原核DNA甲基化的表觀調控作用的研究進展

關鍵詞：原核；ＤＮＡ 甲基轉移酶；ＤＮＡ 甲基化；甲基化組；基因調控；表觀遺傳

中圖分類號：Ｑ９３３ 文獻標志碼：Ａ 文章編號：１００１-８３９５（２０２３）０４-０４２７-１１

ｄｏｉ：１０． ３９６９ ／ ｊ． ｉｓｓｎ． １００１-８３９５． ２０２３． ０４． ００１

ＤＮＡ 甲基化修飾最早于１９２５ 年在結核桿菌（Ｔｕｂｅｒｃｌｅ ｂａｃｉｌｌｕｓ）的基因組ＤＮＡ 中發現，隨后，在所有的生物中均檢測到存在ＤＮＡ 甲基化修飾［１］． 在真核生物中，ＤＮＡ 甲基化修飾主要以５-甲基胞嘧啶（ｍ５Ｃ）修飾為主，哺乳動物中主要有３ 種ＤＮＡ 甲基轉移酶（ＭＴａｓｅ，ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ），分別為ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ２ 和ＤＮＭＴ３，它們可以催化ｍ５Ｃ 的修飾作用． 據報道，在哺乳動物中，甲基化修飾的核苷酸占基因組比例為２％ ～７％，并且約７０％ 的ｍ５Ｃ 位于串聯的ＣｐＧ 島中［２-３］． 真核的ＤＮＡ 甲基化修飾是表觀遺傳的重要機制之一． 如ＤＮＡ 甲基化可通過招募或阻止轉錄因子與ＤＮＡ 結合，從而調控基因表達；同時，通過從頭甲基化和去甲基化的作用，基因組的甲基化修飾呈現動態變化． 這種變化不僅調控發育過程，而且與癌癥等疾病有關［４-５］．

在原核細菌中，ＤＮＡ 甲基化修飾可發生在腺嘌呤（Ａ）和胞嘧啶（Ｃ）上，分別形成６-甲基腺嘌呤（ｍ６Ａ）、ｍ５Ｃ 和４-甲基胞嘧啶（ｍ４Ｃ），但這些修飾的核苷酸通常位于一個特定的保守基序中． 在細菌中，甲基化修飾的核苷酸在基因組中的比例較真核生物低，占比一般＜ １％ ，而且以ｍ６Ａ 為主，其次是ｍ５Ｃ，ｍ４Ｃ 最少［６-７］． ２０ 世紀６０ 年代，在原核細菌中發現了ＤＮＡ 限制修飾系統（Ｒ-Ｍ），并于１９６４ 年從大腸桿菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）中首次分離純化出ＭＴａｓｅ［８］，自此確定了ＤＮＡ 甲基化修飾的來源，由此發現的ＤＮＡ 限制性核酸內切酶對基因工程技術的建立起到了關鍵的作用［９］．

在原核細胞中，ＤＮＡ 甲基化修飾作為Ｒ-Ｍ 的一個組成部分，其功能主要是作為一種ＤＮＡ 的“標記”，以此識別、保護自身的基因組ＤＮＡ，避免限制酶切割；而外來入侵的噬菌體ＤＮＡ 因為沒有甲基化修飾的“標記”，因此被切割［１０］． 所以，長期以來一般都認為原核的ＤＮＡ 限制修飾系統是一種防御噬菌體侵染的機制． 但是，在許多細菌中，還存在一類孤生（ｏｒｐｈａｎ）的ＭＴａｓｅ，沒有伴隨的限制酶，通過對ＤＮＡ的甲基化修飾，能夠在細胞內參與一些細胞過程． 一個經典的例子就是大腸桿菌的Ｄａｍ （ＤＮＡ ａｄｅｎｉｎｅｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ），它識別ＧＡＴＣ 基序形成ｍ６Ａ 修飾（Ｇｍ ＡＴＣ），可參與調控ＤＮＡ 復制起始等細胞過程［１１］． 隨著三代ＤＮＡ 測序的出現和發展，在細菌基因組中發現了越來越多的甲基化修飾基序，為重新認識和研究細菌甲基化修飾的生物學功能奠定了堅實的基礎［１２-１３］． 本文在簡要回顧細菌中的ＤＮＡ 甲基化酶的種類和ＤＮＡ 甲基化修飾的檢測方法的基礎上，重點綜述近年來有關細菌甲基化修飾在調控各種細胞過程中的作用和分子機制．

１ 細菌的ＤＮＡ 甲基化修飾酶

原核的ＭＴａｓｅ 種類繁多，大部分歸屬于Ｒ-Ｍ系統，根據其結構、切割ＤＮＡ 方式和輔因的不同，將Ｒ-Ｍ 系統分為４ 類［１４-１５］，即ＴｙｐｅⅠ、Ｔｙｐｅ Ⅱ、Ｔｙｐｅ Ⅲ、Ｔｙｐｅ ＩＶ． Ｔｙｐｅ Ｉ 系統由ＭＴａｓｅ （Ｍ）、限制酶（Ｒ）和調節（Ｓ）等３ 種亞基組成，并且Ｒ／ Ｓ 復合體可單獨行使修飾功能；Ｔｙｐｅ Ⅱ 系統通常由２ 個獨立的Ｒ 和Ｍ 亞基構成，并分別具有裂解切割和修飾功能；Ｔｙｐｅ Ⅲ也由Ｒ／ Ｍ^２ 種亞基組成，但限制修飾功能必需由２ 個亞基一起共同作用．

此外，在原核基因組中還廣泛編碼獨立的孤生ＭＴａｓｅ，而且在細菌的種、屬水平上，并不存在保守性［１６］． 因此，不同類群細菌的ＭＴａｓｅ，種類繁多，并且識別不同的ＤＮＡ 基序，催化產生３ 種不同的甲基化修飾．

最近在細菌的另一種宿主防御系統ＢＲＥＸ（ｂａｃ-ｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）中也發現了ＭＴａｓｅ 的存在，該系統中的ＭＴａｓｅ 通過對細菌自身的ＤＮＡ 進行甲基化修飾以識別外來入侵ＤＮＡ，但與限制修飾系統不同的是，ＢＲＥＸ 通過抑制病毒ＤＮＡ 的復制來防御病毒的入侵［１７-１８］．

ＭＴａｓｅ 催化ＤＮＡ 甲基轉移反應，即將供體Ｓ腺苷甲硫氨酸上的甲基轉移到ＤＮＡ 鏈中的胞嘧啶的４位氮原子、５ 位碳原子或腺嘌呤的６ 位氮原子上，分別形成ｍ４Ｃ、ｍ５Ｃ 以及ｍ６Ａ 等３ 種甲基化修飾［１９］．不同的ＭＴａｓｅ 在氨基酸組成和結構上具有一定的保守性，可以對ＭＴａｓｅ 中的氨基酸保守基序進行區分和識別． 根據ＭＴａｓｅ 中的保守結構功能域分析發現，其可分成α、β、γ 等３ 個組（ｇｒｏｕｐ）［２０］，分別包含９個相對保守的基序（Ｉ ～ Ｘ）和一個序列識別域（ＴＲＤ）． 其中，基序Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｘ 組成Ｓ-腺苷甲硫氨酸的結合域；基序ＩＶ ～ ＶＩＩＩ 組成催化域［２１］． 因此，借助保守基序很容易從基因組數據中挖掘并鑒別相關的甲基化基因，但是對其修飾的基序仍不能得到準確的結果．

２ 原核甲基化修飾的分析方法與技術

研究ＤＮＡ 甲基化修飾的表觀遺傳，首先需要鑒定分析甲基化位點． 雖然過去已經發展多種方法和

技術［２２］，但主要是針對真核ｍ５Ｃ 修飾． 例如亞硫酸鹽測序技術的出現和發展［２３］，極大地推動了真核甲基化表觀的研究． 由于細菌基因組中編碼的ＭＴａｓｅ種類繁多，識別ＤＮＡ 基序也不相同，而且甲基化修飾以ｍ６Ａ 為主． 因此，上述方法很少應用于細菌ＤＮＡ 甲基化的研究．

在檢測原核ＤＮＡ 的甲基化修飾時，最早采用高效液相色譜（ＨＰＬＣ）或者色譜分離與質譜聯用（ＬＣ-ＭＳ／ ＭＳ）對基因組ＤＮＡ 降解后的產物進行定性或定量檢測． 如Ｅｈｒｌｉｃｈ 等［７］采用ＨＰＬＣ 技術，分析了２６ 種細菌菌株基因組ＤＮＡ 甲基化修飾的情況，發現９０％的菌株含有ｍ６Ａ，而ｍ４Ｃ 僅出現在少數菌株中，ＨＰＬＣ 技術需要較多的ＤＮＡ 樣品（３ ～１０ μｇ）． 后來，采用更為靈敏的ＬＣ-ＭＳ／ ＭＳ 技術，只需要５ ～１００ｎｇ ＤＮＡ［２４-２５］． 這類方法實驗過程簡便，適用于所有的ＤＮＡ 樣品，并不局限于原核． 該技術要點主要包括利用酶或酸徹底水解ＤＮＡ 樣品，然后通過ＨＰＬＣ分離、分部檢測或通過質譜鑒定甲基化修飾的核苷酸． 色譜分離鑒定技術可以在全基因組水平上分析獲取各種甲基化修飾的種類和相對豐度，但不能獲取修飾位點或序列信息． 因此，很難與細胞的表型和功能聯系起來，并且也不能確定甲基化修飾與特定ＭＴａｓｅ 之間的對應關系．

自從制備能夠特異識別ｍ５Ｃ 和ｍ６Ａ 甲基化修飾的抗體后，酶聯免疫（ＥＬＩＳＡ）技術也用于鑒定ＤＮＡ 樣品中的甲基化修飾． 迄今已有幾種商業化的試劑盒，如Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ 公司的ｍ５Ｃ ＤＮＡ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ、Ｅｐｉｇｅｎｔｅｋ公司的ＭｅｔｈｙｌＦｌａｓｈ Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＤＮＡ ｍ５Ｃ ＱｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ 等，但這類試劑盒大多針對ｍ５Ｃ 修飾，主要應用于真核細胞． ＥＬＩＳＡ 技術操作方便，可以覆蓋全基因組，但是不太穩定，也許只適合于粗略比較不同ＤＮＡ 樣品的甲基化修飾程度，如１． ５ ～２ 倍的差異［２６］．

第三代ＤＮＡ 測序技術，如單分子實時ＤＮＡ 測序（ｓｉｎｇｌｅ-ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ，ＳＭＲＴ）和納米孔（Ｎａｎ-ｏｐｏｒｅ）ＤＮＡ 測序技術的出現，直接推動了原核ＤＮＡ甲基化修飾的研究［２７］． ＳＭＲＴ 測序能夠直接讀取甲基化和非甲基化的核苷酸，在ＤＮＡ 測序的過程中，ＤＮＡ 聚合反應在甲基化修飾的堿基位置會出現“延遲”（ＩＰＤ），從而可通過ＤＮＡ 聚合酶反應在動力學上的差異，分辨不同的甲基化修飾以及正常的４ 種核苷酸［２７］． ＳＭＲＴ 技術［２８］以及納米孔測序平臺［２９］為原核細菌的甲基化和表觀遺傳的研究開辟了一條新的途徑，能夠在基因組的水平上獲取整個表觀遺傳的序列信息、繪制全基因組甲基化組（ｍｅｔｈｙｌｏｍｅ）．例如，Ｂｌｏｗ 等［３０］一次性對２３０ 種不同種屬的細菌進行了ＳＭＲＴ 測序，繪制了全基因組甲基化圖譜，共鑒定出８５８ 個甲基化基序、注釋１ ４５９ 個ＭＴａｓｅ 編碼基因，其中約一半屬于孤生的ＭＴａｓｅ． 自２０１２ 年ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ 和Ｐａｃｉｆｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ 公司的研究小組利用ＳＭＲＴ 技術測序了６ 個原核甲基化組、繪制出全基因組的表觀修飾圖譜［３１］，截至２０２１ 年經甲基化組測序的細菌超過４ ０００ 種［３２］．

第三代ＤＮＡ 測序技術能夠快速解析甲基化修飾位點，但是鑒定相應的ＭＴａｓｅ 仍然是一項極具挑戰的工作． 通過生物信息學的分析，雖然可以推測挖掘得到的ＭＴａｓｅ 與其對應的甲基化修飾基序之間的關系，但是實驗驗證必不可少． 一般常采用生物信息學方法分析找到候選的ＭＴａｓｅ 基因，然后通過遺傳或生化分析，驗證候選的ＭＴａｓｅ 是否能夠催化修飾特異的ＤＮＡ 基序． 例如，通過共表達短小芽孢桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）ＢＡ０６ 菌株中候選的ＴｙｐｅＩ 限制修飾系統的Ｍ／ Ｓ 亞基，通過胞內和胞外生化分析，鑒定了一個新的Ｔｙｐｅ Ｉ 甲基化修飾基序及其限制修飾系統［３３］． 但是這種策略比較費時費力，發展高通量的技術或方法尤為必要． Ｊｅｎｓｅｎ 等［３４］發展了一個基于包含串聯甲基化基序的載體和自動克隆的高通量技術，用于分析了２ 個乙酸細菌（Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ 和Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕ ｍｗｏｏｄｉｉ）中的２３ 個ＭＴａｓｅ 和１２ 個甲基化修飾基序，最后確定了１１ 個基序相對應的ＭＴａｓｅ． 其技術要點包括：１）將ＳＭＲＴ 測序鑒定的甲基化修飾基序串聯克隆在一個載體中；２）將所有候選的ＤＮＡ 甲基轉移酶基因分別克隆上述載體，轉化Ｅ． ｃｏｉｌ，誘導表達ＭＴａｓｅ；３）分別從不同轉化子中提取質粒、合并、線性化；４）將合并的質粒ＤＮＡ 進行ＳＭＲＴ 測序；５）通過序列分析確定一一對應的甲基化基序和ＤＮＡ甲基轉移酶．

３ 甲基化修飾調控ＤＮＡ 錯配修復和細胞周期

Ｄａｍ 是一個經典的孤生ＭＴａｓｅ，能識別修飾基序ＧＡＴＣ． 早期在大腸桿菌和沙門氏菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）中發現，ｄａｍ 基因缺失后會導致細胞發生高頻突變［３５］，這種表型說明ｄａｍ 突變菌株不能及時修復ＤＮＡ 復制產生的錯配． 在正常狀態下，錯配堿基修復系統（ｍｉｓｍａｔｃｈ ｂａｓｅ ｐａｉｒ ｒｅｐａｉｒ ｓｙｓｔｅｍ）負責修復ＤＮＡ 復制產生的錯配堿基． 該系統由ＭｕｔＳ-ＭｕｔＬ-ＭｕｔＨ 這３ 個亞基組成，ＭｕｔＳ 掃描識別錯配的ＤＮＡ，并結合在錯配的ＤＮＡ 上，然后招募ＭｕｔＨ，形成修復復合體． ＭｕｔＨ 在非甲基化ＧＡＴＣ 基序靠近Ｇ 的５′端切割磷酸二酯鍵；ＵｖｒＤ 解旋酶驅離ＭｕｔＨ，并降解單鏈ＤＮＡ，形成一段缺口． 該缺口由ＤＮＡ 聚合酶ＩＩＩ補缺，ＤＮＡ 連接酶封閉切口． 最后，Ｄａｍ 將修復的新鏈甲基化，從而完成錯配堿基的修復． 在ＤＮＡ 復制過程中，舊鏈呈甲基化狀態（ＧｍＡＴＣ），新鏈此時還未甲基化． 因此，舊鏈中的Ｇｍ ＡＴＣ 甲基化修飾相當于一個“標記”，用于錯配堿基修復系統識別并區分新、舊鏈． 如果缺失ｄａｍ，未被甲基化的新、舊兩條鏈均可能被ＭｕｔＨ 切割，因此提高突變頻率［３６］．

在Ｅ.ｃｏｌｉ 中，ＤＮＡ 復制由ＤｎａＡ 蛋白結合復制起點（ｏｒｉ）啟動． ｏｒｉ 序列中包括１２ 個ＧＡＴＣ 位點，并且ＤｎａＡ 只能結合ＧＡＴＣ 全部甲基化的ｏｒｉ，不能結合半甲基化ＧＡＴＣ 的復制起點． 另一個蛋白ＳｅｑＡ能夠結合半甲基化的ｏｒｉ，因此可以保持ｏｒｉ 在一定時間內保持半甲基化狀態，從而延緩新一輪的ＤＮＡ復制． 此外，ＤｎａＡ 自身的表達也受制于Ｄａｍ 甲基化修飾的調控［３７］． ＤＮＡ 甲基化修飾調控細胞周期的另一個經典例子來自于ＣｃｒＭ （ｃｅｌｌ-ｃｙｃｌｅ-ｒｅｇｕｌａ-ｔｅｄ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ），其編碼基因廣泛存在于變形菌綱（Ａｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）中，是新月桿菌（Ｃａｕ-ｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）、根癌農桿菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅ-ｆａｃｉｅｎｓ）、苜蓿根瘤菌（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）和流產布魯氏菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ）等細菌的一個必需基因．新月桿菌是一個二態型的細菌，細胞不對稱分裂后形成２ 種細胞：Ｓｗａｒｍｅｒ 細胞和Ｓｔａｌｋｅｄ 細胞，染色體ＤＮＡ 只能在Ｓｔａｌｋｅｄ 細胞中才能復制． 新月桿菌復制起始位點（Ｃｏｒｉ）存在５ 個ＣｃｒＭ 的識別修飾基序ＧＡＮＴＣ． 在Ｓｔａｌｋｅｄ 細胞中，ＣｃｒＭ 表達，將復制起點完全甲基化，從而啟動ＤＮＡ 復制． 當細胞完成ＤＮＡ 復制和分裂后，ＣｃｒＭ 被降解，因此在形成的新子細胞中，染色體ＤＮＡ 維持一種半甲基化狀態． 此外，另一個調控蛋白ＣｔｒＡ 結合甲基化的復制起點，在Ｓｗａｒｍｅｒ 細胞中抑制ＤＮＡ 復制，并且也調控ＣｃｒＭ 的表達［３７-３８］． 在上述２ 個例子中，復制起點的ＤＮＡ 甲基化修飾被認為是啟動ＤＮＡ 復制的一種分子信號，而且通過與相關蛋白的互作參與調控．

４ 原核甲基化修飾的基因調控功能

在原核細胞中，ＭＴａｓｅ 及其甲基化修飾除了作為限制修飾系統防御外源ＤＮＡ 的入侵之外，越來越多的證據表明，ＤＮＡ 甲基化修飾也能參與或調控許多細胞功能，因此成為原核表觀遺傳研究的一項重要內容． 但與真核相比，相關的研究較為有限，已有的相關研究主要涉及個別的ＭＴａｓｅ 及其甲基化修飾． 隨著細菌甲基化組學的快速發展，許多細菌的ＤＮＡ 甲基化修飾基序的解析，為研究細菌甲基化修飾的生物學功能提供了一個極好的契機．

４． １ 甲基化修飾調控基因表達 ＤＮＡ 甲基化修飾

可能改變ＤＮＡ 結構，進而影響與蛋白質的結合［３９］．目前已發現了幾個轉錄因子，如Ｅ． ｃｏｌｉ 的Ｌｒｐ、ＯｘｙＲ、Ｆｕｒ、ＨｄｆＲ 和新月桿菌的ＧｃｒＡ、ＭｕｃＲ 等與ＤＮＡ 結合時，目標ＤＮＡ 的甲基化狀態會影響其結合作用． 因此，在甲基化修飾位于這些轉錄因子的結合位點，可能調控基因的表達［１１，４０］． 例如，在沙門氏菌（Ｓ． ｅｎｔｅｒｉ-ｃａ）中，ｓｔｄ 菌毛（ｆｉｍｂｒｉａｌ）操縱子在野生菌中不能表達，其啟動子中存在３ 個Ｄａｍ 的甲基化基序（ＧＡＴＣ），敲除ｄａｍ 基因能激活ｓｔｄ 的表達，但需要轉錄因子ＨｄｆＲ． 體外實驗表明ＨｄｆＲ 只能結合無甲基化修飾的啟動子片段，不能結合甲基化修飾的啟動子． 此外，ＨｄｆＲ 與ＳｔｄＥ 和ＳｔｄＦ 形成一個正調控回路［４１-４２］． 在新月桿菌中，σ７０因子的輔因ＧｃｒＡ 能特異結合ＣｃｒＭ 甲基化修飾的ＤＮＡ 位點（Ｇｍ ＡＮＴＣ），并招募ＲＮＡ 聚合酶ＩＩ，激活下游基因的轉錄；ＧｃｒＡ 調控的基因可能超過２００ 個． 進一步的研究表明，ＧｃｒＡ在細胞Ｓ 期還可不對稱激活編碼鏈甲基化修飾的細胞骨架基因（ｃｒｅＳ）［４３-４５］．

在腸桿菌科中，Ｄａｍ 甲基化修飾在調控上述基因時，其作用模式類似于一個雙穩態（ｂｉｓｔａｂｌｅ）的“開／ 關”（ＯＮ／ ＯＦＦ）． 在一些亞群體中處于“開”狀態，另一些亞群體處于“關”狀態，導致形成異質性的亞細胞群體． 最近，西班牙的Ｃａｓａｄｅｓúｓ 團隊［４６］利用單細胞技術重新分析了沙門氏菌中Ｄａｍ 甲基化修飾關聯的基因在Ｄａｍ 敲除、過表達等遺傳背景下的表達，發現１０ 個新的基因依賴于甲基化修飾而表現雙穩態表達模式，而且“開”或“關”亞群體的大小與培養條件有關． 進一步說明甲基化修飾表觀遺傳在調控細菌群體異質性的功能，這可能對細胞適應環境等方面具有重要的意義．

除了上述幾個經典的甲基化修飾的調控，近來在其他細菌中也陸續發現了一些新的ＭＴａｓｅ 能夠調控基因表達． 在枯草芽孢桿菌（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中，孤生ＭＴａｓｅ（ＤｎｍＡ）識別修飾不對稱ＧＡＣＧｍ ＡＧ 基序，當敲除后導致許多基因的轉錄發生改變，其中在ｓｃｐＡ 基因的啟動子３５ 區下游存在一個ＧＡＣＧＡＧ 基序，在ｄｎｍＡ 敲除背景下，ｇｆｐ 報告基因的表達顯著下調；當識別基序中的修飾位點從Ａ 突變為Ｃ 或Ｔ 后會消除這種影響；證明了甲基化修飾在ｓｃｐＡ 基因中的調控作用． 進一步利用甲基化修飾和未修飾的２ 條寡核苷酸通過Ｐｕｌｌｄｏｗｎ 實驗在細胞裂解物種篩選出一個負調控蛋白ＳｃｏＣ，發現ＳｃｏＣ 對未甲基化修飾的ＤＮＡ 的結合親和性更高．因此，認為負調控蛋白ＳｃｏＣ 在ｄｎｍＡ 突變背景下更容易與該基因啟動子結合，從而下調基因的表達［４７］． 值得注意的是，甲基化修飾與否并不會影響所有關聯基因的表達． 在艱難梭狀芽胞桿菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）中，測序比較了３６ 株臨床分離物的甲基化圖譜，發現了１７ 個特有的甲基化修飾基序，并系統地研究了３６ 個分離物共有的一個孤生甲基化轉移酶ＣａｍＡ 的調控功能，ＣａｍＡ 識別修飾ＣＡＡＡＡｍＡ 基序，每個基因組中平均含有７ ７２１個，并富集在產孢、膜轉運和轉錄調控等編碼基因中．此外，每個基因組中約有２７ 個ＣＡＡＡＡＡ 位點沒有甲基化修飾，這些位點被認為可能因為被轉錄因子結合，規避了甲基化修飾，意味著這些基因可能受制于甲基化修飾調控． 為研究甲基化修飾的調控作用，采用比較轉錄組分析了ｃａｍＡ 缺失突變后的差異表達基因，發現差異基因富集于ＣＡＡＡＡＡ 關聯的基因中，而且包括１００ 余個表達下調的產孢基因，與表型觀察一致，即ｃａｍＡ 缺失突變體的產孢能力下降． 最后，在小鼠感染模型中發現ｃａｍＡ 缺失突變體的致病性發生衰減［４８］．

在原核細菌中，有關甲基化修飾的調控作用大多來自于ｍ６Ａ 修飾，有關ｍ５Ｃ 和ｍ４Ｃ 修飾的調控研究非常有限． 最近，有研究者對幽門螺旋桿菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）的甲基化酶（ＪＨＰ１０５０）基因缺失突變菌株進行了轉錄組研究，發現菌株Ｊ９９ 中２２５ 個基因的表達受到明顯影響，但在ＢＣＭ-３００ 菌株中只檢測到２９ 個差異表達基因，進一步通過對修飾基序ＧＣＧＣ 的突變分析，證明了位于啟動子的ｍ５Ｃ 甲基化修飾可直接調控基因的表達［４９］． 浙江大學李永泉團隊［５０］最近在玫瑰孢鏈霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏ-ｍｙｃｅｓ ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ）Ｌ３０ 菌株中新鑒定了一個ｍ４Ｃ 修飾的ＭＴａｓｅ （ＳｒｏＬｍ３），經多組學和突變分析發現該ＭＴａｓｅ 廣泛參與調控次生代謝，缺失后可提高達托霉素（ｄａｐｔｏｍｙｃｉｎ）的合成．

此外，運用組學，特別是比較轉錄組分析技術，在許多細菌中發現敲除特定的ＭＴａｓｅ 或甲基化修飾缺失會改變大量基因的表達水平［３３，５１.５６］． 例如，在伯氏疏螺旋菌（Ｂｏｒｒｅｌｉ ａｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）中，敲除２ 個質粒編碼的ＭＴａｓｅ 基因，分別改變數百個基因的表達［５３］． 在化膿鏈球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）中，敲除Ｉ 型Ｒ-Ｍ 系統后卻只有２０ 個基因發生了顯著的變化，但均下調表達［５１］． 利用ＭＴａｓｅ 抑制劑（５-ａｚａ-ｃｙｔｉｄｉｎｅ）處理Ｅ． ｃｏｌｉ 細胞，比較轉錄組分析也發現數十個基因的轉錄發生改變［５４］． 在植物病原細菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ． ｇｌｙｃｉｎｅｓ）中，采用蛋白組技術比較分析了３ 個ＭＴａｓｅ 基因過表達的菌株，發現１００ 余個顯著表達的蛋白，其中包括部分重疊的蛋白，但更多的差異蛋白富集于在不同的ＧＯ 功能，說明這３ 個ＭＴａｓｅ 可能具有不同調控功能［５５］．這些研究特別關注了與甲基化修飾基序關聯的基因，認為這可能是甲基化修飾直接調控的靶基因．但是，這類研究仍然不夠深入，不能提供直接的實驗結果證明甲基化修飾與被調控基因的關聯． 因此，原核甲基化修飾表觀調控需要給予足夠的重視，進一步研究闡明分子機制．

４． ２甲基化修飾相變調控 在原核細胞中，ＤＮＡ

甲基化修飾常常以相變（ｐｈａｓｅ-ｖａｒｉａｔｉｏｎ）方式發揮調控作用［５７］． 相變是指基因表達的隨機和可逆的改變． 因此，相變可能導致細菌群體產生不同表型的異質性的亞群體，如改變病原細菌的定殖能力、適應微生境以及宿主細胞的免疫應答等［５７-６０］． 許多研究表明，細菌的Ｒ-Ｍ 系統可介導相變調控，在基因組上改變甲基化修飾模式，因此全局性地調控基因的表達，這些基因統稱為相變調控子（ｐｈａｓｅｖａｒｉｏｎｏｒ ｐｈａｓｅ-ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｕｌｏｎ）． 由于甲基化修飾介導的相變調控涉及病原細菌的致病性，有關病原細菌的相變調控基因的鑒定和相變調控的機制都進行了大量的研究，近期已發表了多篇綜述性文獻總結評述了目前的研究進展［５８-６１］． 下面僅就Ⅰ型和Ⅲ 型Ｒ-Ｍ 系統介導的相變調控作簡要介紹．

細菌Ｉ 型Ｒ-Ｍ 系統由３ 個亞基組成，其中調節亞基（Ｓ）負責識別甲基化修飾基序． 在一些細菌基因組中，編碼Ｓ 亞基的基因不止一個，可能出現多個同源基因，并且在鄰近的位置存在一個編碼位點特異的重組酶基因． 例如，在肺炎球菌（Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＳＴ５５６ 菌株的基因組中存在３ 個Ｓ 亞基基因（Ｓ_Ａ、Ｓ_Ｂ、Ｓ_Ｃ），其中在Ｓ_Ｂ和Ｓ_Ｃ之間間隔一個ｐｓｒＡ 基因，編碼酪氨酸位點特異的重組酶，該重組酶介導３ 個Ｓ 之間的重組，產生不同ＳＡ等位基因，組成多樣化的Ｒ-Ｍ 系統，識別不同ＤＮＡ 基序，并產生不同的甲基化修飾模式，最終導致出現異質性的亞群體． 其中，Ｓ 基因旁則的倒置重復序列是重組所必需的［６２-６３］． Ｉ 型Ｒ-Ｍ 相變調控可能影響多種細胞生理以及致病相關的表型［５８，６０］． 最近，在奈瑟淋球菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）ＦＡ１０９０ 菌株中敲除相變調控的Ｉ 型Ｒ-Ｍ 或改變修飾特異性，發現可以通過相變調控生物膜形成，并降低對人上皮細胞的附著以及對抗生素的抗性［６４］．

Ⅲ型Ｒ-Ｍ 系統介導的相變調控研究比較深入，在許多病原細菌中均發現存在Ⅲ型ＲＭ 相變調控． Ⅲ型ＭＴａｓｅ （Ｍｏｄ）在組織結構中包括一個負責識別甲基化基序的ＴＲＤ 功能域，ＴＲＤ 域通常包含一種簡單重復序列（ＳＳＲ），出現在約２０％ 的ｍｏｄ基因中［６１］． 不同的ＳＳＲ 序列，以及不同的重復次數和位置可能導致產生很多具有不同特異性的ｍｏｄ等位基因，也可能導致翻譯提前終止． 序列分析認為ＴＲＤ 的進化主要源于菌株或種間的ＤＮＡ 改組（ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）［６５］． 例如奈斯淋球菌的ｍｏｄＢ 基因座已鑒定出７ 個等位基因［６６］． 在嗜血流感菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉ-ｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）中，ｍｏｄＡ 含有一個由４ 核苷酸ＡＧＣＣ組成的ＳＳＲ，由于ＡＧＣＣ 重復次數的不同形成了至少２１ 個等位基因，其中一些等位基因導致翻譯提前終止，這種情況相當于關閉甲基化修飾；另外一些等位基因則可能改變甲基化修飾的特異性，在不同的細胞亞群中產生不同的甲基化修飾模式，并調控不同生理功能，如ＭｏｄＡ２、ＭｏｄＡ５、ＭｏｄＡ１０ 主要介導抗生素抗性，ＭｏｄＡ４ 涉及免疫逃避，ＭｏｄＡ２ 相變調控還包括一些致病相關的基因［６７］．

４． ３甲基化修飾與致病性 最早直接發現ＤＮＡ 甲

基化修飾與細菌致病性的關聯源自沙門氏菌． Ｈｅｉｔｈｏｆｆ等［６８］發現ｄａｍ 缺陷的Ｓ． ｅｎｔｅｒｉｃａ 突變株通過口服灌注小鼠，其ＬＤ_５０致死劑量較野生型高１０ ０００ 倍以上，說明甲基化修飾的缺失導致沙門氏菌的致病性嚴重衰減． 后續的研究進一步揭示了ｄａｍ 缺失導致致病性衰減的可能機制，如生物膜形成的缺陷［６９］、不能充分激活ＳＰＩ-１ 致病島［７０］、細胞運動性降低［７１］．

隨后，在其他病原細菌中也發現ＤＮＡ 甲基化的缺失可能導致致病性降低［７２］． 例如，在一些流感嗜血桿菌（Ｈ． ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）菌株中，發現Ｄａｍ 甲基化修飾是病菌侵入內皮和上皮細胞所必需的［７３］． 在銅綠假單胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＡＯ１ 菌株中，發現甲基化修飾狀況與細胞生長有關，敲除一個Ⅰ 型限制修飾系統后，在昆蟲大蠟螟（Ｇａｌｌｅｒｉａｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ）侵染模型中導致致病性衰減［７４］；最近，在一株銅綠假單胞桿菌的臨床分離物中，鑒定出一個Ⅰ型ＲＭ 系統的ＭＴａｓｅ （Ｍ． ＰａｅＴＢＣＦＩＩ），敲除后也會導致致病性衰減，而且對一氧化氮（ＮＯ）敏感［７５］． 此外，更多的研究表明甲基化修飾可能調控致病相關的基因，從而影響致病性． 例如，在結核桿菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）中，發現來自于歐美系的菌株編碼一個孤生的ＭＴａｓｅ（ＤａｍＡ），缺失后降低細菌對低氧的適應性，而該基因不存在于北京系的菌株中，暗示該基因在不同的菌系中可能存在特異性的作用［７６］．

幽門螺旋桿菌（Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ）是一種重要的病原菌，可誘發胃癌，在其基因組中發現了比其他細菌更為豐富、多樣的限制修飾系統，可達全部編碼基因的２％ ［７７７８］，不同的菌株平均編碼多達３０ 余個ＭＴａｓｅ 基因［７９］，而且一些ＭＴａｓｅ 具有菌株的特異性［７７，８０］． Ｖａｌｅ 等［８１］通過分析來自于非洲、美洲、亞洲和歐洲的２２１ 個幽門螺旋桿菌菌株，發現限制修飾系統的多樣性具有地理起源特異性，認為與菌株的適應性有關． 在Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ 中，發現一個Ⅲ型限制修飾系統ＭｏｄＨ 具有相變調控作用，ＭｏｄＨ 具有多達１５ 種特異的甲基化修飾模式，能夠調控相應細胞的運動和附著相關基因的表達． 有趣的是，不同修飾基序的ＭｏｄＨ 對運動相關基因的調控呈現相反的作用，ＭｏｄＨ５ 上調鞭毛因子和ｈｏｏｋ 蛋白的表達；而ＭｏｄＨ１ 卻下調鞭毛ｈｏｏｋ 和ｒｏｄ 蛋白的表達［８２-８４］． 此外，通過轉錄組和蛋白組分析發現，Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ２６６９５ 菌株缺失一個ｍ４Ｃ 修飾的ＭＴａｓｅ（Ｍ２． ＨｐｙＡＩＩ），能夠導致１００ 多個基因的表達發生改變，其中也包括許多致病相關的基因［８５］． 不過，在Ｈ． ｐｙｌｏｒｉａ 中有關甲基化修飾與致病性的關聯性仍然缺乏動物模型的實驗證據．

雖然許多研究表明，改變病原細菌甲基化修飾可能影響致病性，但其中的分子機制仍不清楚，一般認為甲基化修飾可能通過改變特異基因的表達，導致致病性發生改變，另外一種可能則是與環境適應有關．

由于一些研究發現ｍ５Ａ 修飾的缺失能夠大幅度衰減致病性，有人提出以病原細菌的甲基化修飾作為靶點，研究發展新的治療方案［８６］． 例如，Ｍｏｈｌｅｒ等利用沙門氏菌ｄａｍ 缺失突變體開發了活疫苗［８７］，或者合成、篩選細菌特異ＭＴａｓｅ 的抑制劑［８６］． 最近，Ｚｈｏｕ 等［８８］針對艱難梭狀芽胞桿菌特異性的ＭＴａｓｅ （ＣａｍＡ），篩選、分析了幾種Ｓ-腺苷甲硫氨酸結構類似化合物對ＣａｍＡ 的抑制作用，發現３ 種化合物（ＳＧＣ０９４６、ＪＮＪ-６４６１９１７８ 和ＳＧＣ８１５８）在低濃度下能抑制ＣａｍＡ 的催化反應，并解析了ＣａｍＡ-ＳＧＣ０９４６ 復合體結構，顯示抑制劑導致Ｃａ-ｍＡ 的Ｎ-端結構域構象發生改變，可能影響ＣａｍＡ與甲基供體Ｓ-腺苷甲硫氨酸互作或甲基轉移． 這為臨床治療艱難梭狀芽胞桿菌等病原細菌的侵染提供了一個新的思路．

４． ４ 甲基化修飾與耐藥性 抗生素的發現及應用雖然挽救了無數的生命，但是由于抗生素濫用導致的耐藥性給人類帶來了嚴峻的挑戰，成為當今主要醫療問題之一． 雖然對耐藥性的生化機制和遺傳學進行了廣泛的研究，但仍然難以完全解釋耐藥性的機理． 最近，隨著原核表觀遺傳研究進一步深入，發現ＤＮＡ 甲基化修飾在原核細菌耐藥性的發展過程中，可能扮演了重要的作用［８９］． 例如，利用酶聯免疫技術比較分析對環丙沙星抗性的３０ 株Ｅ． ｃｏｌｉ 臨床分離物與１０ 株敏感分離物的ｍ５Ｃ 修飾，結果發現基因組的甲基化修飾水平與抗藥性存在顯著的負相關［９０］． 在另一項研究中，利用表觀組和轉錄組聯合分析發現抗生素處理結核桿菌細胞后，抗性相關的基因被高度甲基化［９１］． 這些研究說明細菌的表觀修飾與抗藥性存在一定的關聯性．

在抗生素適應性的進化中，許多細菌在亞致死劑量下均能快速發展出適應性抗性． 有研究表明這種適應性抗性的獲得與細菌表觀修飾有關［９２］． 例如適應性抗性中，甲基化修飾能上調與抗藥性相關的ＲＮＤ 外排泵基因的表達量［９３］． 在Ｅ． ｃｏｌｉ 抗性菌株中，敲除Ｄａｍ 甲基化修飾也能影響ＲＮＤ 相關的基因表達［９４］． ＳｕｇＥ 是腸桿菌中的一個膜通道蛋白［９５］，與抗生素抗性有關，并且過表達能夠提高抗藥性［９６］． 在大腸桿菌中，發現ｄｃｍ 甲基化修飾能夠上調ＳｕｇＥ 的表達，并提高細胞的抗藥性［９７］． 這些研究例證表明，甲基化修飾可通過調控抗藥性相關基因的表達，進而影響抗性． 最近，在研究ｍ５Ｃ 修飾對霍亂弧菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）抗氨基糖苷類抗生素（新霉素）的作用時，發現敲除孤生甲基化酶（ｖｃｈＭ）上調分子伴侶ｇｒｏＥＳＬ-２ 基因的表達，同時提高了抗性；將位于ｇｒｏＥＳＬ-２ 基因啟動子的４ 個甲基化修飾基序（ＲＣＣＧＧＹ）突變后，抑制啟動子的甲基化修飾，也得到同樣的實驗結果，這充分地證明了甲基化修飾對ｇｒｏＥＳＬ 基因的調控作用［９８］．

在抗生素的適應性抗性中，甲基化修飾也可能通過提高基因的突變頻率，導致產生或者適應藥物脅迫． 比如，ｄｃｍ 形成ｍ４Ｃ 甲基化修飾，可能因為ｍ４Ｃ 脫氨基反應，導致Ｃ 轉換為Ｔ，從而在Ｄｃｍ 的識別位點（ＣＣＷＧＧ）誘發形成突變熱點． 通過對千余個Ｅ． ｃｏｌｉ 和沙門氏菌的臨床分離物進行測序，結果分析表明在自然條件下ＣＣＷＧＧ 位點的突變頻率確實大大提高［９９］． 甲基化修飾導致的突變增加無疑對細菌適應不同的環境，包括抗藥性都是有利的［１００］． Ｄａｍ對Ｅ． ｃｏｌｉ 抗藥性的研究表明，ＧＡＴＣ 甲基化修飾缺失導致對氨芐青霉素等的抗性顯著降低，但是在抗生素暴露下，ＧＡＴＣ 的甲基化水平沒有明顯的變化，說明甲基化修飾并不通過直接調控相關基因表達影響抗性． 有趣的是，當在ｄａｍ 缺失背景下，進一步缺失ＤＮＡ 錯配修復基因（ｍｕｔＨ 或ｍｕｔＳ）可以恢復細胞對氨芐的抗性，說明甲基化修飾缺失導致的抗生素敏感表型是因為ＤＮＡ 錯配修復響應抗性，在修復過程中，由于缺乏ＧＡＴＣ 信號，可能將錯配ＤＮＡ 因為ＭｕｔＨ 切割轉變為雙鏈斷裂，從而導致細胞死亡． 當錯配修復系統缺失后，細胞通過忍耐相應的錯配突變，反而可能提升其存活率［１０１］．

５ 展望

綜上所述，ＲＭ 系統不僅具有防御功能，而且在細胞周期、基因表達調控、病原細菌表觀調控等方面也發揮了重要的作用． 雖然原核生物的ＤＮＡ甲基化修飾及其生物學功能的研究已經取得了重要進展，但是原核生物的ＭＴａｓｅ 及其甲基化修飾系統極其復雜，其表觀調控模式和機制不僅存在多樣化的現象還兼具物種的特異性，有關ＭＴａｓｅ 及其甲基化修飾的研究仍較為有限． 因此，通過第三代ＤＮＡ 測序技術獲得甲基化組，聯合轉錄組／ 蛋白組和表型分析等多技術手段，能夠快速鑒定甲基化表觀調控的基因集，進而明確甲基化修飾的生物學功能和分子機制，并從新的視角應對諸如細菌致病性、耐藥性以及進化適應等原核生物研究的重要挑戰，也為解析原核甲基化修飾表觀遺傳作用提供了新的方法［１３，３２，８９］．