HPLC法測定Boc-L-苯丙氨酸中的對映異構體雜質

摘 " " "要：目的：建立Boc-L-苯丙氨酸中對映異構體雜質的方法。方法：采用HPLC法，DAICEL CHIRALPAK AD-H手性色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；以V（正己烷）∶ V（異丙醇）∶V（乙醇）∶V（三氟乙酸）=80∶5∶15∶0.1為流動相，流速為0.8 mL/min，柱溫30 ℃，進樣體積為20μL，檢測波長210 nm。結果：Boc-L-苯丙氨酸與其對映異構體之間的分離度大于1.5；Boc-L-苯丙氨酸與其對映異構體的線性范圍均為2.0 ～10.0μg/mL， r均為0.999；對映異構體的平均回收率為95.9%， RSD為2.4% （n=9）。結論：該方法專屬性強，準確度高，可以作為Boc-L-苯丙氨酸中對映異構體雜質的測定方法。

關 "鍵 "詞：Boc-L-苯丙氨酸；對映異構體；HPLC

中圖分類號：O657 " " 文獻標識碼： A " " 文章編號： 1004-0935（2023）07-1089-04

多發性骨髓瘤（MM）是一種起源于骨髓的漿細胞惡性腫瘤[1-3]，臨床上并發癥表現多樣[4-6]，對患者的生命健康產生威脅[7-8]。硼替佐米，商品名為萬珂 （Vaclade），由美國Millennium Pharmaceutical公司開發，劑型為注射劑，是全球首個人工合成的蛋白酶體抑制藥，臨床上用于多發性骨髓瘤[9-10]，且臨床療效較好。硼替佐米的合成方法較多，李忠等對硼替佐米多條合成路線進行了圖解[11]，Boc-L-苯丙氨酸為其中重要的起始物料。硼替佐米中有4種光學異構體，具有藥效活性的只有硼替佐米，因此需要嚴格控制其異構體[12]。質量源于設計，為提高純度，減輕后期純度壓力，需對起始物料的光學異構體含量進行質量控制[13]。Boc-L-苯丙氨酸結構式見圖1，其對映異構體（Boc-D-苯丙氨酸）結構式見圖2。本文建立了HPLC法測定Boc-L-苯丙氨酸對映異構體的測定方法。

1 "試驗部分

1.1 "試劑與藥品

Boc-L-苯丙氨酸供試品（來源：南京正大天晴制藥有限公司）；Boc-L-苯丙氨酸對照品（含量：99.0%，來源：上海泰坦科技股份有限公司）；Boc-L-苯丙氨酸異構體對照品（質量分數為99.0%，來源：上海泰坦科技股份有限公司）；正己烷（色譜純，Fisher公司）；異丙醇（色譜純，Fisher公司）；乙醇（色譜純，Fisher公司）；三氟乙酸（分析純，阿拉丁）。

1.2 "儀器與試藥

戴安UltiMate高效液相色譜儀（Thermo公司）；AB135-S型電子天平（METTLER TOLEDO公司）。

2 "方法與結果

2.1 "溶液的制備

溶劑：V（正己烷）∶ V（異丙醇）∶V（乙醇）∶V（三氟乙酸）=80∶5∶15∶0.1。

供試品溶液：取供試品適量，精密稱定，加溶劑適量使溶解并稀釋制成每1 mL中約含Boc-L-苯丙氨酸1 mg的溶液，作為供試品溶液。

系統適用性溶液：取Boc-L-苯丙氨酸供試品及其對映體適量，精密稱定，加溶劑適量使溶解并稀釋制成每1 mL中約含Boc-L-苯丙氨酸1 mg，Boc-L-苯丙氨酸對映異構體約5 μg的混合溶液，作為系統適用性溶液。

Boc-L-苯丙氨酸定位溶液：取Boc-L-苯丙氨酸對照品適量，精密稱定，加溶劑適量使溶劑并稀釋制成每1 mL中約含50 μg的溶液，作為Boc-L-苯丙氨酸定位溶液。

Boc-L-苯丙氨酸對映體定位溶液：取Boc-L-苯丙氨酸對映異構體對照品適量，精密稱定，加溶劑適量使溶劑并稀釋制成每1 mL中約含50 μg的溶液，作為Boc-L-苯丙氨酸對映體定位溶液

對照溶液：精密量取供試品溶液1 mL，置

100 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。

2.2 "色譜條件

色譜柱：DAICEL CHIRALPAK AD-H色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：正己烷-異丙醇-乙醇-三氟乙酸（80∶5∶15 ∶0.1）；流速：

0.8 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣體積：20 μL；檢測波長：210 nm。

2.3 "方法學驗證

2.3.1 "專屬性

分別取上述“2.1溶液的制備”項下溶劑、供試品溶液、系統適用性溶液、Boc-L-苯丙氨酸及Boc-L-苯丙氨酸對映體定位溶液各20 μL，按“2.2”項下色譜條件進樣， 記錄色譜圖。詳細試驗結果見表1。

結果表明，空白溶劑無干擾；系統適用性溶液中對映體的保留時間與定位溶液峰的保留時間一致；各雜質與樣品中相鄰的分離度為5.24，大于1.5。本法測定Boc-L-苯丙氨酸對映體專屬性良好。

2.3.2 "定量限與檢測限

分別取Boc-L-苯丙氨酸和Boc-L-苯丙氨酸對映體各適量，精密稱定，用溶劑溶解并定量稀釋制成適宜濃度，再精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，并逐步稀釋測定，將信噪比約為10∶1時作為定量限、信噪比約為3∶1時作為檢測限；同時定量限濃度溶液連續進樣6針，記錄色譜圖，計算保留時間與峰面積的RSD。Boc-L-苯丙氨酸定量限和檢測限分別為1.989 μg/mL和0.597 μg/mL；Boc-L-苯丙氨酸對映體定量限和檢測限分別為2.002 μg/mL和0.601 μg/mL，滿足檢測要求。6份Boc-L-苯丙氨酸定量限溶液的保留時間RSD為0.2%，小于1.0%；峰面積的RSD為2.9%，小于5.0%。6份Boc-L-苯丙氨酸對映體定量限溶液的保留時間RSD為0.2%，小于1%；峰面積的RSD為1.7%，小于5.0%，符合驗證要求。

2.3.3 "線性與范圍

分別取上述“2.1溶液的制備”項下Boc-L-苯丙氨酸及其對映體定位溶液各適量，用溶劑溶解并稀釋制成含Boc-L-苯丙氨酸及其對映體濃度均為

2 μg·mL-1，3 μg·mL-1， 4 μg·mL-1，5 μg·mL-1，

6 μg·mL-1， 8 μg·mL-1，10 μg·mL-1的系列標準溶液， 分別精密量取20 μL，按“2.2”項下的色譜條件進樣測定。以峰面積（A）為縱坐標，以質量濃度（C，μg·mL-1）為橫坐標進行線性回歸，作回歸方程。試驗結果見圖3-圖4。

由以上結果可知，Boc-L-苯丙氨酸線性回歸方程為y=0.508x+0.112，相關系數r=0.999 8；Boc-L-苯丙氨酸對映體線性回歸方程為y=0.516x+0.062，相關系數r=0.999 8；Boc-L-苯丙氨酸及其對映體在2 ～10 μg·mL-1的質量濃度范圍內，濃度與對應的峰響應值均成顯著線性關系，本法測定Boc-L-苯丙氨酸對映體的線性良好。

2.3.4 "準確度

取Boc-L-苯丙氨酸供試品約10 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，加溶劑適量使溶解，分別精密加入上述“2.1溶液的制備”項下Boc-L-苯丙氨酸對映體定位溶液0.8 mL、1.0 mL和1.2 mL，并用溶劑稀釋至刻度，分別制成相當于80%、100%、120%質量分數水平的加樣回收率試驗溶液，每個濃度水平平行配制3份，百分之一自身對照法計算其含量，將實測值與理論值相比較，計算回收率。測得平均回收率為95.9%，回收率RSD（n=9）為2.4%，表明方法的準確度良好。詳細試驗結果見表3。

結果表明，各濃度下的平均回收率為94.97%、96.23%和96.52%，均在92%～105%之間；9個回收率數據的平均回收率為95.9%，也在92%～105%之間；且9份回收率數據的RSD為2.4%，小于3.0%，因此本法測定Boc-L-苯丙氨酸對映體的準確度良好，符合驗證要求。

2.3.5 "重復性

取Boc-L-苯丙氨酸供試品和Boc-L-苯丙氨酸對映體對照品適量，精密稱定，加溶劑適量使溶解并稀釋制成每1 mL中約含Boc-L-苯丙氨酸1 mg，Boc-L-苯丙氨酸對映異構體約5 μg的混合樣品溶液，平行配制6份，作為重復性測試溶液，按“2.1”項下的色譜條件進樣測定。按百分之一自身對照法測定每一份溶液中對映體的含量，并計算含量的RSD，6份樣品測得對映體含量的RSD為3.0%，小于5.0%，表明方法的重復性良好。

2.3.6 "中間精密度

由不同實驗人員在不同日期，使用不同的高效液相色譜儀，照“2.3.5 重復性”項下的方法進行試驗，將測定結果與重復性項下測得的6份結果合并計算，結果為12份樣品中測得對映體含量的RSD為3.1%，小于5.0%，表明方法的中間精密度良好。

2.3.7 "進樣精密度

取重復性項下供試品溶液，精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。平行進樣6次，計算6次進樣主峰和各雜質保留時間與峰面積的RSD。6次進樣中Boc-L-苯丙氨酸保留時間的RSD為0.04%，≤1.0%；峰面積的RSD為0.25%，≤2.0%；Boc-L-苯丙氨酸對映體保留時間的RSD為0.03%，≤1.0%；峰面積的RSD為2.0%，≤2.0%，說明本法測定201-12對映體的進樣精密度良好，符合驗證要求。

2.3.8 "溶液穩定性

照“2.3.5重復性”項下方法制備加樣供試品溶液，在室溫條件下放置20 h，考察對映體含量的變化情況。結果在室溫放置20 h，供試品中對映體含量在20 h內的RSD為2.6%，≤3%，表明供試品溶液在20 h內穩定。

2.3.9 "耐用性

照“2.3.5重復性”項下方法制備加樣供試品溶液，分別考察流速（0.8±0.1）mL/min、柱溫（30±5）℃、流動相中三氟乙酸含量0.1%±0.05%，分析方法的色譜條件發生微小變化時，按百分之一自身對照法計算加樣供試品溶液中對映體含量的變化情況。結果表明，檢測條件發生微小變化時，各色譜條件下對映體測得量的RSD為2.5%，對Boc-L-苯丙氨酸對映體的檢測結果無影響，表明本法耐用性良好。

3 "結果與討論

為充分保證手性藥物的質量可控，需對手性藥物的光學純度進行全程的監控，包括起始物料和工藝生產過程，而不僅僅從終產品進行控制[14-15]。近年來，在進行手性異構體化合物的分離過程中，手性色譜分離技術是發展與應用最快最廣的，其中尤其以高效液相色譜手性固定相法最為簡便有

效[16-17]。本研究建立了手性色譜法測定Boc-L-苯丙氨酸中對映體雜質的分析方法，在方法建立過程中還對柱溫、流速以及流動相中三氟乙酸的含量進行了考察，使流速±0.1 mL/min、柱溫±5 ℃、流動相中三氟乙酸含量±0.05%后，本方法依然可以準確測定Boc-L-苯丙氨酸中對映體的含量，表明方法的耐用性良好。

4 "結 論

本研究建立了HPLC法測定Boc-L-苯丙氨酸中對映體雜質的分析方法，方法學驗證結果表明，所建立的方法專屬性強、準確度高、耐用性好可以穩定的用于測定，為Boc-L-苯丙氨酸的質量控制提供了有效的支撐。

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Detection of Enantiomer Impurity in Boc-L-phenylalanine by HPLC

XV Yue， LIU Tong-mei， WAN Guo-sheng， WANG Jun， LAN Gong-jian， XV Dan

（Nanjing Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Co.， Ltd.， Nanjing Jiangsu 210046， China）

Abstract： In order to establish a method for the detection of enantiomer impurity in Boc-L-phenylalanine， an HPLC method was used with a DAICEL CHIRALPAK AD-H chiral column（250 mm × 4.6 mm，5 μm）， the mobile phase was n-hexaneethanol-propyl alcohol-ethanol-trifluoroaceticacid （80∶5∶15∶0.1） and the flow rate was 0.8 mL·min-1， the column temperature was 30 ℃ and the injection volume was 20 μL， the detection wavelength was set at 210 nm.The results showed that the separation of Boc-L-phenylalanine with its enantiomer was more than 1.5.The linear range of Boc-L-phenylalanine and its enantiomer was 2.0～10.0 μg·mL-1 ，and r was 0.999 8.The average recovery of enantiomer was 95.9% with the RSD of 2.4% （n=9）. The established method has strong specificity， good precision and high accuracy， which can be used for determination of enantiomer impurity in Boc-L-phenylalanine.

Key words： "Boc-L-phenylalanine; Enantiomer; HPLC