屋塵螨過敏原Der p 1 在畢赤酵母中的重組表達(dá)與純化

摘要：基于巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)探討了屋塵螨過敏原Der p 1 的重組表達(dá)與純化。首先，采用畢赤酵母GS115 表達(dá)密碼子優(yōu)化的全長編碼基因PreProDer p 1，其產(chǎn)量可達(dá)100 mg/L，進(jìn)一步共表達(dá)分子伴侶實(shí)現(xiàn)產(chǎn)量提高到140 mg/L，并實(shí)現(xiàn)3 L 反應(yīng)器發(fā)酵產(chǎn)量提高到1 g/L。其次，對上述重組蛋白發(fā)酵液分別使用陽離子交換層析及親和層析進(jìn)行了純化工藝優(yōu)化，目的蛋白得率達(dá)到60.7%。本研究為后續(xù)PreProDre p 1 診斷試劑盆的開發(fā)提供了參考。

關(guān)鍵詞：塵螨過敏原；畢赤酵母；重組表達(dá)；蛋白純化；基因拷貝

中圖分類號：Q933 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

過敏是指人體接觸環(huán)境中部分過敏原因子后，所引發(fā)的一系列過度反應(yīng)的現(xiàn)象，過敏反應(yīng)也稱超敏反應(yīng)。過敏原首次進(jìn)入機(jī)體后會誘導(dǎo)B 細(xì)胞分泌IgE 抗體，通過Fc 片段與肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞結(jié)合。當(dāng)過敏原再次進(jìn)入機(jī)體，被IgE 抗體的抗原結(jié)合片段Fab 捕獲，進(jìn)一步刺激肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞釋放組胺、白三烯等物質(zhì)導(dǎo)致機(jī)體過敏[1]。過敏患者常常伴隨著過敏性鼻炎、過敏性皮炎、哮喘等癥狀[2]。塵螨過敏的診斷需要使用塵螨檢測試劑盒，而該試劑盒的關(guān)鍵成分為純化的塵螨過敏原。

屋塵螨 （Dermatophagoides pteronyssinus） 第一類過敏原Der p 1 是屋塵螨最重要的過敏原， 超過80% 過敏患者血清中都可以檢測出這類過敏原[3]。Der p 1 由基因DERP1 編碼，其全長序列包括18 個氨基酸組成的螨蟲天然信號肽，80 個氨基酸組成的前導(dǎo)肽，以及222 個氨基酸組成的成熟肽，成熟蛋白理論分子量大小為25 kDa[4]。Der p 1 是一類半胱氨酸蛋白酶，屬于木瓜蛋白酶家族[5]，Der p 1 的過敏原依賴于其酶活性[6]。Der p 1 的獲取主要通過大量飼養(yǎng)螨蟲并利用化學(xué)方法進(jìn)行提取，重組DNA 技術(shù)的問世使過敏原的生產(chǎn)速度更快，純度更高，重組過敏原已逐漸成為天然過敏原的替代品。巴斯德畢赤酵母因具有廉價、易操作、發(fā)酵產(chǎn)物易分離純化等方面的優(yōu)勢，且其擁有與較為溫和的蛋白翻譯后的修飾能力，逐漸成為重組過敏原最主要的生產(chǎn)宿主[7-8]。

重組Der p 1 是通過酶原形式 （ProDer p 1） 合成，即成熟肽前面含有一段由80 個氨基酸組成的前導(dǎo)肽（Pro-Sequence）[9]，通常需要在體外pH 4.5 醋酸鹽環(huán)境下對該前導(dǎo)肽進(jìn)行切割處理，進(jìn)而獲得具有酶活性的Der p 1[10-12]。前導(dǎo)肽在半胱氨酸蛋白酶折疊和分泌過程中扮演著非常重要的作用：首先，前導(dǎo)肽可以充當(dāng)分子內(nèi)分子伴侶的作用幫助成熟肽折疊[4，12]；其次，前導(dǎo)肽可以作為半胱氨酸蛋白酶內(nèi)源性抑制劑，阻斷底物與酶活性位點(diǎn)結(jié)合，避免了該酶在分泌過程中對細(xì)胞產(chǎn)生毒害以及自身被降解[13-14]。Chevigne等[12] 將大腸桿菌重組表達(dá)的前導(dǎo)肽與重組Der p 1一起孵育，發(fā)現(xiàn)隨著前導(dǎo)肽濃度的增加，Der p 1 的酶活性也逐漸降低。Chruszcz 等[15] 和Meno 等[4]也報道了前導(dǎo)肽的存在覆蓋了成熟肽的活性中心，而使其酶活性喪失[16]。除此之外，ProDer p 1 上含有兩個糖基化位點(diǎn)，分別位于前導(dǎo)肽和成熟肽。重組Der p 1糖鏈的存在被認(rèn)為會降低ProDer p 1 向成熟Der p 1轉(zhuǎn)化的速率[17]。前導(dǎo)肽糖基化的存在會使重組Der p 1在-61 位點(diǎn)處發(fā)生部分切割，導(dǎo)致表達(dá)出的蛋白在SDS-PAGE 上呈現(xiàn)出兩個條帶，分別對應(yīng)34 kDa 和32 kDa。如果將該位點(diǎn)的糖基化進(jìn)行突變，那么表達(dá)出的蛋白會很均一，對應(yīng)分子量為32 kDa。而前導(dǎo)肽在裂解過程中，其附帶的糖鏈也會被一起去除。為了得到與天然Der p 1 分子量相同的重組蛋白，人們一般選擇突變成熟肽上的糖基化位點(diǎn)[18]。