穩轉oHSV2主要衣殼蛋白VP5人宮頸癌細胞系的構建

［摘 要］ 為建立穩定表達溶瘤Ⅱ型單純皰疹病毒主要衣殼蛋白（VP5）的人子宮頸癌HeLa-VP5細胞系，探究VP5蛋白是否調控自然殺傷細胞（NK）的細胞毒性。運用piggyBac轉座系統，通過lipofectamine 3000TM 脂質體轉染法，將 pPBDP-UL19和pSPBT質粒轉入HeLa細胞，利用嘌呤霉素（Puro）篩選穩定細胞株，用有限稀釋法得到單克隆細胞，利用western blot鑒定HeLa-VP5細胞系中VP5蛋白的表達，以及利用流式細胞術檢測HeLa-VP5中GFP的表達，最后實時監測法比較改造前后細胞系的生長活性變化。通過嘌呤霉素抗性篩選和有限稀釋挑取單克隆，獲得3株HeLa-VP5單克隆細胞；western blot鑒定發現3株HeLa-VP5細胞系VP5蛋白均有表達；流式檢測單克隆細胞系GFP陽性率均達到99%；活細胞實時監測法檢測發現HeLa-VP5細胞系與親本細胞HeLa細胞具有一致的生長活性。HeLa-VP5穩轉細胞系構建成功，作為評估VP5蛋白是否調控自然殺傷細胞（NK）細胞毒性的靶細胞，為揭示oHSV2發揮抗腫瘤作用機制提供理論基礎。

［關鍵詞］ 溶瘤Ⅱ型單純皰疹病毒； 主要衣殼蛋白； 穩轉細胞系

［中圖分類號］ R153" ［文獻標識碼］ A

溶瘤病毒療法是一種新興的實體瘤治療方式。它使用可自我復制的溶瘤病毒選擇性地感染腫瘤細胞，促進細胞裂解并產生可以擴散到其他腫瘤細胞的后代[1]，通過直接溶瘤作用和誘導抗腫瘤免疫反應特異性殺死腫瘤細胞。溶瘤病毒（oncolytic virus，Ovs）是一類可以選擇性地感染和殺死癌細胞，但不傷害正常細胞的天然或重組病毒。到目前為止，全球已經批準了Rigvir（ECHO-7）、Oncorine（H101）、T-VEC （Imlygic）和DELYTACT （teserpaturev/G47Δ） 等4個OVs藥物，分別用于治療黑色素瘤、頭頸癌、轉移性黑色素瘤和惡性神經膠質瘤或任何原發性腦癌。另外，單純皰疹病毒、牛痘病毒、腺病毒、呼腸孤病毒和新城疫病毒等不同類型的溶瘤病毒已進入臨床前和臨床研究階段。單純皰疹病毒（herpes simplex virus，HSV）是包膜雙鏈 DNA 病毒，主要引起野生型唇皰疹和生殖系統感染。改良的HSV是一種用于診斷和治療癌癥的病毒類型。迄今為止，包括Oncovex（T-VEC）、1716、G207、NV1020、HF10和G47Δ在內的幾種HSV突變體已經完成或進入Ⅰ期、Ⅱ期和ⅡⅠ期臨床試驗，以治療來自不同組織的黑色素瘤、乳腺癌和膠質瘤等不同惡性程度的腫瘤[2]。

單純皰疹病毒是最常用的溶瘤病毒載體之一。常見的溶瘤單純皰疹病毒（oHSV）通過敲除神經毒性因子ICP34.5來減弱病毒對正常細胞的致病性，增強其在腫瘤細胞中的選擇性復制[3]。溶瘤Ⅱ型單純皰疹病毒oHSV2是基于標準株 HSV-2（HG52）而改造的，即敲除了ICP34.5基因和ICP47基因，同時插入了人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（human granulocyte macrophage colony stimulating factor，hGM-CSF）基因。其改造的優勢在于：1）ICP34.5的基因產物可以通過干擾素途徑抑制細胞對病毒的清除，而在腫瘤細胞內此途徑是缺失的，將ICP34.5敲除后，增強了oHSV2對腫瘤細胞選擇性復制；2）ICP47導致了TAP缺陷，從而限制了感染細胞的免疫識別，而ICP47基因的缺失恢復了MHC I，使腫瘤細胞響應免疫應答，上調了US11的表達，促進病毒在腫瘤細胞內的生長并提高病毒的溶瘤活性[4]；3）oHSV2載體含有hGM-CSF，它可以激活抗原呈遞細胞，誘導腫瘤特異性免疫應答。

腫瘤已經開發出不同的策略來逃避免疫監視，包括對主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）的經典MHC I類抗原進行下調或對非經典HLA-G和HLA-E抗原進行上調。人類白細胞抗原（HLA-E）在大多數組織的細胞表面普遍以低水平表達，但在腫瘤細胞和病毒感染的細胞中過表達[5]，并通過與自然殺傷（NK）細胞和T淋巴細胞上的受體CD94 / NKG2受體結合來進行免疫調節。HLA-E與CD94 / NKG2受體的結合，可以導致NK細胞的抑制或活化，這取決于HLA-E所呈現的肽和與CD94相關的NKG2受體[5-8]。由于其免疫抑制的特征，HLA-E的表達可能代表了腫瘤逃避免疫監視的重要機制。

前期研究發現，UV-oHSV2感染腫瘤細胞（BGC823、LoVo、A549、HeLa）后，細胞的HLA-E上調表達，并且利用GST pull-down、Co-IP等技術篩選出HLA-E的互作蛋白——oHSV2主要衣殼蛋白VP5。VP5蛋白是由HSV-2的UL19基因所編碼的主要衣殼蛋白，在感染復制晚期達到最高表達水平。冷凍電子顯微鏡下觀察到HSV-2（MS株）衣殼結構由大約3000個蛋白質組成，分為六鄰體（hexons）、五鄰體（pentons）和三聯體（triplexes）等3種類型。六鄰體和五鄰體都包含VP5（六鄰體還包含VP26），三聯體包括VP23和VP19C。VP5蛋白形成了廣泛的分子間網絡，包括多個二硫鍵（總共約1500個）和非共價相互作用，與VP26蛋白和三聯體支撐衣殼穩定和裝配[9]。

為初步驗證VP5蛋白是否影響了HLA-E分子的表達水平，將表達VP5蛋白的質粒瞬時轉染腫瘤細胞后，發現細胞HLA-E的表達水平上調。為進一步探究oHSV2的主要衣殼蛋白VP5如何上調HLA-E以及VP5是否通過干擾HLA-E與CD94/NKG2受體的相互作用從而調控NK細胞的細胞毒性，本研究擬構建穩定表達VP5蛋白的腫瘤細胞系，以便后續oHSV2抗腫瘤作用機制研究。

本研究采用的是piggyBac轉座系統。昆蟲的piggyBac轉座子是一種新興的非病毒系統，可以有效誘變和介導基因轉移到哺乳動物基因組中[10]，與基于病毒的系統相比，是一種更安全的選擇。它可以攜帶高達14 kb的DNA片段，且轉座效率沒有顯著影響。PiggyBac轉座子通過“剪切和粘貼”機制有效地在載體和染色體之間轉置。在轉位過程中，轉座酶識別位于轉座子載體兩端的轉座子特異性倒置末端重復（ITR）序列，將內容物從載體上移出并將它們整合到目的染色體的TTAA位點中[11]，其切除精確，不會留下任何痕跡序列。因此PiggyBac轉座子成為哺乳動物中使用的主要轉座子/轉座酶系統。使用帶有UL19基因（編碼VP5蛋白）的轉座質粒（pPBDP-UL19）和表達轉座酶的質粒（pSPBT），將UL19基因整合至HeLa細胞染色體上，以綠色熒光蛋白（green fluorescent protein 即 GFP）作為熒光標記，嘌呤霉素作為細胞抗性，進行細胞系篩選和單克隆挑選，成功構建了HeLa-VP5穩轉細胞系。

本研究構建穩定表達溶瘤Ⅱ型單純皰疹病毒主要衣殼蛋白（VP5）的人子宮頸癌HeLa-VP5細胞系，將其作為評估VP5蛋白是否調控自然殺傷細胞（NK）細胞毒性的靶細胞，為揭示oHSV2發揮抗腫瘤作用機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和儀器

溶瘤病毒oHSV2由本實驗團隊進行基因改造、生產、純化。實驗所使用Hela細胞、質粒載體PiggyBac Dual promoter、Super PiggyBac Transposase由本團隊保存，細胞培養基是DME/F-12（HyClone，USA），大腸桿菌DH5α感受態細胞由本實驗團隊制備，限制性內切酶（NEB），質粒小提中量試劑盒購于諾唯贊公司，嘌呤霉素（Puro）購于碧云天生物公司，流式細胞檢測儀（BD），體視熒光顯微鏡（Nikon 公司），北京東聯哈爾二級生物安全柜。

1.2 質粒構建

配制PCR體系及設置反應程序。所用到的引物見表1。

將UL19基因片段產物和pPBDP空載同源重組。其重組產物轉化DH5α后，搖菌1 h。取菌液涂布LB固體平板（Amp抗性）。待平板長出單克隆菌落后，挑取10個單克隆菌落搖菌培養。取菌液做菌落PCR，出現UL19陽性結果的菌株外送測序。測序結果與NCBI上的發布序列比對。

1.3 質粒提取

將測序成功的菌液以1∶1000的比例接種至LB液體培養基（Amp抗性）中，37℃，220 r/min 搖菌14 h后提質粒。

1.4 細胞敏感性實驗

將HeLa細胞接種于24孔板中。次日將嘌呤霉素（1～10 μg/mL）加入孔中，每個梯度設置3個復孔，并做好標記。每日觀察孔內貼壁細胞占比，在第2、4、6天更換含有嘌呤霉素的培養基。將第4天中HeLa細胞存活率為0時的嘌呤霉素濃度設為其最低致死濃度。

1.5 質粒轉染

轉染前一天將HeLa細胞接種到24孔板中。按照說明書配制反應體系（表2）。

將體系A和B分別制備好后，充分混勻，室溫靜置10 min。將總體系加入孔中，培養48 h后觀察GFP表達情況。

1.6 HeLa-VP5單克隆細胞系篩選

換用嘌呤霉素的完全培養基進行培養。當孔中有90%以上的細胞發光時，進行單克隆細胞篩選。將孔板內細胞消化，用梯度稀釋法將細胞懸液稀釋到一定密度后接種到96孔板中，確保每孔中只有一個細胞。48 h后觀察96孔板，記錄下單個細胞生長對應的孔。待單細胞長成細胞團并有完整細胞形態后，選出發綠色熒光的單克隆細胞團，并將其擴大培養。

1.7 Western blot檢測HeLa-VP5細胞系中VP5蛋白的表達

取HeLa細胞和HeLa-VP5細胞，冰上裂解細胞20 min后，13 000 r/min，4℃離心收集上清。加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液后，100℃煮沸15 min。將上述蛋白樣品進行電泳，保證每孔上樣量相同。使用半干法轉膜，15 V，20 min，得到樣品NC膜。將NC膜封閉，洗膜，一抗孵育，二抗孵育后，滴加ECL顯色液進行顯影。

1.8 流式細胞術檢測HeLa-VP5細胞系中GFP的表達

取1×106個HeLa和HeLa-VP5 細胞。以HeLa細胞作為對照組，收集細胞懸液到EP管中，離心棄去上清。用PBS分別清洗、重懸細胞，過濾后上機。設置流式細胞儀檢測通道為 GFP 單通道，收集1×104個細胞。GFP通道的相對熒光強度作為GFP表達的量化指標。

1.9 活細胞實時監測法檢測HeLa-VP5細胞系增殖活性

取1×104個的HeLa和HeLa-VP5 細胞，以Hela細胞作為對照組，將細胞懸液加入電極板中。將電極孔板放入活細胞實時監測儀上，靜置30 min。監測細胞指數，5 min/次，記錄細胞生長曲線。一共監測40～60 h。

2 結果

2.1 pPBDP-UL19質粒的構建

以oHSV2的cDNA為模板擴增UL19基因（4125 bp，編碼VP5蛋白）。如圖1所示，其擴增條帶在約4125 bp處，與目的基因大小一致。通過單克隆菌落PCR鑒定，其擴增條帶位置與目的基因一致（圖2）。挑取3個單菌落外送測序，測序結果與GenBank中發表的序列一致。選取測序正確的質粒，通過雙酶切（圖3）鑒定，證明質粒pPBDP-UL19構建成功。

2.2 HeLa對嘌呤霉素敏感性實驗

設置不同嘌呤霉素濃度（1～10 μg/mL）進行Hela細胞敏感性分析。根據致死曲線可知，篩選到第4天時，在2 μg/mL的濃度梯度下觀察到細胞存活率為0。因此以2μg/mL作為HeLa單克隆細胞篩選的最佳濃度。

2.3 質粒轉染HeLa細胞

將pPBDP-UL19質粒和pSPBT質粒共同轉染HeLa細胞48 h，通過熒光顯微鏡可以觀察到視野內有30%以上的細胞發光（圖5），說明pPBDP-UL19質粒和pSPBT質粒轉染效率較高，并成功表達了GFP。

2.4 HeLa-VP5單克隆細胞系挑選及培養

經過2 μg/mL嘌呤霉素加壓篩選后，進行單克隆細胞系挑選及培養，得到了3株穩定表達GFP的單克隆細胞株（圖6）。

2.5 HeLa-VP5細胞系VP5蛋白的表達

收集HeLa細胞和HeLa-VP5細胞，將細胞裂解后取上清進行western blot分析。3株HeLa-VP5單克隆細胞均檢測到VP5（圖7）。

2.6 流式細胞術檢測HeLa-VP5細胞系純度

如圖8所示，通過流式細胞儀檢測HeLa-VP5細胞與HeLa細胞的GFP陽性率（FL1-A+表示GFP陽性率）。HeLa-VP5-1和HeLa-VP5-3與對照組相比， GFP陽性率均在99%以上，說明HeLa-VP5單克隆細胞系構建成功。

2.7 活細胞實時監測法檢測HeLa-VP5細胞系增殖活性

通過生長曲線（圖9）可以得知，HeLa-VP5與其親本細胞HeLa生長曲線趨勢一致，說明VP5蛋白的表達對細胞增殖活性沒有影響。

3 討論與結論

本研究運用piggyBac轉座系統構建穩轉細胞系。通過構建帶有UL19基因的轉座質粒（pPBDP-UL19）和表達轉座酶的質粒（pSPBT），完成了HeLa細胞對UL19基因的整合，利用嘌呤霉素抗性篩選陽性細胞。通過western blot、流式細胞術、活細胞實時監測等方法證實了UL19整合到HeLa細胞的基因組中并成功表達VP5蛋白，證明使用piggyBac轉座子/轉座酶系統在人宮頸癌細胞（HeLa）中進行永久性基因轉移是可行的。

溶瘤病毒作為用于治療的病毒，可以選擇性地在腫瘤組織內復制，并將其破壞裂解，但不會感染正常組織[12]。而腫瘤細胞裂解釋放出的抗原，則能進一步激活系統性的抗腫瘤免疫應答，實現對原位和轉移腫瘤的殺傷[13]。然而，腫瘤已經發展出逃避免疫系統監測的機制，免疫抑制分子（如白細胞免疫球蛋白樣受體LILRB4和細胞程序性死亡一配體1（PD-L1））的高表達，可以抑制抗腫瘤免疫反應[14]。

免疫檢查點抑制劑（ICIs）是近年來治療腫瘤的流行免疫療法之一，其通過靶向和抑制免疫檢查點（包括 CTLA-4 和 PD-1）來激活免疫應答。但與“熱”腫瘤相比，免疫檢查點抑制劑在治療“冷”腫瘤方面效果較小，原因在于促炎細胞因子的產生和T細胞浸潤的水平將在一定程度上改變腫瘤微環境（TME）的“冷”（非T細胞炎癥）與“熱”（T細胞炎癥）性質，這與腫瘤發展過程中表現出的抑制或支持性質密切相關?！盁帷蹦[瘤的特征是T細胞浸潤和免疫激活的分子標志物。“熱”腫瘤對免疫治療的反應率較高，而“冷”腫瘤表現出明顯的T細胞缺陷或排斥反應[15]。

OV的治療活性不僅限于其溶瘤活性，還包括腫瘤微環境和免疫系統的整合調節。因此，OV提供了逆轉腫瘤微環境的免疫抑制并使腫瘤對免疫檢查點阻斷敏感的理想手段。當與全身免疫檢查點阻斷（如CTLA-4和PD-1阻斷）相結合時，溶瘤病毒療法的抗腫瘤療效顯著增強[16-17]。此外，轉基因可以通過病毒基因組工程技術插入OV基因組，其中病毒編碼的基因表達可以免疫調節腫瘤，還可以構建表達檢查點抑制性抗體分子的新OV。通過病毒抗體治療（即重組抗體的基因遞送），結合不同模式的直接和間接殺傷癌細胞，增強對腫瘤細胞的局部免疫應答[18-20]。

抗腫瘤是免疫系統的多個組成部分相互協作、共同作用的結果。在腫瘤微環境中，NK細胞等免疫細胞是協調oHSV清除腫瘤細胞的主要參與者。NK細胞通過表面的激活性或抑制性受體直接靶向并殺死外源細胞，其免疫過程不具備抗原特異性和MHC限制性。它已被證明可被招募到腫瘤微環境中，并有助于病毒感染細胞的清除[21-22]。NK細胞表面激活性受體和抑制性受體之間的相互協調、共同作用，決定了其對靶細胞的最終反應[6]。當腫瘤細胞中的激活性配體表達上調時，會結合大量的NK表面激活性受體，從而增強NK細胞的殺傷能力。NK細胞被激活后，除了可以直接殺傷腫瘤細胞外，還可以通過分泌細胞因子和趨化因子，增強其他免疫細胞的殺傷能力。相反，當抑制性受體與相應配體結合時，則減弱了NK細胞的細胞毒性。CD94 / NKG2A異二聚體作為抑制NK細胞反應的重要一員，在腫瘤浸潤處的NK和CD8+T細胞中高表達， 而HLA-E在腫瘤細胞和病毒感染的細胞中過表達[4]。隨著HLA-E的上調，它與抑制性受體的結合成為調控NK細胞活性的主要影響因素，某些腫瘤和免疫性疾病通過該途徑逃避免疫檢查。

通過前期研究發現了oHSV2的主要衣殼蛋白VP5可以引起不同腫瘤細胞HLA-E的上調。有研究報道一些病毒感染的細胞中也發生了HLA-E的表達上調[7-8，23-24]，認為病毒蛋白編碼由人白細胞抗原E（HLA-E）呈遞的肽（如HCMV（人巨細胞病毒）、HCV（丙型肝炎病毒））存在病毒感染引起HLA-E表達上調的現象。HCMV感染細胞后，通過其糖蛋白UL40產生的多肽與HLA-E結合，上調HLA-E在細胞表面的表達，然后通過CD94/NKG2A受體，從而逃脫NK細胞的裂解[7]。Nattermann等在HCV中也發現了類似的機制，HCV導致HLA-E上調，通過其與CD94/NKG2A的相互作用，從而抑制NK細胞的裂解功能[8]。但EBV（Epstein-Barr病毒）能夠產生一種多肽綁定HLA-E分子，破壞NKG2A的識別，導致NK細胞的激活[23]。與自身肽相反，病毒肽可以增強或抑制HLA-E和受體CD94 / NKG2的結合，從而影響NK細胞對靶細胞的殺傷。本研究構建穩定表達VP5蛋白的腫瘤細胞系，并將其作為評估VP5蛋白是否調控自然殺傷細胞（NK）細胞毒性的靶細胞，為后續oHSV2抗腫瘤作用機制研究奠定了基礎。

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Construction of A Human Cervical Cancer Cell Line Containingthe Main Capsid Protein VP5 of Stable OncolyticHerpes Simplex Virus Type Ⅱ

FAN Jiaqi ， ZHANG Hui， LI Le， ZHOU Qin， WANG Yang，HU Han， LIU Binlei

（School of Biological Engineering and Food Science， Hubei Univ. of Tech.， Wuhan 430068， China）

Abstract： This paper aims to establish a human cervical cancer HeLa VP5 cell line stably expressing the main capsid protein （VP5） of oncolytic herpes simplex virus type Ⅱ， and to lay a foundation for exploring whether VP5 protein regulates the cytotoxicity of natural killer cells （NK）. To this end， pPBDP-UL19 and pSPBT plasmids were transferred into HeLa cells by using piggyBac transposition system and lipofectamine 3000 TM liposome transfection method; Purinomycin （Puro） was used to screen stable cell lines; Monoclonal cells were obtained by finite dilution method; Western blot was used to identify the expression of VP5 protein in HeLa VP5 cell line; The expression of GFP in HeLa VP5 was detected by flow cytometry; Live cell real time monitoring method was used to compare the growth activity changes of cell lines before and after transformation. The results show that three HeLa VP5 monoclone cells were obtained by purinomycin resistance screening and limited dilution selection; Western blot showed that VP5 protein was expressed in three HeLa VP5 cell lines; The positive rate of GFP was 99% by flow cytometry; The live cell real time monitoring method showed that the HeLa" VP5 cell line had the same growth activity as the parent cell HeLa cells. The HeLa VP5 stably transfected cell line has been successfully constructed as a target cell to evaluate whether VP5 protein regulates the cytotoxicity of natural killer cells （NK）， providing a theoretical basis for revealing the mechanism of oHSV2's anti-tumor effect.

Keywords： oncolytic herpes simplex virus type Ⅱ; Main capsid protein; Stable cell line

［責任編校： 張 眾］