凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）野生群體與養殖群體的線粒體遺傳變異分析

摘 要：為研究凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）的母系遺傳背景以及遺傳特性，運用線粒體基因（ mtDNA） D-loop區分子標記技術，對凡納濱對蝦野生群體與養殖群體的遺傳變異進行了比較分析。結果顯示：野生群體與養殖群體的堿基組成一致，A+T的含量（81.52%）明顯高于C+G的含量（18.48%）；野生群體的單倍型多樣性（Hd）為0.960±0.017，核苷酸多樣性（π）為0.104±0.051，明顯高于養殖群體的（Hd=0.680±0.075，π= 0.060±0.029）。經分子方差分析（AMOVA）發現，種群間的遺傳變異率為13.09%，群體內的遺傳變異率為86.91%，野生凡納濱對蝦群體與養殖群體的遺傳分化存在顯著差異（F st=0.131，P＜ 0.05）。本研究結果可為凡納濱對蝦的種質資源相關研究提供理論依據。

關鍵詞：凡納濱對蝦；野生群體；養殖群體；mtDNA；遺傳多樣性

凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）隸屬于節肢動物門（Arthropoda）、甲殼動物亞門（ Crustacea）、軟甲綱（Malacostraca）、十足目（Decapoda）、對蝦總科（Penaeoidea）、對蝦科（Penaeidae）、濱對蝦屬（Litopenaeus），原產于南美洲太平洋沿岸水域，主要分布在秘魯北部至墨西哥桑諾拉（Sonora）沿海一帶，以厄瓜多爾沿岸分布最為集中。我國在1988年從美國引進凡納濱對蝦，發展至今已逾30年。該蝦具有生長快、抗病性強等特點，因而獲得大規模推廣養殖，現已經成為當今世界三大養殖產量最高的品種之一 ^［1］。

相對于同工酶、RAPD等其他分子標記， DNA序列分析在用于群體遺傳多樣性分析時，其結果更直接、更準確和可靠 ^［2］，而且線粒體基因（mtDNA）具有結構簡單、進化速度快、呈母系遺傳、種群間的遺產差異容易檢出等特點 ^［3-6］，其中關于12S rRNA、16S rRNA、COI，D-loop等基因片段的研究較多。水產種質資源發掘與利用教育部重點實驗室于2016年運用mtDNA D-loop區分子標記對凡納濱對蝦養殖群體的遺傳多樣性進行了分析 ^［7］，鑒于在全世界范圍內凡納濱對蝦長期選育和養殖可能引起的種質退化問題，實驗室在引進厄瓜多爾野生群體后，再次運用mtDNA D-loop區分子標記技術，對野生凡納濱對蝦以及人工養殖凡納濱對蝦群體進行了比較分析，以期揭示野生凡納濱對蝦與經長期人工選育和養殖的凡納濱對蝦群體之間在遺傳多樣性及遺傳結構方面存在的差異，為凡納濱對蝦種質資源相關研究提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

野生凡納濱對蝦群體于2016年從厄瓜多爾引進后，暫養于上海市金山區，從中隨機挑選51尾用于試驗。養殖群體來自本實驗室自2014到2017年保存的9個選育群體樣品，從中隨機選取51尾用于試驗。全部試驗樣本取肌肉放在無水乙醇中于4 ℃下保存。采用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒［天根生化科技（上海）有限公司］提取基因組DNA。

1.2 引物序列與PCR擴增

以凡納濱對蝦mtDNA D-Loop區為標記，根據已公布的凡納濱對蝦mtDNA全序列設計引物，引物信息見表1。所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

PCR反應體系為：總體積50 μL，其中2×Taq MasterMix混合液25 μL，上、下游引物（10 pmol/μL）各1 μL，DNA模板（100 pmol/μL）1 μL，ddH2O 22 μL。反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35個循環；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。mtDNA擴增產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳，選擇條帶清晰的送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3 數據分析

將測序結果用BioEdit軟件進行對比，去除多余序列，并以已發表的線粒體全基因序列（ GenBank：EF584003）為對照，通過NCBI進行序列同源性比對，用軟件DnaSP v5分析堿基組成、核苷酸保守位點、多態位點，以及x單倍型多樣性（haplotype diversity，Hd）、核苷酸多樣性（nucleotide diversity，π）和平均核苷酸差異數（average number of nucleotide differences，k），軟件Arlequin v3.1基于Kimura 2P模型分析群體內與群體間分子方差（analysis of molecular variance，AMOVA），用MEGA 4.0軟件建立單倍型進化樹。

2 結果

2.1 擴增結果

凡納濱對蝦的mtDNA D-Loop區擴增產物如圖1所示，目的條帶清晰。試驗中共獲得102條野生對蝦與養殖對蝦的線粒體控制區序列，養殖群體的線粒體控制區序列大小在716～744 bp，野生群體的線粒體控制區序列大小在691～728 bp。

2.2 核苷酸變異與單倍型分布

將凡納濱對蝦野生群體與養殖群體的擴增產物序列進行比較，結果見表2。在堿基組成上，mtDNA D-Loop區的堿基序列都富含A、T，堿基A、C、G、T的平均含量分別為34.80%、10.61%、7.87%、46.72%。其中A+T含量占總堿基的 81.52%，C+G含量占總堿基的18.48%。野生群體中，有效序列752 bp，其中含330個保守位點和422個多態位點。野生群體中簡約信息位點197個，其中插入/缺失位點98個，發生轉換241個，顛換175個，轉換與顛換的比值（R=Si/Sv）為 1.38。在養殖群體中，有效序列754 bp，其中含485個保守位點和269個多態位點。養殖群體中簡約信息位點104個，其中插入/缺失位點65個，發生轉換119個，顛換116個，轉換與顛換比值（R=Si/Sv）為1.03。

采用DnaSP v5軟件對養殖群體和野生群體的線粒體控制區序列進行分析，在389個變異位點中發現了49個單倍型（見圖2和表3）。野生群體有32個單倍型，其中30個為野生群體特有的單倍型；養殖群體有19個單倍型，其中17個為養殖群體特有的單倍型，2個為野生群體和養殖群體共享單倍型，兩個群體合計共有49個單倍型。由圖2可以看出，養殖群體的單倍型主要聚為3簇，而野生群體的單倍型基本呈均勻分布。

2.3 遺傳多樣性

遺傳多樣性分析結果見表3。野生群體的單倍型指數（Hd）為0.960±0.017，核苷酸多樣性指數（π）為0.104±0.051；養殖群體的單倍型指數為0.680±0.075，核苷酸多樣性指數為0.060± 0.029，說明野生群體的遺傳多樣性遠高于養殖 群體。

2.4 遺傳分化與遺傳距離

由表4的結果可知，群體間的遺傳變異率為13.09%，群體內的變異為86.91%，可見凡納濱對蝦遺傳變異的主要來源為種群內變異。遺傳分化系數F st=0.131（P＜0.05），說明野生群體與養殖群體已發生遺傳分化。基因流（Nm=1.590）越小，表明遺傳分化程度越高，兩者共同闡明了兩個群體之間較高的遺傳分化水平。遺傳距離結果顯示，野生群體與養殖群體間的遺傳距離為0.107，野生群體內的平均遺傳距離為0.120，養殖群體內的平均遺傳距離為0.068。

2.5 系統發育樹

將野生群體和養殖群體的49種單倍型進行貝葉斯聚類分析，并用MEGA 5軟件構建系統進化樹，結果見圖2。單倍型進化樹結果顯示： Hap_5、6、7、16、20、22、23、31、41、42、45是單獨成群，其中Hap_5、6、7、16、20、22、23、31為野生群體所特有的單倍型，Hap_41、42、45為養殖群體所特有的單倍型。其他38個單倍型存在分支，養殖群體中的Hap_19、34、35、38、39、43、44、46、47、49親緣關系較近，且與野生群體中的Hap_1、8、27聚為一支，Hap_33、36、37、40與野生群體中的Hap_3親緣關系較近，養殖群體的Hap_48與野生群體的Hap_32聚為一支，親緣關系較近。

3 討論

目前凡納濱對蝦遺傳育種的親蝦大多來自于引進群體，因此在凡納濱對蝦的育種計劃中已有很多關于養殖群體的遺傳背景分析。由于凡納濱對蝦原產地對種質資源的嚴格控制，mtDNA控制區序列進化較快 ^［8］，是進行甲殼類種群內遺傳多樣性分析的理想分子標記。本研究是國內首次采用線粒體標記對凡納濱對蝦野生群體與養殖群體進行遺傳比較分析，結果表明，野生凡納濱對蝦群體與養殖群體的遺傳分化存在顯著差異。

4種核苷酸（A、T、C、G）在線粒體基因組中的分布呈不均一性，是動物線粒體基因組的一個共性 ^［9］。本研究顯示，凡納濱對蝦的野生群體與養殖群體在堿基組成上呈現一致現象，即組成中 A+T含量明顯高于G+C含量，這與線粒體普遍存在的高AT堿基的規律相符 ^［10］。

從遺傳學角度來說，物種遺傳多樣性水平的高低與其適應能力、生存能力和進化潛力密切相關 ^［11-14］，群體遺傳多樣性每損失10%，會對其繁殖能力、存活率、生長等重要生理性狀產生極大的負面影響 ^［15］。有研究表明，群體中線粒體DNA的核酸多樣性（π）和單倍體多樣性（Hd）是衡量群體多態程度和群體遺傳分化的重要指標，π、Hd值越大，表示群體多態程度越高 ^［16］，當核苷酸多樣性指數在0.001 0～0.004 7時，其群體的遺傳多樣性較低 ^［17］。由表2可見，凡納濱對蝦野生群體的核酸多樣性指數明顯高于其他物種，如銀鯧 ^［18］（Pampus argenteus）、貽貝 ^［19］（Mytilus coruscus）、許氏平鲉（Sebastes schlegeli） ^［20］、條石鯛 ^［21］（Oplegnathus fasciatus）等，是上述物種野生群體核酸多樣性的5～16倍，而團頭魴 ^［22］（Megalobrama" amblycephala）野生群體的核酸多樣性是本研究的3倍。以上結果說明，不同物種間核酸多樣性豐富度不同也可能是采集樣品地點不同導致的。本試驗的野生群體捕撈自凡納濱對蝦的原產地厄瓜多爾，該群體可能保留著更豐富的核酸多樣性；Sunden等 ^［23］研究發現，凡納濱對蝦野生群體的核酸多樣性指數是其養殖群體的1.36～20.00倍，而本研究中，野生群體的核酸多樣性（0.10）是養殖群體（0.06）的1.7倍；日本囊對蝦 ^［24］（Marsupenaeus japonicus）野生群體的核酸多樣性是4個養殖群體的4～10倍，可能原因有物種本身核酸多樣性豐富度的不同、親本選擇的數量以及對養殖環境的適應能力不同等；與劉紅等 ^［7］研究的6個凡納濱對蝦養殖群體的遺傳多樣性相比，本研究結果與之相似。研究證實，養殖群體的核酸多樣性低于野生群體，mtDNA遺傳多樣性在養殖群體中顯著降低，這已成為養殖群體的遺傳特征 ^［23］。人工養殖的親本數量的選擇、繁殖能力、存活率以及繁育過程中性狀的選擇等都會在很大程度上影響種群的遺傳多樣性。Verspoor ^［25］和Winans ^［26］認為，當群體有效親本數量小于100時，會降低該群體的遺傳多樣性。

Li等 ^［27］認為，養殖群體繁殖親本數太少易導致遺傳漂變加劇，遺傳漂變往往伴隨著瓶頸效應，從遺傳學的角度來講，瓶頸效應的發生首先表現為稀有單倍型的消失，隨著瓶頸效應的加劇就會表現出單倍型多樣性的降低，繼而會造成物種生長速度和抗病力的下降 ^［28］。本研究結果顯示，野生群體的單倍型多樣性（Hd=0.960）與貽貝 ^［19］（Hd=0.718～0.923）以及團頭魴 ^［22］（Hd=0.857～0.943）等野生物種相近，說明野生群體具有穩定的大群體；養殖群體的單倍型多樣性（Hd= 0.680）低于劉紅等 ^［7］研究的6個養殖群體的單倍型多樣性（Hd=0.880～0.994），原因可能是該養殖群體的樣品來源于這6個養殖群體的后代，與陳薇等 ^［29］研究的養殖群體親本的單倍型多樣性（Hd=0.690）結果相似。

D-loop基因是線粒體DNA的非編碼區，其堿基替換速率快，一般認為是線粒體基因組上進化最快的部分，它的變異速率為mtDNA完整分子或是其他區域的5～10倍，作為分子鐘的進化速率每百萬年高達19% ^［9］。Freeland ^［30］根據遺傳分化系數大小劃定了群體的分化程度：低度分化F st=0～0.05，中度分化F st=0.05～0.25，高度分化F st＞0.25，這已成為一般接受的群體遺傳分化標準。表3中野生群體與養殖群體的遺傳分化系數（F st=0.131）說明，野生群體與養殖群體間已經產生了中等程度的遺傳分化，且兩者間遺傳變異存在顯著差異（P＜0.05）。這與已報道的物種團頭魴 ^［22］、銀鯧 ^［18］、條石鯛 ^［21］等的結果相似。發生遺傳分化的可能原因主要是養殖群體在育苗中的人為干預以及生存環境的變化。

綜上所述，建議在凡納濱對蝦的養殖和繁育工作中，應適當補充不同來源的親蝦并增加親蝦數量，以維持較高水平的遺傳多樣性，同時實時監測養殖群體的遺傳多樣性，以防止養殖群體因遺傳多樣性降低而出現生長緩慢、抗病力下降等 現象。

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Analysis of mitochondrial genetic variation in wild and

cultured populations of Litopenaeus vannamei

FAN Chun1， GAO Xuezhong1， YU Xiaodan2， LIU Hong2， WANG Jiangang1， LI Yun2

（1. Shanghai Fengxian ecological aquaculture service center， Shanghai 201499， China;

2. Shanghai Ocean University， Shanghai 201306， China）

Abstract： To study the maternal genetic background and characteristics of Litopenaeus vannamei， mtDNA D-loop molecular marker technology was used to compare the genetic variation between wild and farmed populations of L. vannamei. The base composition of the two populations was consistent. The content of A+T was 81.52%， which was significantly higher than that of C+G （18.48%）. Haplotype diversity （Hd=0.960±0.017） and nucleotide diversity （π=0.104±0.051） in the wild population were significantly higher than those in the cultured population （Hd=0.680±0.075; π= 0.060±0.029）. Analysis of molecular variance （AMOVA） revealed that the genetic variation rate between populations was 13.09%， while the genetic variation rate within populations was 86.91%. Significant genetic differentiation was observed between the wild and cultured populations of L. vannamei （F st= 0.131 ，Plt;0.05）. The results of this study could provide a theoretical basis for future research on the germplasm resources of L. vannamei.

Key words： Litopenaeus vannamei; wild population; cultured population; mtDNA; genetic diversity