楊樹響應腐皮鐮刀菌侵染的轉錄組學分析

摘要：[目的]基于RNA-Seq測序技術，初步探究了楊樹一腐皮鐮刀菌互作過程中相關基因的表達、主要信號通路和代謝途徑，篩選了楊樹防御腐皮鐮刀菌侵染的關鍵基因，為進一步揭示此類病害的分子機制奠定基礎。[方法]以生長2個月的銀腺楊84K為材料，用1×107個·mL-1的腐皮鐮刀菌孢子液侵染根系，于侵染0h（對照組）、48 h和72 h（接菌組）后取根組織進行轉錄組測序，挖掘楊樹響應腐皮鐮刀菌侵染的相關基因。[結果]（1）與對照組0h相比，侵染48 h和72 h分別檢測到8 939個和8 246個DEGs（Differen-tially Expressed Genes）。（2） GO分析發現，差異表達基因主要富集在單一生物體過程、對刺激反應、碳水化合物代謝、生物調節和對激素響應等過程。（3） KEGG分析表明，糖酵解，糖異生、碳代謝、植物激素信號轉導和苯丙烷生物合成等途徑在病原菌侵染后發生顯著變化。（4）楊樹糖轉運蛋白SWEETs家族中21個成員的表達受腐皮鐮刀菌侵染誘導。乙烯受體ETR、乙烯信號通路主要基因EIN3、ERF1、ERF2上調表達，木質素合成關鍵酶基因CCR、4CL、C3'H、COMT表達量顯著升高。[結論]楊樹可能通過調節體內糖代謝和轉運，激活乙烯信號通路，促進木質素積累、細胞壁增厚等策略，響應腐皮鐮刀菌的侵染。

關鍵詞：楊樹；腐皮鐮刀菌；侵染過程；轉錄組

中圖分類號：S763.15 文獻標識碼：A 文章編號：1001-1498（2024）03-0024-13

楊樹是我國重要的經濟和能源物種，在工業、農業、林業等方面發揮著重要作用，具有廣泛的應用價值和較高經濟價值。隨著楊樹種植面積的進一步擴大，受環境、氣候等因素影響導致病害頻發，造成了巨大的經濟損失。目前，防治楊樹病害主要靠物理防治或化學防治，不僅耗費人力、物力和財力，長期使用農藥也造成了嚴重的環境污染。因此，培育楊樹抗病品種是防治楊樹病害最為經濟、安全、有效的措施。與傳統育種技術相比，分子育種技術能夠定向、高效地培育出新品種，在植物抗病育種領域，尤其是周期較長的林木抗病育種領域具有較好的應用前景。研究楊樹抗病的分子機理，可為分子育種提供理論支撐和基因資源，是開展楊樹抗病分子育種的基礎。

植物在長期應對生物脅迫過程中形成了PTI（PAMP-triggered immunity）和ETI（Effectortriggered immunity）雙層級免疫系統以防御病原菌的入侵。植物通過自身細胞表面模式識別受體（Pattern recognition receptors，PRRs）感知病原菌特征分子（PAMPs，pathogen-associatedmolecular patterns）可激活PTI反應，通過體內核苷酸結合和富亮氨酸重復受體（Nucleotide-binding domain and leucine-rich repeat containingreceptor，NLRs）識別病原菌釋放的毒性效應子（Effectors）可啟動ETI反應，PTI和ETI協同作用可激活一系列抗病反應的發生，包括病程相關基因的表達、活性氧（ROS）爆發、細胞壁胼胝質沉積等。對楊樹-膠孢炭疽菌（Colletotrichungloeosporioides）互作的研究表明，膠孢炭疽菌的侵染可誘導NB-LRR類蛋白的上調表達，繼而引起細胞中活性氧爆發和超敏反應（HR）發生，以防御該病菌的進一步入侵。在落葉松楊柵銹菌（Melampsora larici-populina Kleb）和楊樹非親和互作中，銹菌吸器母細胞可誘導寄主細胞壁增厚，并產生乳狀突，從而阻止其侵入。水楊酸、乙烯、茉莉酸等激素是植物防御反應重要的信號分子。外施水楊酸或其類似物可誘導楊樹對銹菌（M. larici-populina）的防御反應。WRKY、TGA等轉錄因子通過調控激素合成酶或激素受體的積累，抑制或激活激素信號轉導通路中重要組分的表達，在植物防御反應過程中起關鍵調控作用。對胡楊PeTGA1的研究表明，該轉錄因子不僅可以結合水楊酸合成酶PeSARD1編碼基因的啟動子從而誘導SA的積累，還可以直接調控病程相關基因PR1的表達。過表達PeTGA1轉基因植株顯著提高了胡楊對膠孢炭疽菌的抗病能力。楊樹PtoWRKY60可調控PR5.7、PR5.2、PR5.4、PR5.5和CPR5等基因的表達，在楊樹中過表達這些基因顯著增強了對潰瘍病菌（DothioreHagregaria Sacc.）的抗性。

腐皮鐮刀菌（Fusarium solani （Mart.） Sacc）寄主范圍十分廣泛，可入侵楊樹（Populustrichocarpa Torr.＆Gray）、桉樹（Eucalyptus camaldulensis Dehn.）、橄欖（Olea europaea L.）、蘇鐵（Cycas L．）等多種林木植物。該病菌主要從根部侵入，由維管束疏導組織向上擴展，造成根部腐爛、樹干或枝條干枯、葉片枯萎脫落，最終導致植株死亡，具有傳染速度快、致死率高等特點。由于楊樹的廣泛種植，由腐皮鐮刀菌引起的病害造成了該樹種的大面積死亡，經濟損失慘重。但目前，該病害防治手段主要依賴于日常栽培管護，例如造林時盡量選擇木質化程度較高的粗壯苗木以減少病害的發生。有關該病害的研究主要集中于病害發生的描述和防治措施的探討，針對楊樹響應腐皮鐮刀菌侵染的分子機理的研究仍十分有限。

隨著測序手段和生物信息學技術的發展，高通量、快速、低成本的轉錄組（RNA-seq）技術已廣泛應用于植物與病原菌分子互作研究，成為研究林木抗病機制、挖掘抗病基因的重要手段。本研究以銀腺楊84K為試驗材料，在轉錄水平上分析腐皮鐮刀菌（F.so/ani（Mart.）Sacc）侵染楊樹根部后不同時間內差異表達基因（Differentially ExpressionGenes）及相關信號通路，以期為進一步揭示楊樹抗腐皮鐮刀菌侵染的分子機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試楊樹材料為中國林業科學研究院保存的84K楊（Populus a/ba×P．glandulosa）。將培養4周的組培苗移栽至上口徑6.5 cm，下口徑5 cm，高6 cm的小營養缽中，栽種基質為草炭土與珍珠巖（比例為3：1），每盆裝土量約為營養缽的90%，每盆栽種1株。待幼苗在小營養缽中生長2周后移栽至大營養缽（內口徑×底徑×盆高=20 cm×14.5 cm×15 cm），生長1個月后進行接菌實驗。培養條件為：溫度22～25℃、相對濕度70%、光照16 h／黑暗8h，生長期間適時澆水，保證植株正常生長。供試病原菌為腐皮鐮刀菌（F. solani （Mart.） Sacc），由中國林業微生物菌種保藏管理中心提供，菌種保存號為CFCC 51703．培養條件為：溫度25～28℃，黑暗，采用PDA培養基擴繁。

實驗試劑及儀器：植物組織RNA提取試劑盒（天根，北京）；反轉錄試劑盒PrimeScriptTM RTreagent Kit（Perfect Real Time）（Takara，日本）；熒光定量試劑KAPA SYBR FAST qPCRMaster Mix（KAPA Biosystems，美國）；改良型霍格蘭營養液NSP1020（酷萊博，北京）；Calcofluor White stain solution（酷萊博，北京）。NanoDrop One微量紫外可見分光光度計（Thermo Fisher Scientific，美國）、The RocheLight Cycler 480（Roche，瑞士）；奧林巴斯熒光顯微鏡（Olympus BX 51）。

1.2 方法

1.2.1 腐皮鐮刀菌孢子液制備

孢子液制備：將在PDA培養基上生長5d的腐皮鐮刀菌用滅菌水沖洗并收集其孢子制成孢子液。現用現制，以保證孢子的最佳活性。取100 μL收集到的孢子液用血球計數板在顯微鏡下計數，調整孢子液濃度至1×107個·mL-1。

1.2.2 危害癥狀觀察

針對莖干危害癥狀觀察，選擇正常生長2個月的84K植株，使用排針在莖干上制造傷口，利用直徑5mm的打孔器獲取腐皮鐮刀菌菌餅，敷于傷口處。將脫脂棉球用無菌水濕潤后包裹菌餅，并用封口膜纏繞，爪夾固定。接種兩天后，拆卸夾子、封口膜、棉球，以觀察傷口處病斑擴散情況。針對根部危害癥狀的觀察，用1x1 07個·mL-1濃度的孢子液浸泡生長20 d的組培小苗根部3h后移栽至土中培養，12 d后觀察腐皮鐮刀菌對植株生長的影響。

1.2.3 Calcofluor white染色

在莖干接腐皮鐮刀菌菌餅5d后，撕下傷口處樹皮，用清水清洗，使用2～3滴Calcofluor white（CFW）熒光染料和2～3滴10% KOH對樹皮進行染色，1 min后用清水清洗1～2次，將樣本置于載玻片上于奧林巴斯熒光顯微鏡下觀察，激發波長約在355 nm。

1.2.4 轉錄組接菌和取樣

將在營養土中生長45 d的84K楊幼苗根部洗凈，清洗過程中盡可能保證根部的完整。試驗設置對照組（0h）和2個接菌組（48 h和72 h），每組3棵幼苗，即3次生物學重復。利用添加了改良型霍格蘭營養液的水調整孢子液濃度為1×107個·mL-1，以保證植株正常生長所需的營養成分，霍格蘭營養液主要營養成分濃度：Ca（NO3）2·4H2O為945 mg·L-1，KNO3為506 mg·L-1，NH4NO3為80 mg·L-1，KH2PO4為136 mg·L-1，MgSO4·7H2O為241 mg·L-1，FeNaEDTA為36.7 mg.L-1。將清洗干凈的84K楊幼苗的根部置于提前配好的孢子液中，在浸泡孢子液的過程中，根部完全浸泡，并且保證苗子正常生長所需的適宜溫度和光照強度。之后分別在侵染后0、48、72 h采集根部組織，并立即將其根組織置于液氮中冷凍，然后移至-80℃超低溫冰箱中保存，以待后續實驗使用。

1.2.5 轉錄組測序

樣品由基迪奧生物科技（廣州）有限公司進行高通量轉錄組測序。通過Trizol總RNA提取試劑盒對樣品進行RNA的提取，采用安捷倫2100生物分析儀和瓊脂糖凝膠電泳檢驗所提取RNA的質量。樣品質量檢測合格后，采用Illumina Novaseq6000進行雙端測序分析。

1.2.6 轉錄組測序數據質量控制

通過fastq0.18.0軟件對序列進行質量控制，過濾去除只含adapter、含N比例大于10%、全部都是A堿基和低質量的reads（質量值Q≤20的堿基數占整條reads的50%以上）后得到Clean Reads。通過堿基錯誤率為1%（Q20）和1%a（Q30）來評估過濾后reads的質量，通常Q20在95%以上，Q30達到90%以上，說明測序結果質量合格。

1.2.7 轉錄組基因表達量分析

采用HISAT 2.2.4軟件將獲得的Clean Reads與毛果楊4.1參考基因組（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/info/Ptri-chocarpa_v4_1）進行比對。根據比對結果，利用Stringtie重構轉錄本，并使用RSEM軟件計算每個樣本中所有基因的表達量，即FPKM。通過計算FPKM值比較不同樣本中基因表達水平的差異。

1.2.8 差異表達基因的篩選、功能注釋及富集分析

利用DESeq2軟件對原始reads count進行標準化，根據模型計算假設檢驗概率（p value）和多重假設檢驗校正，得到FDR值（錯誤發現率）。以FDR＜0.05、｜log2FC｜≥2為標準篩選顯著差異表達基因。利用GO數據庫（http：//www.geneont-ology.org/）對差異基因進行功能注釋分析，利用KEGG數據庫（https：//www.genome.jp/kegg/）進行富集通路分析，使用基迪奧生物信息云平臺（https：//www.omicshare.com/）對GO功能注釋和KEGG富集分析并進行圖形可視化。

1.2.9 qRT-PCR分析

選取6個差異表達基因進行熒光定量PCR分析，以驗證轉錄組測序分析結果的準確性和可靠性。利用SnapGene 6.0.2和DNAMAN V6對所選基因和內參基因PagActin設計特異性引物，引物序列見表1。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。熒光定量PCR反應程序為：95℃5min; 95℃10 s，60℃10 s，72℃10 s，45個循環。采用2-△△Cr法計算基因相對表達水平。每個處理設置3次生物學重復，每個生物學重復設置4次技術重復。采用GraphPad Prism 8.0.1和Excel 2010對實驗數據進行顯著性分析并作圖。

2 結果與分析

2.1 腐皮鐮刀菌侵染楊樹后的危害癥狀

腐皮鐮刀菌在PDA培養基上生長時菌落較致密，正面形態呈雪白色，邊緣呈黃色（圖1A）。將該病菌菌餅接種于84K莖段，接種處利用CFW熒光染料染色后在顯微鏡下觀察，發現病原菌孢子定殖在樹皮上（圖1B）。用孢子液侵染小苗根部，觀察發現病菌從根部入侵，沿維管束向上蔓延，莖干變黑潰爛，葉片變黃枯萎（圖1C），最終導致整個植株死亡。用腐皮鐮刀菌菌餅接種84K莖段，2d后開始出現病斑，12 d時莖段黑斑擴散明顯（圖1D）。

2.2 轉錄組測序數據質控分析

對侵染不同時期的84K楊根部組織進行RNA提取，通過質量檢測后，經轉錄組測序獲得原始數據。過濾低質量數據得到了37 366 426～469 727 56個Clean reads。對不同樣本的質量檢測表明，各樣本Q20均大于等于97.61%，Q30均大于等于93.05%，GC含量為44.05%～45.79%（表2）。樣品主成分分析（圖2）顯示，接菌組（48 h和72 h）與對照組（Oh）各聚為一類，樣品間生物學重復較好。

2.3 侵染過程中差異表達基因分析

通過轉錄組測序共檢測到35 235個表達基因，以FDR＜0.05、差異倍數FC≥2或者FC≤0.5為篩選條件，對DEGs數量進行統計學分析。結果顯示，接菌后48 h，對照組和接菌組之間共檢測到8939個差異表達基因，其中上調基因3 020個，下調基因5 919個（圖3A）。接菌后72 h，共檢測到差異表達基因8 246個，其中上調基因2 910個，下調基因5 336個（圖3B）。進一步統計發現，接菌48 h和72 h后均被檢測到的差異表達基因共有327個（圖4）。

2.4 差異表達基因的注釋和富集分析

對差異基因進行GO功能富集分析，結果（圖5）顯示，在生物學過程、分子功能和細胞組分方面均存在顯著富集。接菌48 h后，差異表達基因主要富集在單一生物體過程（Single-organism process）、對刺激的反應（Responseto stimulus）和碳水化合物代謝過程（Carbohydrate metabolic process）等過程。接菌72 h后，則主要富集在對刺激的反應（Response to stimulus）、生物調節（Biologicalregulation）和對激素的響應（Response tohormone）等通路。

進一步對差異基因進行KEGG富集分析，結果顯示，接菌48 h后，92個差異基因富集到糖酵解／糖異生（Glycolysis／Gluconeogenesis）途徑，127個差異基因富集到苯丙烷生物合成途徑（Phenylpropanoid biosynthesis），1 47個差異基因富集到碳代謝途徑（Carbon metabolism）、40個差異基因富集到果糖和甘露糖代謝途徑（Fructose and mannose metabolism），144個差異基因富集到植物激素信號傳遞途徑（Planthormone signal transduction）。接種病原菌72 h后，124個差異基因富集到苯丙烷生物合成途徑，76個差異基因富集到糖酵解，糖異生途徑，128個差異基因富集到植物激素信號傳遞通路，122個差異基因富集到碳代謝通路、69個差異基因富集到淀粉和蔗糖代謝（Starch and sucrose metabolism）通路（圖6）。

2.5 qRT-PCR驗證基因表達水平

為了進一步驗證轉錄組測序結果的準確性，本研究選取6個基因進行熒光定量PCR驗證，即Potri.005G187300、Potri.012G031400、Potri.015G101500、Potri.003G166800、Potri.013G013800、Potri.012G001400，選取PagActin為內參基因。結果顯示，6個基因的表達趨勢與轉錄組測序結果基本一致（圖7），表明本研究中分析獲得的差異表達基因可信度較高，可用于后續實驗。

2.6 楊樹SWEETs家族表達分析

KEGG富集通路結果顯示，接菌48 h和72h后差異基因顯著富集到多個與糖合成與代謝相關的途徑。植物SWEETs家族是一類重要的糖轉運蛋白，在植物和病原菌互作過程中，不僅可以作為病原菌效應子的識別受體，還可以通過負責糖的運輸影響植物本身的免疫反應。之前的研究表明，楊樹SWEET家族共有27個家族成員。本研究共檢測到26個楊樹SWEET基因，其中48 h后10個上調、10個下調，72 h后11個上調、10個下調。9個SWEET基因在病原菌侵染48h和72 h后均上調表達（表3）。因此，推測SWEETs可能在楊樹與腐皮鐮刀菌的互作過程中發揮重要作用。

2.7 植物激素信號轉導及相關基因表達分析

進一步對KEGG富集結果分析發現，植物激素信號轉導途徑中乙烯、水楊酸和茉莉酸信號通路中的基因受腐皮鐮刀菌不同程度誘導。接菌后，乙烯合成限速酶基因ACS6表達量上調2.1～2.6倍，乙烯受體ETR3個成員Potri.002G201500、Potri.008G164400和Potri．010G07300上調表達1.8～3.0倍。乙烯信號轉導途徑關鍵成員EIN3和ERF//2的表達水平被腐皮鐮刀菌誘導，前者在接菌48 h顯著升高，后者在48 h和72 h均顯著上調。乙烯信號通路重要調控因子MPK6的編碼基因表達量顯著下降。水楊酸信號通路中，水楊酸受體NPR1的編碼基因（Potri.005G206100）表達量和關鍵轉錄因子TGA的編碼基因（Potri.002G090700）在接菌48 h顯著上調。該通路標志基因PR1的表達水平在接菌后48 h和72 h均顯著上調。茉莉酸酰氨基酸結合物合成酶JAR1編碼基因（Potri.002G168200）受腐皮鐮刀菌誘導后表達量下調，茉莉酸信號通路關鍵基因JAZ、MYC2在接菌后48 h和72 h均顯著下調表達（圖8）。

2.8 苯丙烷生物合成途徑及相關基因表達分析

KEGG富集結果分析顯示，楊樹在響應腐皮鐮刀菌入侵的過程中，苯丙烷類生物合成途徑中關鍵酶基因的表達量發生顯著變化。肉桂酰輔酶A還原酶CCR為該途徑第一個限速酶，同時催化3種羥基肉桂酸CoA酯的還原反應，生成相應的肉桂醛。接菌后48 h和72 h，CCR基因表達量分別為Oh的1.4～10.5倍和1.7～10.5倍。咖啡酸．O-甲基轉移酶COMT催化苯丙素類化合物羥基上氧原子的甲基化生成阿魏酸、芥子酸，受腐皮鐮刀菌誘導后表達量上調4.0～4.5倍。4-香豆酸輔酶A連接酶4CL催化肉桂酸及其衍生物生成相應的輔酶A酯，在接菌后48 h和72 h，表達量分別上調1.3倍和1.7倍。香豆酸-3-羥基化酶C3'H催化對香豆酰莽草酸，奎寧酸到咖啡酰莽草酸，奎寧酸C3位置的羥基化反應，在接菌后表達量顯著升高。莽草酸O-羥基肉桂酰轉移酶HCT催化對香豆酰CoA生成對香豆酰莽草酸，在接菌后48 h和72 h分別下調1.5～8.2倍和1.3～8.2倍（圖9）。

3 討論

由腐皮鐮刀菌引起的楊樹病害是近幾年江蘇、安徽等南方地區發生較為嚴重的楊樹病害，主要發病于新生幼苗，一旦發病，造成的經濟損失嚴重。從分子方面研究其發病機理，可為楊樹抗病新品種的培育提供理論基礎，但是目前相關研究仍十分有限。本研究利用RNA-seq技術對該病菌侵染楊樹根部后不同時間的差異表達基因進行了分析，鑒定出楊樹·腐皮鐮刀菌互作過程關鍵基因、相關信號通路及代謝途徑，為進一步揭示楊樹對該致病菌的抗性分子機理奠定了基礎。

對腐皮鐮刀菌侵染楊樹后差異表達基因的GO和KEGG代謝途徑富集分析發現，糖酵解、果糖和甘露糖代謝等糖代謝途徑發生顯著變化。糖代謝是植物和微生物能量獲取的主要方式，也可為二者細胞內生物合成提供物質基礎，產生的部分糖還可作為信號分子調控寄主防御反應。糖轉運是植物一病原菌互作過程中伴隨糖代謝的重要事件。研究表明，植物遭受病原菌侵染后，二者會發生營養爭奪，競爭調控糖在細胞內外的轉運方向，負責糖運輸的糖轉運蛋白在此過程中發揮重要作用。SWEET是植物中廣泛存在的一類糖轉運蛋白。對擬南芥一腐霉病（Pythium irregulare）的研究發現，擬南芥（Arabidopsis thaliana （L.） Heynh.）AtSWEET2在根中高度表達，參與其與腐霉菌的互作過程，敲除該基因后促進了腐霉菌的進一步擴展，導致敏感性明顯增強。蕪菁SWEET家族成員被根瘤菌（Plasmodiophora brassicae）接種誘導，可操縱寄主體內糖從合成部位到根瘤菌定植部位，為病菌的生長和擴繁提供營養，敲除SWEET11增強了寄主對根腫病的抗病性。棉花（Gossypium hirsutum L.）GhSWEET42過表達植株在感染大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）后具有高感病性，該基因的突變體則表現為抗病性。由此可見，SWEET家族成員在不同的寄主一病原菌互作過程中所表現的作用不同。本研究分析表明，楊樹27個SWEETs家族成員中有21個成員參與了對腐皮鐮刀菌侵染的響應，其中SWEETlb等9個成員在接菌48 h和72 h后表達了均上調，SWEETla等9個成員在接菌48 h和72 h后均下調，推測該基因家族在二者互作過程中發揮關鍵作用。后續，將通過進一步研究明確楊樹SWEET不同成員在互作過程中的具體作用。

水楊酸、乙烯和茉莉酸信號通路不僅參與植物自身的生長發育，還調控植物的抗病反應，三者通過相互協同或拮抗的方式，使植物以最少的能量代價維持自身生長和防御各種病原微生物入侵。在植物免疫反應中，通常認為水楊酸參與植物對活體營養型病原菌的抗性，乙烯與茉莉酸協同作用誘導植物對死體營養型病原的抗性。對作物類土傳真菌類病害的研究表明，乙烯信號通路參與棉花一枯萎病菌（Verticillium dahliae）、水稻·紋枯病菌（Rhizoctonia solani）的互作過程。棉花枯萎病菌的侵染可誘導乙烯信號通路下游關鍵調控因子GbERFl-like的表達，從而激活PR3、PR4等病程相關基因，引發抗病反應。在水稻（OryzasativaL.）中過表達乙烯合成酶基因OsACS2，可促進內源乙烯水平的積累，激活乙烯信號通路，提高了對紋枯病的抗性。番茄枯萎病菌（Fusariumoxysporum）的侵染可誘導番茄水楊酸和乙烯信號通路標志基因顯著上調，推測兩條通路共同參與番茄-枯萎病菌的互作。對楊樹葉銹病的研究發現，水楊酸信號通路可通過提高葉片中兒茶素、原花青素等次生代謝物的含量，增強楊樹對葉銹病的抗性。上述研究表明，植物防御信號轉導受植物基因型、與病原菌的互作及環境等因素的影響，不同信號轉導通路在傳遞信號時也可能會存在相互交叉或重疊。本研究發現，接種腐皮鐮刀菌后，楊樹根中乙烯受體ETR、乙烯信號通路主要基因EIN3、ERF1、ERF2上調表達，乙烯通路負調控因子MPK6下調表達。水楊酸信號通路關鍵基因上調表達，茉莉酸信號通路關鍵調節因子下調表達。推測乙烯信號通路在楊樹-腐皮鐮刀菌互作中起關鍵作用，水楊酸通路可能協同乙烯通路共同參與了楊樹對腐皮鐮刀菌的防御反應。

苯丙烷生物合成途徑是植物體內物質合成與代謝的重要途徑，也是植物抗性防御系統的重要組成部分。該途徑產生的酚類、黃酮類等代謝產物可以抑制病原菌的生長，同時具有強大的抗氧化作用，幫助植物抵御自由基的傷害，在抗病過程中起化學屏障作用。對楊樹-葉銹菌互作的研究表明，葉銹菌侵染可誘導原花青素等化學物質的積累，從而阻止病斑的進一步擴展。苯丙烷生物合成途徑的另一個重要產物是木質素，是由酚類物質經過復雜過程結合而成的多聚體，也是植物細胞壁的主要成分。當植物遭受病原菌侵染后，細胞壁會積累大量的木質素。細胞壁的木質化可以阻止病原菌的擴散，減少真菌溶解酶類對植物細胞的滲透和毒害作用，為抵抗病原菌的入侵提供了物理屏障。研究發現，楊樹潰瘍病菌（Dothiorella gregaria）及其菌絲體提取物能誘導楊樹細胞壁木質素的積累，而且抗病品種中木質素積累的速度和水平遠遠高于感病品種。對土傳病害的研究表明，棉花在應對大麗輪被菌入侵時，Gh4CL、GhC3H、GhCCR4等木質素合成相關基因的表達量均顯著提高，抗黃萎病棉花品種中的木質素含量明顯高于感病棉花品種。煙草經青枯病菌（Ralstonia solanacearum）侵染可誘導抗病品種中CCoAOMT、4CL、CCR等木質素合成相關基因上調表達。本研究發現，CCR、4CL、C3'H和COMT等與木質素合成相關的基因被腐皮鐮刀菌誘導上調表達，推測細胞壁增厚可能是楊樹應對該病原菌侵染的策略之一。

4 結論

本研究利用轉錄組測序技術鑒定到327個腐皮鐮刀菌侵染誘導的差異表達基因，這些基因主要富集到糖酵解／糖異生、植物激素信號轉導、苯丙烷生物合成、果糖和甘露糖代謝以及淀粉和蔗糖代謝等通路上。進一步的分析發現，楊樹SWEETs家族中有9個家族成員在侵染48 h和72 h后均上調表達，乙烯信號通路關鍵成員EIN3在侵染發生48h時上調表達，ETR、ERF1、ERF2在侵染48 h和72 h后均上調表達，木質素合成關鍵酶基因CCR、4CL、C3'H、COMT上調表達，推測糖代謝和轉運、乙烯信號通路、木質素積累等可能是楊樹響應腐皮鐮刀菌侵染的主要事件。后續將對挖掘到的關鍵候選基因進行功能驗證。

（責任編輯：張研）

基金項目：國家重點研發計劃（2021YFD2200201）;農業生物育種重大項目（2022ZD0401505）;