工業循環冷卻水中異養菌檢測方法的影響因素分析

摘" 要：為更準確地測定循環冷卻水中異養菌的含量，有效地控制工業循環冷卻水中微生物的生長與繁殖，該課題進行工業循環冷卻水異養菌的工藝影響因素的研究。通過分析培養溫度、培養時間、培養基pH對菌落計數的影響，確定最佳的培養細菌因素工藝參數，并通過對比工業循環冷卻水中的細菌總數和黏泥中的細菌總數，確定控制工業循環冷卻水的細菌總數最佳方案。

關鍵詞：工業循環冷卻水；異養菌；稀釋度；pH；細菌總數

中圖分類號：TQ085" " " 文獻標志碼：A" " " " " 文章編號：2095-2945（2023）16-0066-05

Abstract： In order to more accurately determine the content of heterotrophic bacteria in circulating cooling water and effectively control the growth and reproduction of microorganisms in industrial circulating cooling water， the technological factors affecting heterotrophic bacteria in industrial circulating water were studied. By analyzing the effects of culture temperature， culture time and culture pH on colony count， the best process parameters of cultivating bacteria were determined， and the best scheme to control the total number of bacteria in industrial circulating cooling water was determined by comparing the total number of bacteria in industrial circulating cooling water and the total number of bacteria in slime.

Keywords： industrial circulating cooling water; heterotrophic bacteria; dilution; pH; total number of bacteria

在工業循環冷卻水中，異養菌不僅生長繁殖最快，而且為數比較多。這類菌群能產生致密的黏液，黏附水中細小的懸浮物和其他絲狀菌、霉菌、藻類及原生動物，從而形成黏泥。工業循環水在運行的過程中會投加相應的緩蝕阻垢劑，目前緩蝕阻垢劑的成分大部分以有機磷為主。磷為微生物的成長提供了能源，如在不加殺菌劑的情況下容易導致循環冷卻水中異養菌的大量繁殖。異養菌的大量繁殖，必然導致黏泥增多。異養菌及生物黏泥的增多，為鐵細菌、硫細菌、硫酸鹽還原菌的生長提供了良好的環境，促進了其生長，進而加劇了黏泥的生長。

而工業循環冷卻水系統運行多年后，黏泥容易附著在管壁上，一方面影響換熱器的換熱效率，影響生產。另一方面，異養菌形成的黏泥含有酸性的代謝產物，比如硫細菌能氧化硫化氫生成硫酸，產生強酸，硫酸鹽還原菌的代謝產物為H2S，也為酸性物質，容易引起管道發生電化學反應，從而引起垢下腐蝕的作用。鐵細菌吸收水中亞鐵鹽，促使管路中鐵質更多地溶于水中，從而加速了管道的腐蝕。因此，工業循環冷卻水中異養菌的測定是非常重要的。目前異養菌的檢測方法包括：TTC營養瓊脂法、快速熒光法、膜過濾法等，但是由于其成本比較高，沒有普遍運用，而目前國內工業循環冷卻水系統中異養菌的檢測方法通常是采用平皿計數法。本文主要研究影響工業循環冷卻水異養菌檢測方法的影響因素，并且通過進一步優化檢測條件，更準確地測定循環冷卻水中異養菌的含量，對有效地控制工業循環冷卻水中的微生物的生長與繁殖具有重要的意義。

1" 實驗方法

1.1" 基本步驟

用滅菌過的研缽加入無菌石英砂充分研磨，用25號浮游生物網收集循環冷卻水的黏泥，定容到無菌的1 000 mL容量瓶中，用5 mL無菌吸管吸取5 mL水樣注入到45 mL生理鹽水中，充分搖均，得到稀釋度為10-1，以此類推，得到10-2、10-3。

接種培養：接種不同稀釋度的水樣到培養皿中，每皿接種1 mL，每個稀釋度接種3皿，空白實驗1組接種生理鹽水。然后灌入冷卻至45 ℃左右的培養基，充分混均。待冷卻后于培養箱中倒置培養，實驗方案按照表1執行。

1.2" 循環冷卻水中細菌總數與黏泥中細菌總數的對比

1）分別采集某A、B、C循環水廠的循環冷卻水，用5 mL無菌吸管吸取5 mL水樣注入到45 mL生理鹽水中，充分搖均，得到稀釋度為10-1，以此類推，得到10-2、10-3。然后接種和培養過程同1.1一樣。

2）用25號浮游生物網分別收集循環冷卻水A、B、C廠的黏泥，用滅菌過的研缽加入無菌石英砂充分研磨黏泥，定容到無菌的1 000 mL容量瓶中用5 mL無菌吸管吸取5 mL水樣注入到45 mL生理鹽水中，充分搖均，得到稀釋度為10-1，以此類推，得到10-2、10-3。接種培養的方法同1.1的方法。

2" 結果與討論

2.1" 培養基pH對細菌總數的影響

以培養基pH為橫坐標，對應的細菌總數為縱坐標，得到不同pH影響細菌總數的曲線圖，如圖1所示。

由圖1可以看出，黏泥中的細菌總數隨著培養基的pH增大先上升后下降，pH為7時培養的細菌總數最多。充分看出循環冷卻水中的大部分異養菌的pH控制在7左右的條件下生長和繁殖比較旺盛，pH過低或過高都不利于工業循環冷卻水中異養菌的生長和繁殖。

2.2" 培養溫度的影響

以培養溫度為橫坐標，對應的細菌總數為縱坐標，得不同培養溫度對細菌總數影響的曲線圖，如圖2所示。

由圖2可知，不同的培養溫度對黏泥菌落計數的結果有較大的影響。細菌總數隨著培養溫度的增高先上升后下降，培養溫度在30～40 ℃時細菌總數最多，50～60 ℃時細菌總數下降很明顯，這是因為在酶能承受的溫度范圍之內，一般生物酶的最大活性溫度為35～40 ℃。溫度太高會導致細菌中酶的活性和酶的形成，可使細菌的細胞損傷或致死。因此培養溫度選擇在30～40 ℃較適宜。

2.3" 培養時間的影響

以培養時間為橫坐標，對應的細菌總數為縱坐標，得到不同培養時間對細菌總數影響的曲線圖，如圖3所示。

綜合各項因素由圖3可知，通過實驗表明，不同的培養時間對菌落計數的結果有一定的影響。培養1 d和培養2 d的黏泥菌落總數結果有較明顯的差異，培養3 d后黏泥菌落總數繼續稍有增多。第4、第5天后基本和第3天成一個平臺，黏泥細菌總數基本穩定不變。且經過培養1 d后，黏泥菌落形態很小，不易辨認，容易漏掉，培養2 d后，菌落變大，也容易辨認。因此對于黏泥菌落總數的培養時間盡可能選擇培養3 d，這樣可確保菌落數的準確性，有利于反映循環冷卻水中菌落總數的水平。

2.4" 循環冷卻水中細菌總數與黏泥中細菌總數的對比

由表2可知，工業循環冷卻水中黏泥中的細菌總數比循環冷卻水中的細菌總數要多得多。

2.5" 生理鹽水用量對異養菌數量的影響

2.5.1" 精密度實驗

在本試驗的培養基中得到了5份供試品溶液，并在不同的溫度和pH環境下進行測量，對5個培養基的標準平皿計數正確度和相對標準偏差（RSD）及均值進行了計算（表3），說明其精密度達標。

2.5.2" 重復性實驗

反復5次對培養基進行測量，確定標準平皿計數正確度，RSD為0.9%（表4），重復性優良。

2.5.3" 穩定性實驗

把收集來的黏泥各自靜置1、2、4、8、12和24 h后用來測定，并記錄標準平皿計數正確度值，結果見表5穩定性實驗結果，最后得出RSD為1.3%，所得結果表明穩定性情況優良。

2.5.4" 單因素實驗

1）生理鹽水的影響。稱取黏泥5 mL，之后把40倍量的生理鹽水加入其中并回流培養1 h，培養2次，選取95%、70%、55%和40%的生理鹽水分析其對異養菌數量的影響，通過整理后得到表6的數據。

2）生理鹽水量的影響。從表6可以看出，呈現明顯負相關：養菌數量和生理鹽水從最初的95%一直下降到70%，當生理鹽水的濃度下降時，數量就會相應地提升。而如果最初生理鹽水的濃度為70%，一直到40%這一范圍，又說明其與數量之間為正相關的關系。隨著生理鹽水濃度的下降，數量也會下降。

最后得出，生理鹽水溶液濃度為70%的時候就處于數量的峰值，數量為11.62%

將處理好的樣水分為5份且各稱取5 ml，各自放進去倍量是20、40、60、80和100的生理鹽水，采用平皿培養法培養2次，總計1 h。用70%的生理鹽水來分析其對異養菌數量的影響，通過整理后得到表7的數據。

從表7可以看出，使用70%的生理鹽水遇到不同倍數后發現異養菌數量也會不一樣。如果是正相關時，倍量與數量處于20～60的倍量之間，會因為倍量的提升數量也會升高；具有明顯負相關時，會在60～100的倍量范圍內，會因為倍量的增加而使數量下降。

最后表明，倍量在60并且生理鹽水是70%濃度的生理鹽水時，數量達峰值為11.64%。

3）培養時間的影響。為了研究培養時間對異養菌數量的影響，本研究選取5 mL樣水，并在其中加入70%濃度的生理鹽水、60的倍量，各自進行30、60、120、180和240 min的回流法培養2次，然后觀察數量和時間的關系，最后所得見表8。

從表8可以看出，當數量增加時，回流時間是在30 ～180 min，并且依然是70%的生理鹽水濃度、60的倍量。但當異養菌數量降低時則處于240 min。

綜上所得，數量最高時的條件是180 min、生理鹽水的濃度為70%，倍量為60倍，最佳數量是11.63%。

4）培養次數的影響。取經過處理的樣水5 mL并在其中加入70%濃度的生理鹽水、60的倍量且回流時間為180 min，對培養次數帶來的影響進行了分析，總共培養了5次，培養的結果詳見表9所示的數據。

從表9可知，相同的條件下異養菌數量和次數有著相關性：正相關時的次數為1～2次，隨著次數的增高數量也隨之增高；呈負相關時的次數為2～5次，增長量會因為次數的增高而降低。

由此可知，在以上條件相同時，且培養次數是2次時數量達到最高，為11.67%。

2.5.5" 正交實驗法

在做完上述實驗后，開始正交實驗，3次平行實驗為1組，共為9組，算出平均值。設計L9（34）正交實驗。各因素如上實驗。最后得出最好的培養條件再進行驗證，最終見表10—表12。

由表10和表11可知，數量最高是12.295%，而條件為：培養次數為2次，培養時間為180 min，70%濃度的生理鹽水溶液。

然后根據表11正交實驗表得出的結論如下，R極差值中，最大的是B，為23.257；最小的是D，為0.077；僅次于B的是C，為8.564；僅次于C的是A，為4.253，換言之：Bgt;Cgt;Agt;D。從數量來說影響最大的是生理鹽水量（B），之后才是培養時間、生理鹽水和培養次數。最終由表12的結果可知，計算出的數值可信度高，具有明顯顯著度。

為了確保菌落生長與科學計數，在本項目中，還采用了PCA-TTC顯色法對水中的異養菌數量進行了測定。利用標準平皿計數法，采用平板技術培養基來替代傳統的營養瓊脂培養基，再在平板技術培養基中加入TTC（2，3，5-氯化三苯基四氮唑），使得菌落成為紅色，借助正交實驗顯色與計算結果，確定TTC在平板計算培養基中的最適合濃度，培養72 h后得出結果。結果說明：循環冷卻水中的水樣測定，相較于標準的NA平皿計數法，在卡方檢驗后，得到P＞0.05，2種方法雖然沒有差異，但是本研究的檢出率更高，且容易辨別，能促進受損細菌的恢復，將顆粒物與氣泡干擾有效地降低。

3" 結論

本論文研究了工業循環冷卻水中異養菌測定主要的影響因素，通過單因素實驗確定了其最佳檢測條件。并且分別對比了循環冷卻水中的細菌總數與黏泥中的細菌總數，得到的主要結論如下。

1）在培養基的pH為7、培養溫度在30～40 ℃，連續培養3 d后，得到的菌落數比較準確。

2）工業循環冷卻水中細菌總數的測定一般是測定黏泥中的細菌總數，通過控制黏泥的細菌總數來判斷工業循環冷卻水中異養菌是否超標。這樣有利于指導系統殺菌劑的投加，規范工業循環的管理，確保循環冷卻水中微生物達標，降低微生物對管道的腐蝕。

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