文冠果種子發育基因表達分析內參基因的選擇

摘要：[目的]驗證ACT基因是否適用于文冠果種子發育的相關基因表達分析，并篩選出在文冠果基因表達分析中最穩定的內參基因。[方法]本研究采用了4種數學算法（△CT、BestKeeper、NormFinder、geNorm）評估12個候選內參基因的表達穩定性，并利用在線工具RefFinder綜合評價。[結果]在文冠果不同發育時期種子內參基因綜合評分排名為PP2Agt; Tip41gt; EF-1agt; 18rgt; UCEgt;β-TUBgt; UBQgt;α-TUBgt; CYPgt; SAMgt;ACTgt; GADPH；在文冠果不同組織內參基因綜合評分排名為PP2Agt; Tip41gt;CYPgt; 18rgt; UBQgt; SAMgt; EF-1αgt; UCEgt; GADPHgt; α-TUBgt; ACTgt;β-TUB。[結論]PP2A和Tip47基因是文冠果基因表達分析最穩定的內參基因。

關鍵詞：文冠果；內參基因；基因表達；種子發育

中圖分類號：S727.32 文獻標識碼：A 文章編號：1001-1498（2024）03-0079-07

文冠果（Xanthoceras sorbifolium Bunge），又名黃角（Yellow horn），落葉灌木或小喬木，是無患子科文冠果屬的唯一植物，廣泛種植于我國三北地區，抗性強，尤其抗旱，是我國特有的觀賞、藥用及油用的高收入木本經濟樹種。文冠果種子富含油脂，種仁含油率達60%以上，不飽和脂肪酸組成高達92%，富含油酸（約30%）、亞油酸（約45%）以及在植物中極為罕見的神經酸（約3%），是生產高品質生物柴油和健康食用油的原料，具有優秀的經濟價值。由此可見，研究文冠果種子不飽和脂肪酸的合成機制，對培育優質高產的文冠果品種具有現實意義。截止至今，已有文冠果種子發育轉錄組的文獻分析出一些重要的不飽和脂肪酸合成相關候選關鍵基因，探究這些基因在文冠果各組織，尤其不同發育時期種子中的表達模式，尤為關鍵。

實時熒光定量PCR（qRT-PCR）是大多數科學家常用的檢測基因表達豐度的可靠技術，具有高靈敏性、特異性、精確性，而一個可靠的內參基因（RGs）是前提。內參基因一般選擇在植物中穩定表達的管家基因，常見的管家基因有actin（ACT）、糖醛酸-3-磷酸脫氫酶基因（GADPH）、延長因子1a（EF-1a）、泛素酶基因（UBQ）、泛素結合酶基因（UCE）以及18S核糖體RNA（18S），然而這些基因的表達在不同物種的不同組織和其不同發育時期中的穩定性有較大差異，需要深入研究。

大量關于文冠果基因表達的研究均采用actin作為內參基因，王旭等通過對7個內參基因穩定性研究，發現UBQ和elF-4a為適用于性別分別相關基因的最優內參基因。然而，近年來神經酸的營養價值和藥用價值被逐漸挖掘，其種子油脂合成與代謝相關基因的研究亟待深入，需要進一步研究文冠果種子不同發育時期的最適內參基因需要被進一步研究，以便提高其油脂合成與代謝相關基因表達檢測的準確性。基于此，本研究首先以SapBase數據庫中文冠果各組織轉錄組數據（http：//www.sapindaceae.com/）中常見內參基因的基因表達量數據作為依據，挑選12個在各組織表達量較穩定的候選內參基因；采用qRT-PCR法測試這12個候選內參基因在文冠果種子不同發育時期和不同組織中的表達水平C。值；利用4種常見的評估內參基因的表達穩定性的數學算法評價這12個候選內參基因在文冠果不同組織和種子發育不同時期中的穩定性，隨即利用在線工具RefFinder對這12個候選內參基因進行綜合排名選出最佳內參基因。最后，以超長鏈脂肪酸合成關鍵酶3-酮酯酰-CoA合酶（KCS）基因驗證選擇的最佳內參基因的穩定性，本研究旨在選擇穩定、可靠的文冠果內參基因。

1 材料與方法

1.1 植物材料

文冠果成熟實生苗（五年生以上）生長于內蒙古通遼市開魯縣（43°32＇N，120°30＇E），林間正常管理。文冠果根、莖、葉、花采集于5月10日，種皮采集于6月7日，不同發育時期種子胚乳分別采集于6月18日（謝花后第30 d，30DAP），6月26日（38 DAP），7月3日（45DAP），7月11日（53 DAP），7月21日（63DAP），采集年份均為2022年，5個不同發育時期種子胚乳形態特征見圖1。每種文冠果組織采集生物學重復樣品3份。

1.2 RNA提取和cDNA鏈合成

文冠果各植物組織的提取方法參照多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（天根，中國）說明書，經過降解酶RQ1 RNase-Free DNase（Promega，美國）降解殘留的基因組DNA后，以1Ug RNA為模板，利用GoScriptTM Reverse TranscriptionSystem（Promega，美國）試劑盒反轉錄得到cDNA，稀釋10倍后凍于-20℃待用

1.3 候選內參基因選擇和熒光定量引物設計

參照SapBase數據庫（http：//www.sapinda-ceae.com/）中文冠果各組織轉錄組數據（SRA編號：SRP304628），選擇在各組織表達量較穩定的12個內參基因作為候選，同時以超長鏈脂肪酸合成關鍵酶3-酮酯酰-CoA合酶（KCS）基因作為驗證基因，基因編號均來源于SapBase數據庫。熒光定量PCR（qRT-PCR）引物由軟件Primer Premier 5.0設計，引物信息列于表1。擴增序列均測序檢驗其正確性。

1.4 熒光定量PCR程序和數據分析

qRT-PCR由ABI StepOne7000（美國）實時熒光定量PCR儀完成，反應體系為30.0 pL，包括SYBRqPCRSuperMix15.0μL，上游引物（10.0pmoI·L-1）1.0 μL，下游引物（10.0μmoL·L-1）1.0μL，ROX 0.5 μL，ddH2O 12.5 μL。反應采用三步法，反應程序為：95℃ 2 min，1個循環；95℃ 10s，60℃ 20 s．72℃ 20 s，40個循環；72℃ 20 s，1個循環。熔解曲線在65～95℃間獲得以驗證引物的特異性。引物的擴增效率和線性相關系數由cDNA按5個稀釋倍數（1、10-1、10-2、10-3、10-4）建立標準曲線計算得到。

4種常見的評估內參基因的表達穩定性的數學算法ΔCT、Best-Keeper、geNorm及NormFinder用于評價12個候選內參基因在文冠果種子不同發育時期和不同組織的穩定性。最后利用在線工具RefFinder（http：//150.216.56.64/referencegene）綜合排名。

2 結果與分析

2.1 擴增效率和引物特異性分析

所有樣品RNA均利用Agilent 2100 Bioanalyzer生物分析儀測試RNA濃度和完整性，樣本RNA濃度分布于128.5～433.9 ng·μL-1，RIN值均大于7.0，瓊脂糖電泳檢測均顯示有明顯的28S和18S條帶，RNA質量達到后續實驗要求。12個候選內參基因的基因名稱、SapBase編號、引物序列、擴增長度、擴增效率、相關系數及Cq平均值均列于表1。擴增片段長度在107 bp（GADPH）～256 bp（UCE），擴增效率在98.23%（GADPH）～101.35%（β-TUB）。12個候選內參基因熔解曲線均為單一峰（圖2），表明無引物二聚體和非特異性擴增發生。

2.2 候選內參基因表達譜

qRT-PCR法得到12個候選內參基因在文冠果不同組織和不同種子發育時期中的表達水平Cq值，Cq值越小，基因表達量越高。這些內參基因C。值在文冠果各個組織有較大差異。這所有檢測的組織中，PP2A平均C。值最高27.39，分布于25.47～28.69；ACT平均Cq值最低21.51，分布18.69～23.65（表1，圖3）。這12個候選內參基因的變異系數分別為7.18% （ACT）、3.01%（UBQ）、4.54%（UCE）、3.24%（18r）、6.64%（GADPH）、4.56%（EF-1α）、8.84%（β-TUB）、10.68% （α-TUB）、4.13% （PP2A）、3.87% （Tip41）、9.60%（SAM）、3.11%（CYP）。

2.3 候選內參基因穩定性評價

常見的內參基因穩定性算法有ACT、BestKeeper、NormFinder以及GeNorm。這4種算法中，ACT法是根據Cq值的標準差數值來評價，標準差數值越低的內參基因，穩定性越強；BestKeeper算法是根據Cq值的變異系數和標準差數值聯合評價，變異系數和標準差數值越低，內參基因的穩定性越強；NormFinder和GeNorm算法均根據平均表達穩定指數計算，表達穩定指數與內參基因的穩定性呈負相關。

上述4種內參基因穩定性算法用于評價12個候選內參基因在文冠果種子不同發育時期和不同組織中的穩定性。如表2所示，根據AC-r和BestKeeper算法分析，PP2A和Tip41在文冠果種子不同發育時期和不同組織中穩定性均為最優，NormFinder和GeNorm算法分析的最優結果與△CT和BestKeeper算法不同，但PP2A和Tip41均在排名前四的行列。在文冠果種子不同發育時期中，所有算法均顯示ACT和GADPH為最不穩定的內參基因；在不同組織中，所有算法均顯示ACT和β-TUB為最不穩定的內參基因。

在線工具RefFinder根據4種數學算法的排名綜合評價這12個候選內參的穩定性。結果如表2所示，在文冠果不同發育時期種子內參基因綜合評分排名為PP2Agt;Tip41gt; EF-1agt; 18rgt; UCEgt;β-TUBgt; UBQgt; α-TUBgt; CYPgt; SAMgt; ACTgt;GADPH;在文冠果不同組織內參基因綜合評分排名為PP2Agt;Tip41gt;CYPgt; 18rgt; UBQgt; SAMgt;EF-1αgt; UCEgt; GADPHgt; α-TUBgt; ACTgt;β-TUB。PP2A和Tip41在文冠果不同發育時期種子和不同組織中的排名均為最高，表明為最合適的內參基因。

2.4 驗證挑選的內參基因

為了評估上述選擇的最優內參基因的穩定性，本研究以選擇的最優內參基因PP2A和Tip41及文獻中最常用的ACT作為后續驗證實驗的內參基因，利用qRT-PCR法計算種子高表達目標基因KCS在文冠果種子不同發育時期和不同組織中的表達水平。結果如圖4所示，以PP2A和Tip41作為內參基因達到大致相同的KCS表達模式（圖4A、B）。KCS主要在種子發育期38～53 DAP高表達。在除了種子外的其他組織中，在種皮中幾乎不表達，不參與計算，在花中高表達，然而，當采用ACT作為內參基因時，其表達模式有所不同（圖4C）。在以PP2A和Tip41作為內參基因時，KCS基因在種子發育30 DAP的表達最低，作為標準值“1”，在莖的表達量高于葉片；而以ACT作為內參基因在根中的表達量最低，且在葉片中的表達量高于莖。在不同發育時期種子中，KCS基因以PP2A和Tip41作為內參基因計算時，種子發育63 DAP的表達量高于30 DAP，而以ACT作為內參基因時相反。上述結果表明，以不同穩定性的內參基因計算得到的組織特異性表達分析結果有所不同。由此可見，選擇可靠穩定的內參基因對qRT-PCR實驗的準確度非常重要。

3 討論

實時熒光定量（qRT-PCR）技術因其具有高靈敏性、特異性、精確性等特點，是分析基因表達水平和核酸含量的應用最為廣泛的技術之一。不同物種之間沒有固定的內參基因，例如常用的內參基因ACT、GADPH、UBQ等在不同植物物種的不同組織的不同發育時期可表現出表達差異。由此可見，為特定植物的特定組織發育的qRT-PCR實驗選擇可靠的內參基因極為必要。

文冠果油是在植物種油中極為罕見的含有神經酸的木本油料來源，大量文獻均以內參基因ACT作為文冠果基因表達分析的唯一內參基因，其穩定性是否適宜文冠果種子發育中相關基因的表達分析未有確定。本研究選擇了12個常見且表達較為穩定的候選內參基因，利用4種數學算法（ΔC-r、BestKeeper、NormFinder、geNorm）評估它們在文冠果種子發育過程中和不同組織中的穩定性，同時采用網絡在線工具RefFinder綜合這4種算法的結果并排名。

PP2A和Tip41在文冠果不同發育時期種子和不同組織中的排名均為最高，為本研究的最適內參基因，而UBQ和Tip41是油用牡丹（PaeoniaostiiT．Hong et J．X．Zhang）種子發育過程中的最適內參基因，PP2A排名中游；UBCE2是草果（Amomum tsaoko Crevost et Lemarie）種子發育的最適內參基因；UCE、RPS13和RPII是美藤果（Plukenetia volubilisL．）種子發育最適內參基因。以上結果表明不同物種不同發育組織最適內參基因大部分均不相同，值得研究。最為關鍵的是本研究結論中的最適內參基因與前期大部分研究報道所使用的并不一致，前期大量研究均采用ACT基因作為文冠果基因表達分析的內參基因，而本研究結果表明ACT基因在文冠果種子不同發育時期和不同組織中內參穩定性排名較差，并不適合用于基因表達的研究，同時王旭等研究也表明ACT基因不是研究文冠果性別分化和不同組織的最適內參基因，且排名同樣靠后。據此，本研究最重要的意義是更正用于文冠果基因表達分析的內參基因，以期獲得更準確的基因表達數據。

4 結論

本研究通過4種數學算法（ACT、BestKeeper、NormFinder、geNorm）對文冠果12個候選內參基因穩定性和有效性的評估，發現PP2A和Tip41基因在文冠果種子不同發育時期和不同組織中穩定表達，是文冠果基因表達分析最穩定的內參基因。本研究為文冠果qRT-PCR數據標準化提供了有效依據。

（責任編輯：張研）

基金項目：國家自然科學基金（31870594）和西北農林科技大學高層次人才科研經費