉化為數字信息。條帶DNA轉入Trans-T1 Phage Resistant化學感受態細胞后送公司（生工，上海，中國）測序，使用NCBI數據庫比對測序結果。

1.7 微生物碳代謝功能測定

稱取10 9（精確至0.001 9）土壤加入至50mL 0.85% NaCl溶液中，搖床中30℃，200r·min-1振蕩30 min。冰浴靜置5 min。吸取5mL上層浸提液，加入至45 mL 0.85% NaCl溶液中，重復稀釋制得1：1000提取液。向Biolog-ECO微平板的各孔中加入150 μL 1：1 000土壤浸提液。30℃避光培養168 h，每隔24 h使用酶標儀讀取各孔在590 nm處的吸光值用于數據分析。

1.8 數據分析

在軟件SPSS 19中采用Duncan （D）法進行單因素方差分析以檢驗樣本顯著性差異。使用ORIGIN 2021 pro繪制柱狀圖；使用軟件STAMPv2.1.3分別以微生物類群相對豐度和31種碳源在168 h處的吸光值為數據進行主成分分析；使用軟件TBtools以微生物類群相對豐度為數據進行熱圖分析；使用軟件Canoco 5以微生物類群相對豐度和土壤理化性質為數據進行冗余分析。

2 結果

2.1 水松根際土壤微生物量與酶活性季節變化

微生物量碳、氮測定結果（圖1）顯示，不同季節水松根際土壤微生物量碳和微生物量氮含量表現為夏季gt;秋季gt;春季gt;冬季，不同季節間差異顯著，說明水松根際的微生物數量在夏季最高，在冬季最低。水松根際土壤纖維素酶和蔗糖酶在夏季最高，在冬季最低，說明夏季根際微生物的有機質代謝能力最強土壤有機質的降解速率在夏季最高。脲酶和酸性磷酸酶活性在春季最高，說明土壤中含氮、磷化合物的礦化速率在春季最高。過氧化氫酶活性在秋季最高，說明根際土壤的抗氧化能力和抗逆性在秋季最強（圖2）。

2.2 水松根際微生物群落結構及其季節變化

PCR產物的檢測結果（圖3A～D）顯示，條帶明亮清晰且長度與預期相符，說明擴增成功。從水松根際微生物的PCR-DGGE圖譜（圖3E、F）中各選取45和9個條帶，由上至下進行編號，依次分別為X-1至X-45和Z-1至2-9。主成分分析結果（圖4A、B）顯示，不同季節水松根際的細菌和真菌群落差異均顯著。從水松根際土壤中共鑒定到35種細菌和5種真菌，在綱水平上可將其細歸為1 1個微生物類群，分別為酸桿菌（Acidobacteria），α-變形菌（Alphaproteobacteria）、β-變形菌（Betaproteobacteria）、δ-變形菌（Deltaproteobacteria）、厚壁菌（Firmicutes）、γ-變形菌（Gammaproteobacteria）、纖線桿菌（Ktedonobacteria）、硝化螺旋菌（Nitrospirae）、Oligoflexi、Saccharibacteria和其他類群。細菌群落中的優勢類群為α-變形菌（Alphaproteobacteria）、酸桿菌（Acidobacteria）和δ-變形菌（Deltaproteobacteria）（表1）；將真菌歸為4個微生物類群，分別為座囊菌（Dothideomycetes）、錘舌菌（Leotiomycetes）、糞殼菌（Sordariomycetes）和銀耳菌（Tremellomycetes），其中真菌群落中的優勢類群為糞殼菌（Sordariomycetes）（表1）。聚類分析結果（圖4C、D）顯示，夏季與秋季的根際細菌群落較為接近，春季與冬季的根際細菌群落較為接近。春季與冬季的真菌群落較為接近，秋季與其他季節的真菌群落差異最大。

2.3 水松根際微生物群落碳代謝特征及其季節變化

Biolog-ECO微平板實驗結果（圖5）顯示，AWCD值（Average well color development）均在夏季最高，在冬季最低，說明夏季水松根際微生物群落的碳代謝能力最強，冬季最弱。依據化合物的基團特性將Biolog-ECO板中的31種碳源分為6大類，分別為多聚合物類、羧酸類、糖類、酚酸類、氨基酸類和胺類，結果（圖5B）顯示微生物群落代謝氨基酸類碳源的能力最強，其余依次為胺類、羧酸類、糖類、多聚合物類和酚酸類碳源。水松根際微生物群落代謝羧酸類、氨基酸類、酚酸類、多聚合物類和糖類的能力在夏季最強，在冬季最弱，代謝胺類碳源的能力在秋季最強，冬季最弱。微生物多樣性指數分析結果（表2）顯示，Shannon指數、Brillouin指數和均勻度指數均在夏季出現最高值，說明夏季水松根際微生物的群落多樣性最高。主成分分析結果（圖5C）中，不同季節的樣本點間距顯著大于相同季節，說明不同季節水松根際微生物群落碳代謝特征差異顯著。微生物群落碳代謝特征和土壤理化性質（表3）的冗余分析結果（圖5D）顯示，速效氮含量與根際微生物群落的碳代謝特征的相關性最強，其余依次為速效鉀、速效磷、全氮、全鉀、全磷、pH和含水量。

3 討論

3.1 水松根際土壤微生物量和酶活性

微生物量碳、氮指構成微生物的碳、氮元素，能夠反映土壤中的微生物量，也是土壤各生態轉化過程中的關鍵驅動因子。微生物量碳、氮對土壤環境變化的響應十分靈敏，被認為是評價土壤質量的良好指標。植物與微生物經過漫長的歷史演化，逐漸進化出了一套互利共生的合作模式，植物通過分泌物為微生物提供有機養分，而微生物通過降解有機化合物為植物提供無機養分，這種機制提高了植物與微生物的環境適應性，因此生物量的高低能夠表征植物和土壤健康狀況。本研究中，水松根際微生物量在冬季最低，在夏季達到了最高值，說明水松根際活動在夏季最為活躍，根際土壤質量在夏季最優。其原因可能是夏季水松生長旺盛，對無機養分的需求相比冬季大大提高，因此增加了根系分泌物的分泌量，同時林地中茂盛生長植被也向土壤中輸入了大量有機物，這些碳源的輸入極大地豐富了土壤微生物量。這與Lepcha等的研究結果相符。酶是土壤養分循環的重要驅動力，是土壤健康評價體系的重要指標之一，微生物是其重要來源之一。水松根際土壤纖維素酶和蔗糖酶活性在夏季最高，即有機養分的分解速率在夏季達到最高。本研究中的微生物量、酶活性和養分含量的季節變化規律相吻合，推測在夏季，水松通過影響土壤碳源的輸入來調控根際微生物量和相關酶活性，進而改變有機質礦化速率和養分積累，提高土壤質量，使根際微生態系統生態功能與水松生長周期相協調。

3.2 水松根際微生物群落結構特征

群落結構是微生物群落主要生物學特征之一。PCR-DGGE技術能夠突破絕大多數微生物不可培養的限制，直接對土壤中的基因組進行分析，解析土壤微生物群落結構，獲得微生物優勢類群等重要的信息。大量研究表明，土壤的生態學功能與微生物群落結構息息相關。微生物群落結構變化通過影響土壤養分礦化速率、土壤抑病性和植物促生能力等途徑調控土壤微生態的生態學功能。因此微生物群落結構的解析對于加深植物理解至關重要。本研究結果顯示，不同季節下水松根際微生物群落結構差異較大，但其中的優勢類群較為穩定，細菌優勢類群均為α-變形菌（Alphaproteobacteria）、酸桿菌（Acidobacteria）和δ-變形菌（Deltaproteobacteria），真菌優勢類群均為糞殼菌（Sordariomycetes）。不同季節間水松根際微生物群落結構差異顯著，說明季節因素對水松微生物群落造成了顯著影響，季節因素可能通過改變根際微生物群落從而影響水松的生長發育。Marschner等在其他植物研究中得到了類似結果。

3.3 水松根際微生物群落碳代謝特征

微生物群落的碳代謝特征能夠表征土壤有機質的降解能力和微生物多樣性，是微生物群落關鍵特征之一。本研究結果顯示，水松根際微生物群落的碳代謝能力在夏季最強，在冬季最弱，這閆法軍等的研究結果類似。值得注意的是，水松根際微生物群落對氨基酸類碳源的代謝能力最強，說明水松根際微生物對氨基酸類碳源具有很強的偏好性，而氨基酸類物質是植物向土壤中分泌的大量低分子化合物之一，因此這種偏好性可能是水松對根際微生物群落定向調控結果，這體現出了水松植株與根際微生物之間的高度協調。宋賢沖等也得到了類似研究結果。微生物多樣性與群落的代謝能力息息相關，微生物多樣性指數顯示，春季和夏季的水松根際微生物群落多樣性優于秋季和春季。水松根際微生物群里碳代謝特征的主成分分析結果表明，季節因素對水松根際微生物群落碳代謝特征存在顯著影響。冗余分析結果顯示，速效氮含量對水松根際微生物碳代謝特征影響最大，即速效氮含量是微生物碳代謝特征變化的主要驅動因子。

4 結論

水松根際微生物群落多樣性和碳代謝能力在夏季最優，在冬季最差，季節因素顯著影響著根際微生物群落結構和功能。因此在開展水松根際微生態相關研究時應充分考慮到季節因素造成的波動，以增強研究結果的代表性。本研究首次揭示了不同季節水松根際微生物群落結構和碳代謝特征，填補了水松在根際微生態領域研究的空白，為水松在根際微生態領域的進一步研究提供了有益理論依據。

（責任編輯：張研）

基金項目：國家自然科學基金（31500443）；福建省自然科學基金（2022J01139）；福建省財政林業科技研究項目（2023FKJ26）；福建農林大學科技創新專項（KFb22046XA、KJb22019XA）；福建農林大學生態學一流學科建設項目資助。