重陽木錦斑蛾對重陽木枝葉揮發性化合物的行為反應

摘要：本研究通過頂空吸附結合GC-MS技術分離鑒定了重陽木枝葉揮發性化合物，利用Y型嗅覺儀測定了雌性重陽木錦斑蛾Histia rhodope對揮發物的行為反應。結果發現，在本實驗條件下，共分離鑒定出重陽木枝葉揮發性化合物共15種；發現順-3-己烯乙酸酯和β-羅勒烯兩種化合物對雌性重陽木錦斑蛾具有明顯的吸引作用。研究結果對研發重陽木錦斑蛾的產卵引誘劑奠定了基礎。

關鍵詞：重陽木錦斑蛾；重陽木；揮發性化合物；行為反應

中圖分類號：S763.7文獻識別碼：A文獻編號：1005-6114（2024）05-010-04

重陽木錦斑蛾Histia rhodope屬鱗翅目斑蛾科，是我國城市園林綠化和行道樹重陽木Bischofia polycarpa的重要食葉性害蟲［1］。該蟲此前在國內主要分布于長江中下游和華南地區［2］，近年來北移擴散較快，在我國許多地區連年持續暴發為害。其幼蟲可將整株樹葉取食殆盡，甚至干枯死亡；老熟幼蟲吐絲下垂習性常引起樹冠下蟲絲飄蕩，對行人和居民的生活產生干擾，嚴重影響城市景觀和生態效益［3］。

目前對重陽木錦斑蛾的防控主要依賴化學防治，但該害蟲主要發生在城市居民區和公園的重陽木上，化學殺蟲劑的頻繁使用容易導致害蟲抗藥性、農藥殘留、害蟲再猖獗等問題，還會危及居民健康。因此，亟需開發新型綠色環保的防治措施［4］。昆蟲性信息素由于其具有特異性強、靈敏度高、生態安全及使用簡單等優點，在害蟲生物防治中得到廣泛的應用，尤其在蔬菜和林業害蟲防治中占據著重要的地位［5］。但該防治技術一個無法避免的缺陷是僅能誘殺雄蛾，而對負責產卵的雌蛾來說無引誘效果，若田間種群密度高或者外來已經交配雌蛾新遷入到防治區域，該技術的防治效果會顯著下降，因此目前性誘劑主要被應用于害蟲的預測預報上。

寄主植物揮發性成分在昆蟲尋找食物、交配和產卵場所發揮著至關重要的作用［6］。重陽木錦斑蛾是專食性昆蟲，幼蟲取食重陽木葉片，成蟲也僅在重陽木葉片和嫩梢上產卵。從重陽木枝葉揮發物中尋找吸引重陽木錦斑蛾雌蛾的活性成分，有望誘捕到雌蛾，從而可在大尺度空間降低蟲口密度，維護生態平衡，達到科學治理之目的。劉路等采用水蒸氣蒸餾法提取重陽木樹皮和葉片的揮發油，并通過氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術從重陽木樹皮揮發油中鑒定出丁香酚等18種化合物，在重陽木新鮮葉片揮發油中鑒定出1-己醇等14種化合物，這些研究結果為研發重陽木錦斑蛾植物源引誘劑奠定了基礎［7］。但水蒸氣蒸餾法提取的揮發油組分與寄主植物正常釋放的揮發性化合物吻合度較低，可能會遺失某些重要組分。動態頂空收集法可高保真采集寄主植物一定時間內在頂空區域不斷釋放的揮發性化合物，是目前主流的寄主植物揮發性化合物收集方法。

本研究通過動態頂空吸附法收集重陽木枝葉揮發性化合物，采用GC-MS技術分離鑒定重陽木枝葉揮發性化合物組分，利用Y型嗅覺儀測定雌性重陽木錦斑蛾對揮發性化合物的行為反應，以期為該蟲的產卵引誘劑研發和綠色防控提供依據。

1材料與方法

1.1供試材料

供試昆蟲：重陽木錦斑蛾幼蟲采自河南科技大學重陽木葉片上，將采集到的幼蟲帶回養蟲室用重陽木葉片飼喂，定期更換新鮮的重陽木葉片至化蛹。化蛹后雌雄分開，羽化后的雌蛾和雄蛾各取15頭放入交配籠（長寬高均為75 cm）中交配，交配籠內放入重陽木葉枝供成蟲攀爬，以10%蔗糖水補充營養。養蟲室溫度和相對濕度分別為（27±1）℃和（60±5）%，光周期16L∶8D。

供試植物：重陽木苗購于河南省鄢陵縣綠之林苗木基地，將樹苗栽種于花盆（高40 cm，口徑38 cm）中，常規施肥澆水管理。在進行揮發性化合物收集時，重陽木的生長高度為1.8～2.2 m。

1.2試驗方法

1.2.1重陽木枝葉揮發性化合物頂空收集

參考Sun等［8］的方法對重陽木枝葉揮發性化合物進行動態頂空收集。將重陽木主枝頂部枝葉裝到長55 cm、寬43 cm的聚四氟乙烯烤箱袋中，把裝有活性炭的玻璃棒一端用特氟龍管連接大氣采樣儀的出氣口，一端連接烤箱袋，使過濾的氣體連續泵入袋子中，流速設置為500 mL/min。吸附柱用棉繩固定在烤箱袋頂端，另一端連接大氣采樣儀的進氣口，組成一個循環的閉路系統，收集時間為800～1800。設3次重復，以相同條件下收集未放植物的氣體為空白對照。吸附重陽木揮發性化合物的吸附柱用1 mL的色譜純正己烷洗脫至1.5 mL 的樣品瓶中，每次200 μL洗脫5次，-20℃保存。活性炭玻璃棒在烘箱中180℃烘3 h，在活性碳棒未冷卻時連接高純氮氣吹1 min，排出雜質。

1.2.2植物揮發性化合物分離鑒定

通過GC-MS（7890A-5975C，Agilent Technologies，美國）對收集到的重陽木枝葉揮發性化合物進行分離鑒定，色譜柱是DB-WAX 毛細管色譜柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm，Agilent Technologies，美國）。氦氣作為載氣，流速設置為 1 mL/min。進樣口溫度為230℃，色譜柱箱的升溫程序為50℃保持1 min，然后以每分鐘5 ℃的升溫速度升至230 ℃，保持5 min。傳輸線的溫度設定為250 ℃，使用電子碰撞（EI：70 eV，250 ℃）獲得質譜，四級桿的溫度為150 ℃。利用NIST MS（NIST mass spectral search program，version 2.2，Agilent Technologies）庫比對并分析樣品中揮發性化合物的成分。通過比對標準化合物與樣品中化合物的質譜圖和保留時間，對樣品中揮發性化合物進行鑒定。

1.2.3雌性重陽木錦斑蛾的行為反應測定

利用Y型嗅覺儀，測定雌性重陽木錦斑蛾對揮發性化合物的行為反應。Y型嗅覺儀由一個總管（長60 cm，直徑6 cm）和兩個分管組成（長50 cm，直徑5 cm）。將不同的氣味化合物原液溶解在石蠟油中至濃度為 10 μg/μL，之后將10μL試驗樣品或石蠟油加在橡膠誘芯里，放入與分管相連的錐形瓶中。以交配后第2～3 d的重陽木錦斑雌蛾為供試昆蟲。在試驗過程中，每次釋放1頭于總管管口，觀察5 min。在此時間段內，沒有選擇任何一個分管視為沒有做出選擇。反之，進入分管超過一半長度并停留超過5 s或者直接進入分管底部，視為做出選擇。測試5頭雌蛾之后，轉動嗅覺儀并切換錐形瓶以避免位置效應。試驗結束后用水、乙醇和丙酮清洗嗅覺儀和錐形瓶。每頭雌蛾只使用一次。試驗期間，室溫保持在（26±1）℃，相對濕度為（75±5）％。將LED燈（80W）懸掛于Y型嗅覺儀正上方以避免光線對行為反應的干擾，光強約2 000 lx。每組試驗重復雌蛾數不少于40頭。

1.3數據統計和分析

利用GraphPad Prism 6軟件的卡方檢驗法（chi-squared analyses）分析行為試驗數據。

2結果與分析

在本實驗條件下，在重陽木枝葉中共鑒定出十二烷等15種揮發性化合物，其中綠葉氣味物質種類最多，占總數的40%，其次為脂肪族化合物，占總數的26.7%（表1）。

利用Y型嗅覺儀，測定交配后的雌性重陽木錦斑蛾對15種化合物的行為反應。結果發現，順-3-己烯乙酸酯和β-羅勒烯對交配后的雌蛾有明顯的吸引作用（SymbolcA@2值分別為9.22和3.99），在Y型嗅覺儀中雌性重陽木錦斑蛾選擇順-3-己烯乙酸酯或β-羅勒烯的比例分別為71%和64%（圖1）。

3討論

尋找并定位寄主植物產卵是蛾類昆蟲繁衍后代的關鍵。寄主植物的所在地一般由多種生物群落組成，雌蛾憑借高度敏感的嗅覺系統檢測到寄主植物的氣味信號進一步縮小搜索范圍，最終找到其寄主植物并產卵［6，9］。因此，分離鑒定寄主植物揮發物中的活性組分是解析植物與昆蟲之間復雜聯系的重要前提。

植物的揮發性化合物分為兩類：一類是高度特異性氣味組分，如十字花科植物釋放的異硫氰酸烯丙酯對已交配甘藍夜蛾Mamestra brassicae雌蛾有特異性吸引作用［10］；另一類是各氣味揮發物組分在植物中普遍存在，通過多種寄主植物揮發性化合物的特定比例實現其特異性。在本研究中，我們鑒定到的重陽木枝葉氣味揮發物，沒有一種化合物組分是其所特有的，推測這些揮發性化合物之間的比例構成了重陽木枝葉的化學指紋圖譜。

劉路等［7］通過水蒸氣蒸餾法從重陽木葉片中鑒定出14種化合物，與本研究結果相比，僅反-2-己烯醛為共同成分。說明收集寄主植物化合物方法不同，得出的結果也有很大差異。水蒸氣蒸餾提取法揮發性化合物的過程中，重陽木葉片經過高溫處理可能會造成揮發油中的某些熱敏性化合物分解或聚合，從而影響測定結果；而動態頂空收集法是在自然情況下收集的重陽木枝葉的揮發物，更具有高保真性。

通過GC-MS分析，我們發現重陽木枝葉揮發性化合物中，綠葉氣味揮發物（green leaf volatiles，GLVs）種類最多，共有6種。已有大量研究表明GLVs可引寄生蜂/寄生蠅的趨向行為［11-13］。重陽木枝葉釋放的多種GLVs是否對重陽木錦斑蛾寄生蜂/寄生蠅有吸引作用，還需要進一步的電生理以及行為學試驗驗證，此項研究將是我們未來的工作重點之一。

順-3-己烯乙酸酯和β-羅勒烯是多種植物的揮發物組分［11-13］。現有的研究表明順-3-己烯乙酸酯對多種昆蟲有吸引作用。例如，室內風洞試驗發現順-3-己烯乙酸酯對棉鈴蟲齒唇姬蜂Campoletis chlorideae雌性成蟲有吸引作用［14］。Saveer等證實棉花揮發物組分順-3-己烯乙酸酯可引起交配后的海灰翅夜蛾Spodoptera littoralis雌蛾的趨向行為［15］。Sun等發現β-羅勒烯在煙草揮發性化合物中含量較高，且對交配后的煙青蟲Helicoverpa assulta雌蛾有吸引作用［8］。在本研究中，我們發現順-3-己烯乙酸酯和β-羅勒烯對交配后的雌性重陽木錦斑蛾具有明顯的吸引作用，這對今后研發重陽木錦斑蛾產卵引誘劑有重要的參考價值。

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基金項目：河南省科技攻關項目（232102111032）。

作者簡介：孫雅輝（2001-），男，碩士研究生，從事化學生態學研究工作。E-mail：3255135925@qq.com

*通訊作者：齊英（1967-），女，本科，高級農藝師，主要從事農業生態環保技術的示范與推廣研究。E-mail：aynyz009@163.com

董鈞鋒（1973-），男，河南鄭州人，教授，博士學歷，主要從事昆蟲化學生態學研究。E-mail：junfengdong@haust.edu.cn