基于環境DNA技術的舟山南部海域魚類資源狀況和多樣性分析

關鍵詞：環境DNA;物種組成;魚類多樣性;資源調查

中圖分類號：S932.4;P74 文獻標志碼：A 文章編號：1005-9857（2024）03-0114-07

0 引言

魚類多樣性是水生生物多樣性的重要組成部分，保護魚類多樣性、掌握魚類組成和種群結構特征，有利于保護水生態系統[1]。當前，對魚類多樣性的調查方法主要利用傳統網具進行捕撈，通過形態學鑒定區別魚類物種組成，對生物量計數稱重來統計魚類資源量并評定優勢種[2]。此方法耗時久，對生物體和海洋環境的破壞性強，并且對形態分類學專業知識要求嚴格[3]。環境DNA 技術高效靈敏，通過DNA 序列識別生物體并描述生態系統特征，調查效率高于傳統調查方法，目前已廣泛應用于水生生物資源調查領域和瀕危物種的分布監測[4-7]，對于了解水生物種的時空分布和生態保護具有巨大的潛力[8]。

近年來，環境DNA 技術已成為評估水生群落結構的有力工具，為魚類資源調查提供新的思路。Yamamoto等[9]利用環境DNA 技術對日本海域47個站點的魚類群落結構和多樣性進行評估，揭示了環境DNA 檢測局部生境中的魚類群落更省時。Spear等[10]通過大眼獅鱸（Sandervitreus）在環境DNA 中的豐度證明了種群的生物量與環境DNA濃度之間呈顯著正相關，強調了環境DNA 作為種群監測工具的效用。Czeglédi等[11]將環境DNA 技術與傳統方法進行比較，表明環境DNA 技術是檢測魚類群落結構和環境關系最佳的取樣方法。

舟山南部海域漁業資源豐富，近年來由于過度捕撈和環境污染等因素影響，該海域漁業資源呈衰退趨勢。為評估舟山南部海域魚類資源現狀，研究人員對該海域魚類資源進行調查[12]，但整體上舟山南部海域魚類物種組成和多樣性分析較為薄弱。本研究通過環境DNA 技術，闡述了舟山南部海域魚類物種組成及多樣性，討論了環境DNA 技術在舟山南部海域漁業資源調查的適用性，為舟山南部海域魚類物種組成季節性變化提供理論依據[13]。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

實驗所用海水樣品于2022年9月采集于舟山南部海域附近10個站位，以真空泵將水樣過濾到0.45μm的親水性尼龍膜上，濾膜裝入50mL 的離心管中，于-80℃保存。采樣點水深小于20m 時采集表層水（或底層水），大于20m 時則共同采集表層水和底層水，在10個站位中有6個站位（A、B、C、D、I、J）的8瓶水樣提取到了環境DNA。具體水樣所屬站位名稱、經緯度及水深如表1所示。

1.2 DNA 提取及高通量測序

采用E.Z.N.A Mag-Bind Soil DNA Kit試劑盒提取濾膜上水樣環境DNA，采用QubitdsDNA HS分析試劑盒擴增12SrDNA 基因，引物序列使用FISHeDNA 通用引物[14]。聚合酶鏈式反應（PCR）擴增體系為30μL：包括15μL 混合液，1μLBar-PCRprimerF，1μLPrimerR，9～12μL去離子水和DNA 模板10～20ng。反應程序為：95℃預變性3min;94 ℃變性20s，55 ℃退火20s，72 ℃延伸20s，進行5次循環;72 ℃延伸5min，10 ℃保存。通過2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測文庫大小，使用Qubit3.0熒光定量儀進行文庫濃度測定，所有樣本按照1∶1等量混合，在IlluminaMiseq測序平臺上進行二代高通量測序。

1.3 數據分析

所有樣本去冗余序列合并后去除沒有重復的單序列，對各樣本優化序列提取非重復序列，按照97%相似性進行操作分類單元（Operational Taxonomic Unit，OTU）聚類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTU的代表序列，將所有優化序列比對至OTU 代表序列，選出與代表序列相似性在97%以上的序列。

2 結果與分析

2.1 魚類物種組成

環境DNA 宏條形碼檢測共得到有效拼接序列45127條， 圖1為本次測序所得的魚類物種OTU稀疏曲線，由圖可見測序量足以反映樣本多樣性，可以用于后續數據分析。

環境DNA 檢測出的魚類物種組成如表2 所示，在8個環境DNA 樣品中共檢測出9種魚類，隸屬于2綱6目6科9屬。在目級水平比較中，鱸形目（Perciformes）種類最多，總計4種，約占檢測魚類總數的44.44%;鲼形目（Myliobatiformes）、仙女魚目（Aulopiformes）、鯡形目（Clupeiformes）、鰻鱺目（Anguilliformes）、鰈形目（Pleuronectiformes）檢測到的種類最少，均為1種，約占11.11%。

圖2為魚類物種分布氣泡圖，展示了魚類物種在各樣本中的相對豐度值，橫軸為各站位點，不同氣泡大小表示不同物種在不同站位點的相對豐度比例。其中8個水樣中有7個均檢測到龍頭魚，龍頭魚豐度最高，其次為刀鱭、鮸、棘頭梅童魚、大黃魚，皮氏叫姑魚和赤魟豐度較低，海鰻和半滑舌鰨豐度最低，僅出現一次。

2.2 魚類多樣性分析

魚類群落相對豐度的Alpha多樣性指數如表3所示，生態學家常用Chao1和Ace算法估計群落中含OTU 數目的指數用來估計物種總數，香農指數（Shannon）和辛普森指數（Simpson）用來估算樣品中生物多樣性指數。其中，Chao1指數范圍為1～8，Ace指數均為0，Shannon指數范圍為0～1.63939，Simpson指數范圍為0.218767～0.580185，各個站位所得的魚類物種Alpha多樣性指數存在顯著差異，且8 個環境DNA 樣本在魚類物種組成和序列豐度上皆存在一定差異（圖3）。如圖所示，不同水樣的魚類物種組成和序列豐度的主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCOA）分析揭示了不同水樣間魚類組成相似情況，不同樣本有明顯的分散情況，兩樣本點越接近表明兩樣本物種組成越接近，其中D1、D2、C2魚類多樣性相似度最高，J1、B2較高，C1、I1、A1差異較大。利用R軟件繪制魚類豐度的物種組成熱圖，如圖4 所示，龍頭魚相對豐度和分布頻率最高，刀鱭、鮸較高，海鰻、半滑舌鰨最低。

3 討論

3.1 基于環境DNA 技術的舟山南部海域魚類物種組成

本研究采用環境DNA 技術分析舟山南部海域魚類物種組成，用于補充該海域魚類組成和多樣性，結合底拖網調查數據（表4）進行分析討論。底拖網共檢測到32種魚，隸屬于2綱9目14科28屬，與環境DNA 監測結果差異較大，但在兩種檢測結果中龍頭魚均為優勢種，這與張玉榮等[12]對舟山南部附近海域漁業資源進行調查研究的結果相似。環境DNA 檢測到但底拖網未檢測到的有赤魟、海鰻、半滑舌鰨，二者共同檢測到的魚類為6種，其中豐度較高的魚類如龍頭魚、鮸、棘頭梅童魚均為底拖網數據中檢測到的優勢種，證明了環境DNA技術對生物量和豐度較高的魚類檢測具有準確性。

環境DNA檢測結果與底拖網數據差異較大可能與DNA的濃度情況、取樣方法、環境條件、pH 值、溫度等因素相關[15]，許多研究表明，環境DNA 技術和形態學的檢測數據之間在物種存在和豐度方面存在差異，提出最多的原因是分子參考數據庫的不完整性和缺乏準確性[16]。與許多傳統調查方法相比，雖然環境DNA具有更低的成本和更高的效率等優勢，但是環境DNA技術的可靠性和準確性仍在改進中，不應將其完全視為傳統調查方法的替代[17]。

3.2 基于環境DNA 技術的舟山南部海域魚類多樣性初步探討

各站點之間魚類多樣性存在顯著性差異，表3列舉了反映魚類群落多樣性的Alpha多樣性指數。其中，Chao1 指數平均值為3.5（變幅為1.00～8.00），Ace指數均為0，兩個指數分布趨勢差異較大。使用Ace算法估計物種總數結果為0，可能與群落中含OTU 數目較少相關。若基于Chao1指數進行分析，D站位表層和底層兩者指數值最高，表明該站點魚類群落豐富度最高，A 站點表層數值最低，表明該站點魚類群落豐富度最低[18]。

以Simpson指數和Shannon指數分析群落多樣性水平，Simpson指數平均值為0.46105（變幅為0.21877～1），Shannon指數平均值為0.95787（變幅為0～1.63939），兩者分布趨勢基本一致。Simpson指數對于富集種更加敏感，而Shannon指數對于稀疏種更為敏感[19]，D站位表層和底層Simpson指數最低，Shannon指數最高，表明D 站位群落多樣性水平最高;A 站位Simpson指數最高，Shannon指數最低，表明群落多樣性水平最低，與Chao1指數和Ace指數分析多樣性結果相同。

魚類多樣性在不同站點間存在差異，在同一站位不同深度也存在差異。從魚類物種組成和序列豐度相似性來看，C2、D1、D2站點最先聚在一起，C站位和D 站位兩個采樣點生境條件較為相似，而D1、D2采樣點為D 站位不同水深，魚類多樣性相似;A 站位物種組成與其他站位差異最大，僅有龍頭魚一種。從物種上看，龍頭魚相對豐度和分布頻率最高。赤魟、海鰻、半滑舌鰨均出現在D 站位，在其余站點的相對豐度為0。此外，在同一站位不同深度魚類豐度有所不同，C站位表層底層差異較大，表層魚類組成為大黃魚、棘頭梅童魚、皮氏叫姑魚，底層魚類組成為龍頭魚、鮸、刀鱭;D 站位表層底層檢測結果相似，以龍頭魚和鮸豐度最高，由此可見，環境DNA 針對不同深度魚類多樣性研究具有可取性。

近幾年來，環境DNA技術在魚類種類組成及多樣性分析、資源狀況和種群分布[20-22]等方面都有一定的發展和應用。隨著分子生物學的發展，環境DNA技術與傳統調查方法相結合的方式將成為魚類資源調查和生物多樣性研究的新發展趨勢[23]。本文對環境DNA 技術在舟山南部海域秋季魚類資源狀況上的應用進行分析，其結果與底拖網調查結果相似，環境DNA 技術對豐度較高的魚類適用性較強，在確定優勢種方面具有優勢。將環境DNA與底拖網結合，對舟山南部海域魚類物種多樣性、資源量估算和種群分布等研究具有巨大潛力。