‘清水’紫花苜蓿根際細菌群落結構對銅鎳脅迫的響應

摘要：為研究銅鎳脅迫對‘清水’紫花苜蓿（Medicago sativa ‘Qingshui’）根際的影響，本文以甘肅金昌市金川區農田銅鎳污染的土壤（Cu 324.1 mg·kg^-1、Ni 271.1 mg·kg^-1）為研究對象，以耐銅鎳植物‘清水’紫花苜蓿為供試材料，采用溫室盆栽試驗法，研究了不同濃度的銅鎳復合溶液（0，100，200，400，800，1 600 mg·kg^-1）處理對根際土壤理化、生物學性質及細菌群落的影響。結果表明：隨銅鎳脅迫濃度增大，紫花苜蓿根際土壤水分含量、Cu²⁺、Ni²⁺含量均升高；根際土壤速效氮、磷、鉀、微生物量碳、氮、磷及有機質含量均先升后降；根際土壤pH值和土壤酶活性下降；細菌群落豐富度與多樣性指數先增后降，當銅鎳脅迫濃度為800 mg·kg^-1時增至最大；變形菌門、放線菌門、酸桿菌門、擬桿菌門和芽單胞菌門為優勢菌門，且變形菌門和擬桿菌門的相對豐度顯著增加，放線菌門和酸桿菌門的相對豐度顯著降低。通過冗余分析和Monte Carlo置換檢驗表明，土壤水分含量、速效鉀和過氧化氫酶是銅鎳脅迫環境下‘清水’紫花苜蓿根際細菌群落結構變化的主導因子。

關鍵詞：銅鎳脅迫；根際土壤；細菌群落；土壤微生物生物量碳

中圖分類號：X53 文獻標識碼：A 文章編號：1007-0435（2023）07-2170-07

Response of the Structure of Bacterial Community in the Rhizosphere of Medicago sativa ‘Qingshui’ to Copper and Nickel Stress

LIANG Peng-fei1， LI Jing-feng1， NAN Li-li^1*， GUO Quan-en²， CAO Shi-yu²

（1. College of Pratacultural Science， Gansu Agricultural University/ Key Laboratory of Grassland Ecosystem， Ministry of Education， Lanzhou， Gansu Province 730070， China; 2. Soil Fertilizer and Water-Saving Institute， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou， Gansu Province 730070， China）

Abstract：To study the effect of copper and nickel stress on the rhizosphere of Medicago sativa ‘Qingshui’，this paper took the soil contaminated with copper and nickel （the contents of Cu²⁺and Ni²⁺ are 324.1，and 271.1 mg·kg^-1，respectively） in Jinchang area of Gansu as the study object，the effects of different copper and nickel concentrations （0，100，200，400，800，1 600 mg·kg^-1，respectively） on the physicochemical and biological properties and bacterial communities in the rhizosphere soil of alfalfa were investigated by the pot experiment with the material of alfalfa ‘Qingshui’ tolerant to the contamination of copper and nickel. The results showed that with the increase of copper and nickel concentration，the contents of soil moisture，Cu²⁺，and Ni²⁺ in the rhizosphere soil increased;the contents of available nitrogen，available phosphorus，available potassium，microbial biomass carbon，microbial biomass nitrogen，microbial biomass phosphorus，and organic matter in the rhizosphere soil increased first and then decreased;the pH value and soil enzyme activity in the rhizosphere soil decreased. The richness and diversity index of bacterial communities first increase and then decrease，reaching to the peak level under copper and nickel concentration of 800 mg·kg^-1. Proteobacteria，Actinobacteria，Acidobacteria，Bacteroidota，and Gemmatimonadetes were the dominant bacterial groups in the different samples. Through redundancy analysis and Monte Carlo permutation tests，it was found out that soil moisture content，available potassium，and catalase were the dominant factors affecting the changes in bacterial community structure in the rhizosphere of Medicago sativa ‘Qingshui’ under copper and nickel stress.

Key words：Copper and nickel stress;Rhizosphere soil;Bacterial community;Soil microbial biomass carbon

目前，土壤重金屬污染修復與治理是世界各國研究的熱點^[1-2]。重金屬污染因具有隱蔽性、不可逆性和長期性等特點，對植物、動物、人類健康和經濟可持續發展構成重大風險^[3]。甘肅省金昌市有色金屬礦產資源豐富，是全國重要的鎳、銅、鈷生產基地，目前正遭受著較為嚴峻的農田土壤重金屬污染問題^[4]，其中，Cu、Ni污染最為嚴重（平均Cu、Ni含量分別為397.54和340.57 mg·kg^-1），分別是當地土壤背景值的16.5和9.68倍^[5]。利用植物修復重金屬污染土壤的方式，具有環保、高效、成本低等優勢^[6]，其中，牧草因其生長快速、適應性強、生物量大等獨特優勢，成為了重金屬污染土壤生物修復的先鋒植物^[7]。

銅鎳污染可對土壤細菌多樣性產生一定影響^[8-9]，植物修復重金屬污染也可對根際土壤細菌群落組成產生一定影響^[10-11]。根際微生物在污染環境下能促進植物生長并在轉運污染物時發揮重要作用^[12]，土壤重金屬污染可以影響微生物群落結構^[13]。根際細菌對重金屬脅迫極為敏感，細菌與重金屬接觸后可能發生了離子交換、配位化合及氧化還原等化學作用^[14]，使重金屬離子鰲合、沉淀在細菌細胞表面或土壤中^[15]，有效降低重金屬毒性。根際細菌多樣性可作為重金屬污染植物修復效果評價指示標志^[11]。

鎳、銅是生物體必需的微量元素。其中銅、鎳元素的含量高低影響著細胞生理生化反應，對細胞進行的氧化還原反應影響較大^[16-17]；但過量銅、鎳會影響植物生長，并通過食物鏈的傳遞作用間接威脅人類健康。用植物重金屬修復技術是解決土壤重金屬銅、鎳污染問題最簡單、最安全、成本最低的處理方法。

紫花苜蓿（Medicago sativa）能夠有效富集土壤中銅、鎳離子，且對其有一定的耐受性^[18-19]，可較好的修復銅、鎳污染土壤。‘清水’紫花苜蓿是我國首個根莖型紫花苜蓿國審品種，莖平臥或半平臥生長，根頸區寬，根狀莖強大，根莖擴展能力和地上覆蓋面積擴張能力強^[20]，且耐銅鎳能力強^[21]。但是，紫花苜蓿修復土壤銅、鎳污染過程中，土壤微生物群落結構如何響應銅、鎳脅迫鮮有研究。因此，本研究以金川礦區重金屬污染土壤為研究對象，解析不同銅、鎳復合濃度脅迫下紫花苜蓿根際土壤細菌群落組成和多樣性的變化特征，旨在揭示紫花苜蓿根際土壤細菌群落響應銅、鎳脅迫的響應機制，為紫花苜蓿修復銅、鎳污染提供理論依據和技術參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

以前期篩選的耐銅鎳植物‘清水’紫花苜蓿（Medicago sativa ‘Qingshui’，QS）為供試材料^[21]，種子由甘肅農業大學草業學院提供；供試土壤取自甘肅省金昌市金川礦區農田土壤（Ni、Cu背景值分別為271.1和324.1 mg·kg^-1）。將所采集土壤經自然風干后去除雜物待用。

1.2 試驗設計

試驗在甘肅省農業科學院溫室進行，將22.5 kg土壤裝入口徑、底徑、高為34.5 cm×23.0 cm×44.5 cm的花盆中，于2021年4月23日播種經10% H₂O₂溶液消毒后的苜蓿種子，播量為20 kg·hm^-2，播深1～2 cm，共計24盆。出苗后間苗，每盆保留生長一致、分布均勻的幼苗30株，待生長至初花期（10%開花），設置銅鎳混合液濃度分別為0（CK），100，200，400，800，1 600 mg·kg^-1的6個銅鎳復合脅迫濃度梯度，用CuCl₂·2H₂O和NiCl₂·6H₂O轉化成質量，配成1 L溶液，每盆每5 d澆銅鎳復合液500 mL，處理20 d后進行試驗采樣，去除根系外圍土，用細毛刷輕輕刷取根系表面附著的根際土，將每個處理4次重復混合后分為2份，一份保存在4℃冰箱中，用于土壤總DNA和土壤微生物量及酶活性的測定，一份自然風干過2 mm篩后進行土壤化學性質測定。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 根際土壤物理、化學及生物學指標 土壤水分含量（Soil water content，SWC）、pH值、有機質（Soil organic matter，SOM）、速效氮（Available nitrogen，AN）、速效磷（Available phosphorus，AP）、速效鉀（Available potassium，AK）含量等土壤物理、化學指標參考鮑士旦^[22]的方法進行測定。

土壤酶活性測定參考關松蔭^[23]的方法，采用高錳酸鉀滴定法測定過氧化氫酶（Catalase，CAT）活性、采用靛酚藍比色法測定脲酶（Urease，UA）活性、采用氯化三苯基四氮唑比色法測定脫氫酶（Dehydrogensae，DHA）活性、采用磷酸苯二鈉比色法測定堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，APA）活性。根際土壤微生物量碳（Soil microbial biomass carbon，SMBC）^[24]、氮（Soil microbial biomass nitrogen，SMBN）^[25]含量采用氯仿熏蒸法測定。

1.3.2 土壤總DNA提取及細菌16S rRNA基因擴增 采用天根磁珠法對樣本基因組DNA進行提取，用瓊脂糖凝膠電泳對所提取的DNA純度和濃度進行檢測；取適量DNA用無菌水稀釋至1 ng·μL^-1后作為PCR擴增模板，根據擴增區域選用帶Barcode的特異引物，使用適宜的緩沖液和高效高保真酶進行PCR，以確保擴增效率和準確性。用引物515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′）與806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）對其V4區基因片段進行擴增，每個樣品重復3次。反應產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。使用NovaSeq6000進行上機測序（諾禾致源生物信息科技有限公司，北京）。下機數據拆分、過濾后使用FLASH（V1.2.11）^[27]、fastp和Usearch軟件對其進行拼接、質控、嵌合體檢測與去除以得到最終的有效數據（Effective Tags）。

1.4 數據分析

利用Microsoft Excel 2010對試驗數據進行匯總，處理與分析用SPSS 23.0進行單因素方差分析（P＜0.05），采用QIIME2的classify-sklearn算法^[28-29]進行物種注釋與序列比對，采用QIIME2軟件計算Alpha多樣性指數。用CANOCO 4.0軟件進行冗余分析，并用Monte Carlo置換檢驗計算因子的重要性。

2 結果與分析

2.1 根際土壤理化及生物學性質

銅鎳不同濃度對QS根際土壤化學及生物學性質有顯著影響（P＜0.05）（表1）。隨銅鎳脅迫濃度升高，QS的CAT、UA和DHA均顯著降低。銅鎳濃度為1 600 mg·kg^-1時，較CK相比，pH值、CAT、UA、APA和DHA分別下降了8.06%，26.77%，71.43%，37.42%和71.43%；QS的SOM、AN、AP、AK、SMBC、SMBN、SMBP含量均先升高后降低，除AK在銅鎳脅迫濃度為200 mg·kg^-1時達到最高外，其余指標均在銅鎳濃度為100 mg·kg^-1時達到最大峰值，各指標均在銅鎳脅迫濃度為1 600 mg·kg^-1時降至最小；QS的SWC、Cu²⁺和Ni²⁺含量均顯著增加，在銅鎳脅迫濃度為1 600 mg·kg^-1時均增至最大，分別是CK的2.37，1.59，2.21倍。

2.2 根際土壤細菌群落豐富度與Alpha多樣性分析

由表2可知，銅鎳脅迫濃度對QS根際土壤細菌群落豐富度及多樣性影響顯著（P＜0.05）。利用高通量測序，對序列進行篩選、比對與過濾后，QS.CK、QS.100、QS.200、QS.400、QS.800、QS.1 600的有效序列變動范圍為54 077～58 397，有效序列除QS.100顯著、QS.200顯著大于CK，其余處理與CK差異均不顯著；各處理覆蓋度均在99%以上，Chao1、OTUs、Pielou-e、Shannon-wiener和Simpson指數均隨銅鎳脅迫濃度增加呈先增加后降低的變化趨勢，均在銅鎳脅迫濃度為800 mg·kg^-1時增至最大；由圖1可知，所有樣品共有分類單元為975個，其中QS.CK、QS.100、QS.200、QS.400、QS.800、QS.1 600特有的分類單元分別為618，556，688，676，687和660個，且各處理的變化趨勢與有效序列相同。

2.3 根際土壤細菌群落分布

由圖2可知，銅鎳脅迫下苜蓿根際土壤細菌群落相對豐度前十的細菌門分別為：變形菌門（Proteobacteria）（22.53%～33.32%）、酸桿菌門（Acidobacteria）（11.61%～18.39%）、擬桿菌門（Bacteroidota）（7.77%～11.98%）、放線菌門（Actinobacteria）（10.28%～23.34%）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）（6.09%～7.69%）、疣微菌門（Verrucomicrobia）（2.45%～3.13%）、厚壁菌門（Firmicutes）（2.21%～3.42%）、綠彎菌門（Chloroflexi）（4.16%～8.48%）、脫硫菌門（Desulfobacterota）（0.22%～7.16%）、粘球菌門（Myxococcota）（2.94%～5.35%），共占細菌總數的93.82%～95.71%。且變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、芽單胞菌門和擬桿菌門占細菌總數的73.76%～79.15%，表明這5個門為細菌優勢菌群。隨銅鎳脅迫濃度增加，變形菌門、脫硫菌門和擬桿菌門的相對豐度顯著增加（P＜0.05），綠彎菌門、放線菌門和酸桿菌門的相對豐度顯著下降（P＜0.05），粘球菌門的相對豐度先降后增（P＜0.05），疣微菌門、芽單胞菌門和厚壁菌門的相對豐度各處理間無顯著差異。

由圖3可知，各處理細菌群落相對豐度前十的細菌科分別為：芽單胞菌科（Gemmatimonadaceae）（5.82%～7.26%）、Microscillaceae（2.28%～6.95%）、鞘脂單胞菌科（Sphingomonadaceae）（3.34%～8.64%）、Pyrinomonadaceae（1.43%～4.50%）、微球菌科（Micrococcaceae）（1.79%～8.38%）、地桿菌科（Geobacteraceae）（0.16%～6.98%）、亞硝化單胞菌科（Nitrosomonadaceae）（2.95%～3.21%）、噬幾丁質菌科（Chitinophagaceae）（2.17%～3.35%）、Pedosphaeraceae（1.59%～2.27%）、Vicinamibacteraceae （2.49%～3.47%），共占細菌總數的34.26%～41.98%。其中微球菌科、芽單胞菌科、鞘脂單胞菌科、Microscillaceae和Pyrinomonadaceae占細菌總數的23.40%～26.23%，為細菌的優勢菌科。隨銅鎳復合脅迫濃度增加，鞘脂單胞菌科、Microscillaceae和地桿菌科的相對豐度均顯著增加（P＜0.05），Pyrinomonadaceae、微球菌科和噬幾丁質菌科均先增加后降低，Vicinamibacteraceae顯著降低（P＜0.05）；芽單胞菌科、亞硝化單胞菌科和Pedosphaeraceae各處理間差異不顯著。

2.4 根際細菌群落與土壤環境因子間的冗余分析及群落結構差異性分析

冗余分析第一、第二排序軸累計解釋率分別為80.24%和10.39%，能較好地反映銅鎳脅迫下‘清水’紫花苜蓿根際細菌門水平與土壤環境因子間的相互關系（圖4）。置換檢驗結果顯示，CAT、AK、SWC（P＜0.05）的累計解釋率為86.3%，是主導細菌群落變化的前三位主導因子，對細菌群落的變化起至關重要的影響（表3）。根際土壤細菌群落結構差異性分析發現，不同處理土壤樣品中細菌群落均能獨立聚集成簇，且水平坐標軸和垂直坐標軸累積解釋度分別達到了60.18%和11.5%，表明各處理下物種組成結構較為相似，測定數據誤差較小，能有效利用（圖5）。

3 討論

隨銅鎳脅迫濃度增加，Chao1、Pielou-e、Shannon-wiener和Simpson指數表現出先增后減的變化趨勢，在銅鎳脅迫濃度為800 mg·kg^-1時達到最大值。銅鎳脅迫濃度為1 600 mg·kg^-1時，各處理細菌豐富度和多樣性均小于CK，說明銅鎳復合脅迫對‘清水’紫花苜蓿根際細菌生長呈低促高抑作用，這與李大樂等^[8]、王亞等^[30]的研究結果相似。

本研究發現，變形菌門、擬桿菌門、放線菌門、芽單胞菌門和酸桿菌門為銅鎳脅迫下‘清水’紫花苜蓿根際優勢菌門，這與王芳等^[31]對紫花苜蓿根際土壤細菌群落結構的研究結果相同。隨銅鎳脅迫濃度增加，擬桿菌門和變形菌門的相對豐度顯著增加，酸桿菌門和放線菌門的相對豐度顯著降低，這可能是由于變形菌門中多個重金屬氧化酶基因參與重金屬抗性與固定，且參與氮的硝化與反硝化作用為植物提供氮源，進而改善了重金屬脅迫下微生物的生存環境^[32]，這與覃輝等^[33]對銅鎳復合污染環境下李氏禾根際細菌的研究結論相同；擬桿菌門相對豐度增加，表明該菌門可耐受多種重金屬的復合影響，與前人試驗結果相同^[34]。放線菌門能顯著抑制某些植物病原真菌的活性，適應不利環境^[35]，且該菌門和酸桿菌門主要存在于酸性的土壤環境中^[36]，無法在堿性土壤中大量繁殖。因此，本研究中放線菌門和酸桿菌門相對豐度顯著下降，可能是由于供試土壤偏堿性，且銅、鎳離子含量較高，抑制了放線菌門和酸桿菌門細菌群落的生長，與李鵬洋等^[37]的研究相同。

植物根際土壤理化性質與細菌群落結構間相互關系顯著^[38]。冗余分析表明，土壤水分、CAT、AK是影響根際細菌群落的主導因子。土壤含水量通過影響土壤中微生物活性和重金屬存在形態，直接或間接影響重金屬與土壤酶活性間的相互作用關系^[39]。本研究中，根際土壤UA、CAT、DHA和APA活性均下降，說明隨銅鎳脅迫濃度增加，土壤中重金屬富集含量增加，對土壤酶的毒性增強，這與郭全恩等^[2]報道土壤DHA和CAT活性隨銅、鎳含量的增加而降低結果相一致。銅鎳復合脅迫改變了微生物物種組成與結構，對清水紫花苜蓿根際微環境有顯著影響。

4 結論

隨銅鎳脅迫濃度增加，‘清水’紫花苜蓿根際土壤細菌群落多樣性和豐富度、速效磷、速效氮、有機質、微生物量碳氮磷含量均先升高后降低；水分及銅、鎳離子含量增加；pH值、脲酶、堿性磷酸酶、過氧化氫酶和脫氫酶活性顯著降低。變形菌門、放線菌門、酸桿菌門、擬桿菌門和芽單胞菌門為優勢菌門。根際土壤細菌群落結構變化主要受速效鉀、水分和過氧化氫酶的調控影響。

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（責任編輯 彭露茜）