離子色譜法測定枸杞中7種單糖含量的不確定度評定

摘 " " "要：為了評定離子色譜法測定枸杞中葡萄糖等7種單糖含量的不確定度，通過離子色譜法進行測定，建立數學模型并分析該方法不確定度的各分量值，計算合成和擴展不確定度，評定了枸杞中葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、甘露糖、果糖、阿拉伯糖、巖藻糖等7種單糖含量測定過程中標準溶液的配制、樣品稱量、提取、回收率、測量重復性以及分析儀器等引入的各種因素對測量結果的影響。結果表明：本測量不確定度的評定方法可用于枸杞中7種單糖含量測定結果的評價，為測定結果準確性和可信度提供科學判定依據。

關 "鍵 "詞：離子色譜法；枸杞；單糖；不確定度

中圖分類號：O629.11+2 " " 文獻標識碼： A " " 文章編號： 1004-0935（2023）07-1084-05

枸杞多糖是枸杞的主要活性物質，具有降血糖、抗腫瘤、抗氧化、提高免疫力等多種藥理作用。枸杞多糖是由單糖通過糖苷鍵結合而成，單糖組成及含量的準確測定是其質量控制的關鍵。隨著分析檢測技術的進步以及分析儀器的發展和普及，離子色譜在單糖的測定和分析中凸顯優勢。枸杞現行檢驗標準中枸杞多糖的含量測定以“苯酚-硫酸”比色法為主[1-2]，現已有專屬性更強、準確性更高的離子色譜法質量標準發布征求意見稿和文獻研究[3-4]，然而離子色譜法測定單糖的相關不確定度評定的研究不夠完善。

測量不確定度用于表征賦予被測量之值的分散性，它是對被測量客觀值在某一量值范圍內的評估，是對測量結果質量的定量表征，是考察質量檢測方法測定結果準確性和可信度的依據，因此通過不確定度評定來評價離子色譜法是否適合于枸杞多糖中單糖的含量測定，對枸杞的質量控制具有重要意義。

本研究依據《評定測量不確定度的要求》[5-6]和《測量不確定度評定與表示》[7]，同時參考《藥品檢測結果不確定度評定指導原則》[8]以及相關文獻[9-10]，分析影響離子色譜法測定枸杞中7種單糖含量測定不確定度的因素，分析不確定度產生的來源，并對影響不確定度各個因素進行分析和評定，為測量結果的準確性提供科學判定依據。

1 "材料與方法

1.1 "儀器與設備

XS205DU型分析天平，梅特勒公司；ICS-6000DP型離子色譜儀，賽默飛世爾公司；移液管（1、2、10 mL）；量瓶（10、100 mL）。測定的環境條件：溫度23 ℃，相對濕度70%。

1.2 "材料與試劑

葡萄糖（Glc）、鼠李糖（Rha）、半乳糖（Gal）、甘露糖（Man）、果糖（Fru）、阿拉伯糖（Ara）、巖藻糖（Fuc）7種單糖對照品均購于中國食品藥品檢定研究院，質量分數均大于97%；10批枸杞，市售；實驗用水為超純水。

1.3 "實驗方法

枸杞樣品經水提醇沉、三氟乙酸水解后，通過離子色譜-積分脈沖安培檢測器檢測，外標法定量。

1.3.1 "樣品前處理

稱取粉碎后的枸杞15 g，加適量乙醚回流1 h，棄去乙醚液；殘渣加80%乙醇300 mL，加熱回流 " 1 h，棄去80%乙醇液；再加水450 mL，加熱回流 " "2 h。收集濾液，加活性炭，超聲40 min，4 000 r·min-1離心10 min，取上清液，置旋轉蒸發儀濃縮至75 mL，加1/4體積的Sevag試劑（三氯甲烷與正丁醇比例4∶1），振搖，取水層，再加入相當于水相體積1/4的Sevag試劑，重復6次，合并上清液加入約4倍體積的無水乙醇，4 ℃靜置過夜，4 000 r·min-1離心10 min，取沉淀，真空干燥6 h，得枸杞粗多糖。

取枸杞粗多糖，置100 mL A級容量瓶中，用水定容至刻度，精密移取2mL置具塞離心管中，加 " 4 mol·L-1三氟乙酸3 mL，溶解后于110 ℃反應3 h，取出，氮吹除去三氟乙酸，殘渣加水溶解，轉移并定容至25 mL容量瓶中，搖勻后過膜待測。

1.3.2 "對照品溶液

精密稱取葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、甘露糖、果糖、阿拉伯糖、巖藻糖7種單糖對照品各10 mg，置100 mL A級容量瓶中，用去離子水定容至刻度，制成100 μg·mL-1混合對照中間液。再用1 mL移液管精密移取1 mL混合對照中間液，置于10 mL A級容量瓶中，用去離子水稀釋至刻度，制成10 μg·mL-1混合對照工作溶液。

1.3.3 "液相色譜條件

色譜柱為陰離子交換糖分析換柱（150 mm " "×3 mm，粒徑3.5 μm），柱溫為30 ℃，淋洗液A為0.2 mmol·L-1 氫氧化鉀溶液，淋洗液B為 " " "0.5 mmol·L-1氫氧化鉀溶液。梯度洗脫：0～5 min，92%B；5～15 min，92%～8 %B；流速0.5 mL·min-1，檢測器為脈沖安培檢測器，Au工作電極，Ag/AgCl參比電極；進樣體積為5 μ 。

1.3.4 "建立數學模型

離子色譜法測定枸杞中單糖含量的測量數學模型見公式（1）：

（1）

1.3.5 "測定枸杞中單糖含量的不確定度來源分析

枸杞中單糖含量的不確定度來源如圖1所示。

根據檢測步驟和建立的數學模型可知，離子色譜法測定枸杞中7種單糖含量的不確定度來源主要包括：樣品前處理過程中稱量以及液體量取等步驟引入的不確定度、對照品溶液稱量及其配制引入的不確定度、離子色譜儀的測量不確定度、測定重復性引入的不確定度、回收率引入的不確定度。

2 "結果與分析

2.1 "樣品前處理過程引入的不確定度ur（T）

2.1.1 "樣品稱量引入的不確定度

用型號為XSE205DU的電子天平稱取15 g枸杞樣品，稱量時使用范圍為0～220 g，實際分度值d=0.1 mg，檢定分度值e=1 mg。最大允許誤差的絕對值MPEV=0.5e=0.000 5 g。按均勻分布處理，稱量樣品質量時由天平的最大允許誤差引入的樣品質量的標準不確定度為：

u（m）=0.000 5g/√3=2.9×10-4 g。 " "（2）

本文實際稱取樣品15.020 6 g和 15.015 8 g，按單次測量計，m取平均值為15.018 2，則稱量樣品質量時由天平的最大允許誤差引入的樣品質量的相對標準不確定度為：

ur（m）=（u（m））/m=（2.9×〖10〗^（-4） g）/（15.018 2g）=1.93×10-4。 "（3）

2.1.2 "樣品提取、制備過程引入的不確定度ur（Vi）

樣品在提取、水解過程中，由乙醚、80%乙醇、三氟乙酸、Sevag等試劑膨脹、量取等產生的不確定度，因體積不帶入計算，不考慮不確定度的引入。提取、靜置、反應時間、試劑用量等因素引入的不確定度以回收率分量進行評定。

樣品制備過程中使用了A級100 mL、25 mL容量瓶和2 mL移液管，這些玻璃器皿均引入了不確定度。由JJG 196—2006[9]要求，實驗中所用的 " 100 mL、25 mL量瓶與2 mL移液管的容量允差分別為±0.10 mL、±0.03 mL、±0.01 mL，由校準偏差引入的不確定度u允差（V）按三角形分布計算，k=√（6） ；實驗室溫度為23 ℃，容量瓶校準時溫度為20 ℃，水的膨脹系數為0.000 21 ℃-1，由校準溫差引入的不確定度u溫差（V）按矩形分布計算，k=√3，則樣品制備過程中玻璃量器和移液器引入的不確定度ur（Vi）各分量見表1。

合成ur（m）和ur（Vi），則由樣品前處理過程引入的不確定度為：

ur（T） =√（u_r^2 （m）+u_r^2 （V_1 ）+u_r^2 （V_2 ） 〖+u〗_r^2 （V_4 ） ）= 0.002 23。 " " " " " " " " （4）

2.2 "對照品配制引入的不確定度ur （S）

2.2.1 "對照品稱量引入的不確定度

7種單糖對照品稱量使用的量程范圍為0～81 g的XSE205DU型號電子天平，載荷值0～5 g范圍段允差絕對值為0.05 mg，重復性允差限界為許為 "0.05 mg，均認為服從矩形分布，則：

u允差（W對照品）=0.05 mg/√3=0.028 9 mg。 "（5）

u重復性（W對照品）=0.05 mg/√3=0.028 9 mg。 （6）

u（Ws）=√（u_允差^2 （W_對照品）+u_重復性^2 （W_對照品））=√（〖0.0289〗^2+〖0.0289〗^2 ）= 0.040 9 mg。 " " " " " " " " " " "（7）

對照品稱量引入的相對標準不確定度按式（8）計算。

u_r （W_s）=（u（W_s Ws））/W_對照品 計算。 " " " " " " " （8）

2.2.2 "對照品純度引入的不確定度

因對照品未提供不確定度值，假定其分散區間的半寬為a=0.1%，服從按矩形分布，k=√3，對照品純度引入的相對不確定度按式（9）計算，結果見表2。

u_r （P）=（a/k）/〖對照品〗_純度 。 " " " " " " "（9）

2.2.3 "對照品溶液稀釋過程引入的不確定度

對照品稀釋時使用了A級100 mL、10 mL容量瓶，1 mL移液管，100 mL容量瓶引入的標準不確定度同供試品制備，10 mL量瓶與1 mL移液管的容量允差分別為±0.10 mL、±0.02 mL、±0.007 mL，由校準偏差引入的不確定度u允差（V）按三角形分布計算，k=√6；實驗室溫度為23 ℃，容量瓶校準時溫度為20 ℃，水的膨脹系數為0.000 21 ℃-1，由校準溫差引入的不確定度u溫差（V）按矩形分布計算，k=√3，則樣品制備過程中引入的不確定度u（Vi）各分量見表1。對照溶液的稀釋體積為：

V_S=（V_100mL×V_10mL）/V_1mL "。 " " " " " " "（10）

u_r （v_S ）=√（u_r^2 （V_100mL ）+u_r^2 （V_10mL ）+u_r^2 （V_1mL ） ）

=√（〖5.47×10〗^（-8）+〖8.94×10〗^（-8） 〖+1.44×10〗^（-6） ）

=0.001 26。 " " " " " " " " " " （11）

對照品配制引入的不確定度由對照品稱量、對照品純度和對照品溶液稀釋過程引入的不確定度合成，7種單糖對照品的不確定度結果見表2。

ur（S）=√（u_r^2 （W_s ）+u_r^2 （P）+u_r^2 （V_s ） ）。 "（12）

2.2.4 "重復測量引入的不確定度

取枸杞樣品，按1.3.1項下方法平行制備6份樣品溶液，依法測定，測定結果見表3。用貝塞爾公式計算標準偏差S，正常檢驗時取2次測量平均值，7種單糖測量重復性的標準不確定度u_r （R）見表3。

S=√（1/（n-1） ∑_（i=1）^n?〖（X_i 〗）-X ?）^2 。 " " " "（13）

u_r （R）=S/√2 。 " " " " " " " "（14）

2.3 "回收率引入的不確定度

取適當質量濃度的7種單糖混合對照品溶液 （10 mg·L-1），添加到已知含量的枸杞樣品中， 采用加標實驗， 重復檢測6個枸杞樣品。7中單糖平均加標回收率記作Ri，標準偏差記作S（Hi），則回收率的相對標準不確定度計算公式如式（15）所示，7種單糖回收率的相對標準不確定度ur （Hi ）見表4。

u_r （H）=（S（H_i ）/√3）/（H_i ） ? "。 " " " " " " " （15）

2.4 "離子色譜儀引入的不確定度ur（A）

本例使用Thermo Fisher ICS-6000DP型離子色譜儀，該儀器校準證書中給出不確定度最大允許誤差urel為9%，K=2，則此儀器的合成相對標準不確定度為：

ur （A）=0.09/2=0.045。 " " " " " "（16）

2.5 "合成不確定度與擴展不確定度

由公式（17）計算得出合成不確定度，當置信水平為95%，k=2，相對擴展不確定度Ur=k×ur，結果見表5。

ur（X）=√（u_r^2 （S）+u_r^2 （T）+u_r^2 （R）+u_r^2 （H）+u_r^2 （A） ） 。（17）

3 "結 論

本研究分析并評估了離子色譜法測定枸杞中7種單糖含量過程中產生的不確定組成，發現不確定度的主要來源為儀器本身的不確定度和重復性測量引入的不確定度，其次是回收率、樣品前處理過程及對照品配制過程中帶入的不確定度。因此，平時加強對儀器的檢定、校準及日常維護，保證其測量達到良好的重復性；實驗過程中保障實驗溫濕度環境，使用滿足實驗需要的量具精度，提高實驗人員的操作水平，可降低測量結果的不確定度，確保檢測結果的置信度。

參考文獻：

［1］國家藥典委員會，中華人民共和國藥典（2020年版一部）[S].北京：中國醫藥科技出版社，2020.

［2］GB/T 18672—2014，枸杞[S].

［3］頡東妹，王寧麗，劉笑笑，等.微波消解-離子色譜法測定枸杞多糖的含量及組成[J].食品安全質量檢測學報，2022，13（4）：1065-1072.

［4］張玲，胡紫艷，金鑫.枸杞多糖特性和單糖組成及木糖醇含量的分析[J].中國食品衛生雜志，2022，34（4）：657-662.

［5］ 中國合格評定國家認可委員會.校準和測試實驗室能力的通用要求：ISO/IEC 17025[S].北京：中國標準出版社，2006．

［6］中國合格評定國家認可委員會.化學分析中不確定度的評估指南：CNAS-GL006[S].北京：中國計量出版社，2019.

［7］JJF 1059.1—2012，測量不確定度評定與表示[S]．

［8］國家藥典委員會，藥品檢測結果不確定度評定指導原則[S].

［9］倪小波，周利英.氣相色譜-質譜法測定紡織品中五氯苯酚殘留量的影響因素探討[J].遼寧化工，2022，51（3）：438-441.

［10］王鵬，趙榮林，凌鳳香，等.分光光度法測定重整催化劑鉑含量及不確定度評定[J].當代化工，2021，50（1）：244-248.

［11］JJG 196—2006，常用玻璃量器檢定規程[S]．

Evaluation of Uncertainty in Determination of Seven Monosaccharides

in Lycium Barbarum by Ion Chromatography

HU Zi-yan1， JIN Xin1， CAO Jing2

（1. Nanjing Institute for Food and Drug Control， Nanjing Jiangsu 210000，China;

2. Nanjing Municipal Center for Disease Control and Prevention， Nanjing Jiangsu 210003，China）

Abstract： In order to evaluate the uncertainty of determination of seven monosaccharides in Lycium barbarum by ion chromatography， by ion chromatography， the mathematical model was established， the component values of the uncertainty of the method were analyzed， and the synthetic and extended uncertainty were calculated. The effects of various factors introduced during the determination of glucose， rhamnose， galactose， mannose， fructose， arabinose and fucose content in Lycium barbarum， such as the preparation of standard solution， sample weighing， extraction， recovery， measurement repeatability and analytical instruments on the determination results were evaluated. The results showed that the evaluation method of measurement uncertainty could be used to evaluate the determination results of 7 monosaccharides in Lycium barbarum， and provide a scientific basis for the accuracy and reliability of the determination results.

Key words： Ion chromatography; Lycium barbarum; Monosaccharides; Uncertainty