頭孢菌素菌渣有機肥對玉米土壤中耐藥菌及相關(guān)抗性基因的影響

摘 要：【目的】研究頭孢菌素菌渣有機肥施用后對玉米農(nóng)田土壤中耐藥菌及相關(guān)抗性基因豐度的影響，為頭孢菌素菌渣有機肥施用生物安全性評價提供科學(xué)依據(jù)。

【方法】設(shè)置不施菌渣有機肥（CK）、施用菌渣有機肥500 kg /667m2（B1）、1 000 kg /667m2（B2）3個處理，分別采用可培養(yǎng)方法和實時熒光定量檢測，分析各處理下玉米農(nóng)田中耐藥菌及相關(guān)抗性基因豐度變化。

【結(jié)果】施用頭孢菌素菌渣有機肥能顯著提高玉米苗期和結(jié)果期土壤中細(xì)菌總數(shù)及苗期時頭孢拉定耐藥菌菌數(shù)。獲得了主要抗生素耐藥菌株 41 株，其中，頭孢拉定耐藥菌 8 株，分屬于6個屬。

【結(jié)論】施用頭孢菌素菌渣有機肥能顯著提高玉米苗期土壤中各ARGs基因的相對豐度，但在結(jié)果期各處理間β-內(nèi)酰胺類 ARGs基因blaTEM相對豐度無顯著影響，并對其它耐藥基因無明顯規(guī)律性影響。

關(guān)鍵詞：頭孢菌素菌渣；玉米土壤；耐藥菌；ARGs；q-PCR

中圖分類號：S512 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-4330（2024）04-1003-08

0 引 言

【研究意義】抗生素菌渣處理處置方法主要通過物理化學(xué)或生物處理，如焚燒、填埋、堆肥、厭氧消化、高溫高壓熱水解、微波、堿處理以及電離輻照等方法，實現(xiàn)菌渣的無害化處理。通過堆肥、厭氧消化、高溫高壓熱水解等處理能有效降低菌渣中殘留抗生素，進而資源化利用。【前人研究進展】抗生素生產(chǎn)過程中會形成菌渣［1］。目前，我國抗生素原料藥β-內(nèi)酰胺類抗生素的使用量較大［2，3］。頭孢菌素是一種最為常見的β-內(nèi)酰胺類抗生素［3，4］。菌渣科學(xué)處理已受到關(guān)注［5-11］。【本研究切入點】目前尚缺少抗生素菌渣肥料化施用土壤后生態(tài)風(fēng)險評估等相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)規(guī)范。有研究表明施用頭孢菌素菌渣有機肥后，玉米土壤真菌豐富度和優(yōu)勢度顯著降低，潛在致病菌數(shù)量下降，但對玉米土壤耐藥菌及其抗性基因的影響尚不清楚，有待深入研究［12］。因此，有必要研究頭孢菌素菌渣有機肥施用后對玉米農(nóng)田土壤中耐藥菌及相關(guān)抗性基因豐度的影響。【擬解決的關(guān)鍵問題】在玉米田設(shè)置不同菌渣有機肥施用量處理，在玉米主要生長期檢測土壤中的抗生素抗性菌數(shù)量和種類，研究不同種類抗生素抗性基因的豐度變化，分析菌渣有機肥施用后農(nóng)田抗性菌及ARGs基因豐度的變化，為頭孢菌素菌渣有機肥施用后對農(nóng)作物土壤生物安全性評價提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗設(shè)在新疆伊犁（37°20′N，116°38′E），選用遼作1號為玉米品種供試，施用肥料為某生物制藥企業(yè)頭孢菌素菌渣無害化處理后制得的有機肥。

1.2 方 法

1.2.1 試驗設(shè)計

設(shè)置不施藥渣有機肥對照組（CK），頭孢菌素菌渣有機肥施用量500 kg /667m2處理組1（B1），施用量1 000 kg /667m2處理組2（B2），每個處理組面積約為1 334 m2。播種前，將頭孢菌素菌渣有機肥作為底肥于當(dāng)年春季施入試驗田，并取樣測定土壤頭孢菌素及理化性質(zhì)。表1

1.2.2 樣品采集

選擇在玉米的出苗期和結(jié)果期，按照“梅花五點”法，在每個處理小區(qū)選取5個典型樣方，采集表層（0～20 cm）土壤，剔除石頭、雜草等雜質(zhì)后，土樣用四分法充分混勻后保留2 kg，隨即放入裝有冰袋的采樣箱運回實驗室，在24 h內(nèi)計數(shù)抗生素耐藥菌，剩余土壤樣品-80℃保存，備用。

1.2.3 細(xì)菌的培養(yǎng)與計數(shù)

取 10 g 土壤樣品，置于 100 mL 無菌生理鹽水中，120 r /min條件下振蕩 10 min，靜置 5 min，取 1 mL 土壤懸液按 10 倍系列稀釋后，取適宜稀釋度土壤懸液100 μL，涂布于相應(yīng)培養(yǎng)基平板上，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，并進行菌落計數(shù)。其中，總菌數(shù)計數(shù)使用營養(yǎng)瓊脂平板，耐藥菌的計數(shù)和篩選采用 50 μg/mL的硫紅霉素、青霉素、頭孢拉定的抗性營養(yǎng)瓊脂平板。

1.2.4 耐藥細(xì)菌的挑選及分子鑒定

耐藥菌挑選根據(jù)抗性平板中菌落形態(tài)、顏色、大小等進行挑選，并在對應(yīng)的抗性平板上劃線純化，于30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，連續(xù)純化培養(yǎng)，直至獲得單菌落。

純化后單菌落采用菌落 PCR 方法，選用細(xì)菌 16S rDNA 序列通用引物 27F 和 1492R 進行耐藥菌 PCR 擴增［13］。PCR 產(chǎn)物經(jīng)天根膠回收試劑盒（TIANgel Midi Purification Kit）切膠純化后，送至生工生物工程（上海）有限公司進行測序，測序所得菌株序列到 NCBI 數(shù)據(jù)庫與BLAST 進行比對。

1.2.5 ARGs檢測基因及擴增

選取典型耐藥基因β-內(nèi)酰胺類ARGs（blaTEM）、紅霉素類 ARGs（ermB、ermF）、磺胺類 ARGs（sul1、sul2）等5種作為目標(biāo)檢測基因，并由生工生物工程（上海）有限公司合成。

以快速提取試劑盒（Fast DNA Spin Kit for Soil）提取土壤總 DNA 為模板，參照王佳佳［14］、朱玥晗［15］方法，進行 ermB、ermF、blaTEM、sul1、sul2目的基因的 PCR 擴增。PCR 產(chǎn)物經(jīng)切膠純化后，送至生工生物工程（上海）有限公司測序，測序所得序列經(jīng)NCBI 數(shù)據(jù)庫進行 BLAST 比對產(chǎn)物準(zhǔn)確性。表2

1.2.6 不同ARGs的qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

抗性基因PCR 純化產(chǎn)物與 pMD19-T 載體連接，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌 DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，涂布于50 μg/mL 氨芐青霉素抗性培養(yǎng)基平板，37℃恒溫培養(yǎng)。挑取潛在陽性單克隆，接種于含 50 μg/mL 氨芐青霉素抗性的 LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 震蕩培養(yǎng)過夜，采用天根質(zhì)粒小提試劑盒（TIAN Pure Midi Plasmid Kit）提取質(zhì)粒，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

對鑒定正確的抗性基因質(zhì)粒，采用 Biotek Epoch 微孔板分光光度計（美國） 檢測濃度以及純度，根據(jù)濃度值計算基因拷貝數(shù)［16］。質(zhì)粒 DNA 按 10 倍梯度稀釋作為定量標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)模版，參照 qPCR 試劑盒（Quanti Nova SYBR Green PCR Kit）條件進行擴增，反應(yīng)體系為：2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，F(xiàn)orward Primers 0.25 μL，Reverse Primers 0.25 μL，QN ROX Reference Dye 2 μL，模板 1 μL，ddH2O 7.5 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性 4 min，94 ℃，30 s；54 ℃， 30 s；72 ℃，30 s；30 個循環(huán)；72℃終延伸 10 min。分析各基因序列在不同濃度 PCR 擴增的 Ct 值。以拷貝數(shù)的 log 值為橫坐標(biāo)，Ct 值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算曲線方程。

1.2.7 土壤ARGs的定量

分別以各土壤 DNA 為模版，進行不同基因qPCR 擴增。待 qPCR 擴增結(jié)束后，明確各土壤樣品 qPCR擴增的 Ct 值，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到土壤樣品中目的基因的絕對含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用 Excel 軟件對常規(guī)數(shù)據(jù)進行整理、匯總，采用 SPSS 19.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，選用 GraphPad Prism 8.0.1 進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對土壤細(xì)菌數(shù)量的影響

研究表明，玉米不同生育期可培養(yǎng)細(xì)菌菌落數(shù)及抗生素耐藥菌菌落數(shù)之間存在一定差異。在苗期土壤樣品中，施加了頭孢菌素菌渣有機肥的土壤細(xì)菌總數(shù)、頭孢拉定耐藥菌和硫紅霉素耐藥菌均顯著高于對照組，而青霉素耐藥菌菌落數(shù)差異不顯著；到了結(jié)果期，施加了頭孢菌素菌渣有機肥的土壤中細(xì)菌總數(shù)呈現(xiàn)顯著增加，而硫紅霉素耐藥菌顯著降低，而關(guān)孢拉定耐藥菌數(shù)量與對照組無顯著差異。表3

2.2 土壤中抗生素耐藥菌的種屬構(gòu)成

研究表明，共獲得各類耐藥菌株 41 株，其中，頭孢拉定耐藥菌 8 株，青霉素耐藥菌 30 株，紅霉素耐藥菌 3 株。共獲得 8 株頭孢拉定耐藥菌，分布于 6 個種屬，其中假單胞菌屬和短桿菌屬各 2 株，占總菌株數(shù)的 25%；所得青霉素耐藥菌株為11 個菌屬，其中，鏈霉菌屬菌株數(shù)最多，達(dá)到 14 株，占總菌株數(shù) 的 46.67%；獲得 3 株紅霉素耐藥菌，其中 2 株為假單胞菌。表4

2.3 不同 ARGs 及16S rDNA標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

研究表明，各擴增基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程相關(guān)系數(shù) R2均高于 0.99，各基因濃度與 qPCR 的 Ct 值線性相關(guān)性較好。表5

2.4 施用有機肥后土壤中 ARGs 的絕對豐度

研究表明，施用頭孢菌素有機肥后，土壤中細(xì)菌總數(shù)在苗期影響不顯著，而在結(jié)果期是B1處理較其它處理存在顯著增加。在抗生素耐藥性基因方面，玉米不同生長時期各類 ARGs 之間存在一定差異，不同處理下 β-內(nèi)酰胺類ARGs（blaTEM）拷貝數(shù)均明顯高于紅霉素類 ARGs（ermB、ermF）和磺胺類 ARGs（sul1、sul2）。在出苗期，BlaTEM絕對拷貝數(shù)隨著有機肥施用量的增加顯著增加，而到結(jié)果期時，僅B2處理較其它處理存在顯著差異。磺胺類ARGs基因sul1、sul2的拷貝數(shù)在苗期時存在一定程度的降低，而在結(jié)果期時明顯增加，尤其是B2處理較其它處理顯著增加。紅霉素類 ARGs基因ermB、ermF拷貝數(shù)對各個處理的不同時期均表現(xiàn)出差異不顯著。表6

2.5 施用有機肥后土壤中ARGs的相對豐度

研究表明，施用了頭孢菌素菌渣有機肥的玉米土壤中，各 ARGs基因相對豐度之間存在明顯差異；苗期玉米土壤中各ARGs（blaTEM）基因隨著施用量的增加相對豐度顯著增加，其中， blaTEM在低量添加B1處理中相對豐度較對照CK表現(xiàn)為顯著（P＜0.05），在低量添加B1處理中相對豐度較對照CK表現(xiàn)為較顯著（P＜0.01）；而紅霉素類 ARGs基因ermB、ermF和磺胺類 ARGs基因sul1、sul2相對豐度表現(xiàn)出極顯著（P＜0.000 1）。在結(jié)果期，各處理中blaTEM相對豐度較對照CK差異不顯著；紅霉素類 ARGs基因ermB、ermF相對豐度均表現(xiàn)出高添加B2處理較對照CK極顯著增加（P＜0.000 1）；磺胺類 ARGs基因sul1、sul2相對豐度卻在不同處理表現(xiàn)不同，sul1相對豐度在低添加B1處理時較對照呈現(xiàn)極顯著增加（P＜0.000 1），而sul2相對豐度在高添加B2處理時較對照呈現(xiàn)極顯著增加（P＜0.000 1）。圖 1～3

3 討 論

3.1

抗生素菌渣通過有效處理進行肥料化可實現(xiàn)資源再利用，但是，如果菌渣在發(fā)酵過程中處置不完全，生產(chǎn)的有機肥中可能會有殘留抗生素和中間代謝產(chǎn)物等［17，18］。試驗所施用的頭孢菌素菌渣無害化處理制得有機肥作為底肥的玉米田后，均未發(fā)現(xiàn)頭孢菌素殘留，其菌渣無害化肥料處理較為有效。

3.2

盡管在菌渣有機肥發(fā)酵無害化處理可以有效降解殘留抗生素或中間代謝產(chǎn)物，但發(fā)酵過程中菌渣殘留抗生素和中間代謝產(chǎn)物會對相關(guān)抗性菌群篩選和富集，可帶來潛在抗生素耐藥基因的富集和污染［5，6］。不同無害化處理過程對菌渣中抗生菌耐藥基因的影響不同，其形成的有機肥對環(huán)境影響也不同。周睫雅［3］對頭孢菌素菌渣肥料化利用進行分析，發(fā)現(xiàn)通過水熱預(yù)處理噴霧干燥菌渣肥無抗生素殘留檢測出，但施用有機肥處理組中菌落總數(shù)明顯升高，菌群組成發(fā)生明顯變化，檢測的所有抗性基因和可移動元件相對豐度均高于對照組，但與施用其它有機肥相比無顯著差異。張濤等［9］對頭孢菌素發(fā)酵菌渣利用電子束輻照-好氧堆肥無害資源化處理后，發(fā)現(xiàn)堆肥10 d抗生素殘留即無法液相色譜檢出，但堆肥過程中抗性基因erm B豐度有所減小，sul2豐度升高，有機肥施用過程中，對陸地生態(tài)系統(tǒng)基本無害。研究中，施加頭孢菌素菌渣有機肥的玉米不同生長期的土壤細(xì)菌總數(shù)顯著高于對照組，其結(jié)果與Zhou等［19］報道一致；但采用實時熒光定量PCR檢測其細(xì)菌總數(shù)增加不顯著，表明通過施肥有效提升土壤中可培養(yǎng)菌群的數(shù)量，但土壤中總體微生物數(shù)量增加有限。

3.3

對耐藥基因相對豐度進行分析，發(fā)現(xiàn)在玉米苗期土壤中β-內(nèi)酰胺類 ARGs基因blaTEM、紅霉素類 ARGs基因ermB、ermF和磺胺類 ARGs基因sul1、sul2相對豐度較對照CK均表現(xiàn)出顯著增加，與周睫雅［19］相關(guān)研究一致。平然［20］也發(fā)現(xiàn)施用硫酸新菌素菌渣有機肥可明顯提高硫酸新霉素抗性基因acc（6’）ib相對豐度，但顯著低于商品有機肥施用土壤，相關(guān)耐藥性基因的增加可能因有機肥的施入通過肥效作用激活相關(guān)微生物，導(dǎo)致土壤微生物群落組成的改變，提高土壤中相關(guān)耐藥菌的增加，進而導(dǎo)致相關(guān)耐藥基因增加。在研究玉米結(jié)果期時，β-內(nèi)酰胺類 ARGs基因blaTEM相對豐度與對照相比差異不顯著，其它相關(guān)耐藥性盡管在各處理中也有不同程度的顯著增加，但與施肥量呈現(xiàn)規(guī)律性對應(yīng)。

4 結(jié) 論

施用不同濃度的頭孢菌素菌渣有機肥能顯著提高玉米不同時期的細(xì)菌總數(shù)，明顯提高了苗期時頭孢拉定耐藥菌菌數(shù)。獲得了主要抗生素抗性菌株耐藥菌株 41 株，其中，頭孢拉定耐藥菌 8 株，分屬于6個屬。施用頭孢菌素菌渣有機肥對玉米苗期土壤中三種常見ARGs的相對豐度有顯著提高，在結(jié)果期對β-內(nèi)酰胺類 ARGs基因blaTEM相對豐度無顯著影響。

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