基于傳統分離和高通量測序的健康和患銹腐病西洋參根際土壤微生物群落分析

摘要： "探究健康和患銹腐病西洋參根際土壤微生物的群落多樣性和可培養菌株分離，以期為西洋參銹腐病發生機制及防控提供參考。利用傳統分離技術和高通量測序技術分析健康和患銹腐病西洋參的根際土壤，探究其微生物的群落組成及多樣性變化。經由傳統分離技術合計得到24株細菌和25株真菌，優勢菌屬包括假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）和青霉菌屬（Penicillium）。高通量測序結果顯示，健康和銹腐病土壤中細菌群落均以藍細菌門（Cyanobacteria）和變形門（Proteobacteria）為主；患銹腐病組有所降低的為藍細菌門（Cyanobacteria）、軟壁菌門（Tenericutes）和變形菌門（Proteobacteria），大幅上調的為擬桿菌門（Bacteroidetes）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）與厚壁菌門（Firmicutes）。健康和銹腐病土壤內所含的真菌群落以子囊菌門（Ascomycota）為主，被銹腐病感染后有所上調的為擔子菌亞門（Basidiomycota）、子囊菌門（Ascomycota）與被孢霉門（Mortierellomycota）。感染銹腐病根際土壤細菌多樣性明顯減少。研究表明健康和銹腐病土壤微生物群落組成與數量明顯不同，為西洋參銹腐病的發病機制及防控技術提供了理論依據。

關鍵詞： 西洋參；根際土壤；細菌和真菌；銹腐病；高通量測序；傳統分離方法

中圖分類號： S567 文獻標志碼：A文章編號：1002-4026（2023）02-0041-09

開放科學（資源服務）標志碼（OSID）：

Analysis of microbial communities of healthy and rusty root-rot

Panax quinquefolium L. rhizosphere soil using traditional

isolation and high-throughput sequencing

LI Lingyu1，2，HUANG Luqi3a，LI Zheng4，WANG Xiao1，LIU Wei1，ZHANG Huamin3b， MA Chunxia1，3a，3b，3c*

（1. Shandong Analysis and Test Center， Qilu University of Technology（Shandong Academy of Sciences）， Jinan 250014， China;

2. Key Laboratory of Food Processing Technology and Quality Control of Shandong Higher Education Institutes， College of

Food Science and Engineering， Shandong Agricultural University， Tai′an 271018， China; 3. a. State Key Laboratory

Breeding Base of Dao-di Herbs， National Resource Center for Chinese Materia Medica; b. Institute of Chinese

Materia Medica; c. Postdoctoral Management Office of China Academy of Chinese Medical Sciences， Mobile

Post-Doctoral Stations， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China;

4. Shandong Academy for Environmental Planning， Jinan 250101， China）

Abstract∶ To investigate the diversity of microbial communities and to obtain culturable strains from healthy and rusty root-rot rhizosphere soil samples of Panax quinquefolius L.， it is necessary to provide a reference for the occurrence mechanism and prevention and control strategies for rusty root-rot. Traditional isolation and high-throughput sequencing were used for analyzing the healthy and rusty root-rot soil samples of Panax quinquefolius L. to explore their structural composition and diversity. In total， 24 strains of bacteria and 25 strains of fungi were isolated using the traditional isolation techniques， and the dominant genera were Pseudomonas， Bacillus， and Penicillium. The results of Illumina Miseq high-throughput sequencing revealed that Cyanobacteria and Proteobacteria dominated the bacterial communities in the healthy and rusty root-rot soil samples. Notably， the phylum proportions of Cyanobacteria， Proteobacteria， and Tenericutes in the rusty root-rot soil samples significantly decreased， whereas those of Bacteroidetes， Actinobacteria， Firmicutes， and Acidobacteria significantly increased. Furthermore， the bacterial diversity of the infected rusty root-rot rhizosphere soil decreased significantly. In conclusion， the composition and quantity of soil microbial communities were significantly different between the healthy and rusty root-rot soil samples， and this provides a theoretical basis for the study of the occurrence mechanism and prevention and control strategies for rusty root-rot Panax quinquefolium L.

Key words∶ Panax quinquefolium L.; rhizosphere soil; bacteria and fungi; rusty root-rot; high-throughput sequencing; traditional isolation methods

西洋參Panax quinquefolius L.又稱五葉人參、美國參、花旗參，屬于五加科、人參屬，其藥用價值部位為根，極具滋補作用[1]。西洋參原產于北美洲，20世紀70年代開始引種到我國，廣泛應用于藥品和食品領域。西洋參含有多糖、皂苷、多肽、脂肪酸等多種營養成分，其中人參皂苷是主要活性成分[2]。《中國藥典（2020年版）》描述西洋參的功效為清熱生津、補氣養陰[3]。現代藥理研究表明，西洋參具有增強免疫、抗腫瘤及減輕更年期綜合癥等多種作用[4]。

然而，隨著西洋參種植面積的擴大，連作障礙問題日益突出，其中銹腐病是導致西洋參減產和質量下降的主要原因之一。銹腐病發病初期根部表面會出現鐵銹色的斑點，土壤潮濕時會伴有寄生菌的侵染，造成根部部分或完全腐爛。除了土壤理化性質劣化、化感自毒、病蟲害等原因外，土壤微生物菌群失調是西洋參根部發生銹腐病的重要因素[5]。前期對西洋參銹腐病的研究主要集中在單一致病菌，而土壤微生物豐度及含量變化可以打破根際微生物之間的生態平衡，其群落豐度和多樣性對維持土壤質量和揭示西洋參病害機制及防治至關重要。

Dong等[6]采用高通量測序的方法研究了連作過程中西洋參土壤微生物多樣性的變化，結果顯示，隨著年限的增加，細菌多樣性減少，真菌多樣性增加。此外，郭瑞齊等[7]通過比較未種植西洋參和種植西洋參1～4年的西洋參根際土壤的細菌群落，發現隨著種植年限的增加根際土壤細菌的種類及多樣性呈下降趨勢。其中，柱孢屬真菌（Cylindrocarpon）是引起西洋參銹腐病的重要病原菌；此外，在患銹腐病的西洋參中也分離到鐮刀菌（Fusarium）、假單胞菌（Pseudomonas）、根瘤菌（Rhizobium）、Rhexocercosporidium等菌株[8-10]。這些優勢菌的差異性可能與氣候、土壤性質、土壤中微生物的種類與豐度以及西洋參的品種等多種因素有關。山東威海是我國重要的西洋參主產區，所以研究該地區的侵染性病原微生物的分離及防治具有重要的研究價值。

傳統分離方法是微生物研究的常用方法，雖不能全面反映微生物生態系統的真實情況，卻可以得到菌株實體。高通量測序法是一種新型的分子生物技術，能對整個樣品的微生物種類、豐度及功能進行分析，可完整地體現微生物群落的特征，為解決西洋參銹腐病提供了方法[11]。結合兩者優勢，可通過高通量測序技術指導傳統培養方法分離西洋參根際微生物。

本研究基于高通量測序技術和傳統分離方法對威海市文登區的西洋參根際土壤進行初步研究，分析了健康和銹腐病西洋參根際土微生物結構組成及豐度變化，為深入探討西洋參銹腐病的發生機制提供了參考，對改良西洋參根際土的土壤環境提供了理論依據。

1儀器與材料

1.1實驗儀器

NanoDrop 2000（美國賽默飛世爾公司），3730 XL測序儀、2720 PCR儀（美國ABI公司），Mini Pro 300V Power Supply電泳儀（美國Major Science公司），NovaSeq6000測序儀（美國Illumina公司），ZD-85氣浴恒溫振蕩器（國旺儀器制造公司（常州）），ZXJD-A1270霉菌培養箱（智城公司（上海））。

1.2實驗材料

樣品采于山東省威海市文登區，為4年生西洋參根際土壤。隨機選取20株健康和20株銹腐病的西洋參，將西洋參根部拔起，裝入自封袋，編號，密封并帶回實驗室。樣品經山東省科學院王曉研究員鑒定為五加科植物西洋參Panax quinquefolium L.的根。將西洋參分為（6+6+8）三組，分別收集距離根部1～2 cm的土壤，混合均勻，過40目篩去除固形物，三個生物學重復的健康根際土樣品分別標記為h.1，h.2，h.3（健康組），銹腐病組根際土樣品分別標記為r.1，r.2，r.3（銹腐病組），用于后續微生物分離和測序。

2方法與結果

2.1傳統分離法

2.1.1根際土微生物的分離純化

準確稱取10.0±0.1 g土壤，加入90 mL無菌水中，混勻，180 r/min下振蕩30 min，獲得1 g/mL的土壤懸濁液，用無菌水依次將上清液稀釋到10-2～10-7 g/mL。西洋參根際土微生物的分離分別采用營養瓊脂、LB瓊脂和PDA培養基。吸取合適濃度的樣品稀釋液100 μL滴在培養基上，均勻涂布至吸收，30 ℃培養1～7 d，挑取單菌落純培養，篩選出培養特征不同的菌落，劃線法接種，保存。

2.1.2根際土細菌總DNA提取、16S rDNA擴增和鑒定

將分離的單菌落進行搖床培養，用2 mL離心管收集1.0×109（OD600（1～1.5）×1.0 mL）的細菌培養物，12 000 r/min離心30 s，得到菌體沉淀，然后利用試劑盒提取細菌的總DNA。模板采用提取的DNA，擴增所用引物為27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）、1492R（5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′）。PCR 擴增體系為1.0 μL DNA，5.0 μL 10×Buffer（含 2.5 mmol/L Mg2+），1.0 μL Taq 聚合酶，1.0 μL dNT，1.5 μL 27F引物，1.5 μL 1 492 R引物和39.0 μL去離子水；擴增步驟如下：95 ℃ 5 min→95 ℃ 0.5 min→58 ℃ 0.5 min→72 ℃ 1.5 min→72 ℃ 7 min，實施35次擴增循環。待反應結束，使用1%瓊脂糖（AG）凝膠電泳測定。借助凝膠回收試劑盒完成PCR產物的回收，對于已純化菌株的PCR產物，借助測序儀實施DNA測序。借助BLAST程序和核酸數據庫NCBI對已拼接序列文件展開搜索，獲得最為接近于待測物種序列的物種信息，具體結果詳見表1。

其中，共分離獲得24株細菌，包括從健康西洋參根際土壤中分離到17株細菌（SUB163912731419）和土銹病西洋參根際土壤中分離到7株細菌（SUB163918772667）。從健康土壤組中鑒定出芽孢桿菌屬、短桿菌、類芽孢桿菌、賴氨酸芽孢桿菌和節桿菌屬；在銹腐病組鑒定出了寡養單胞菌屬、根瘤菌屬、假單胞菌屬和芽孢桿菌。結果顯示，芽孢桿菌和假單胞菌分別為健康和銹腐病西洋參根際土壤中的優勢菌屬。

2.1.3根際土真菌總DNA提取、ITS擴增和鑒定

借助真菌提取試劑盒，完成真菌DNA的提取。對于真菌，在模板為所得DNA下實施ITS擴增，引物分別是ITS1 （5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）、ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）；擴增反應體系除了27F和1492R引物換為ITS1和ITS4引物外，PCR 擴增反應體系和擴增程序和鑒定與2.1.2一致。真菌鑒定結果見表2。

結果表明，從根際土壤中共分離獲得25株真菌，包括從健康西洋參根際土壤中分離到15株真菌（SUB1639272388803）和土銹病西洋參根際土壤中分離到10株真菌（SUB1639299433676）。對于真菌，傳統分離方法得到的真菌進化距離較大，具有較遠的親緣關系。自健康組與銹腐病組皆分離得到青霉屬和鏈格孢屬。另外，自健康組內分離出帚枝霉屬、不整孢菌屬、枝頂孢屬、毛霉菌屬、曲霉屬、錐毛殼屬；自銹腐病組內分離出傘狀霉屬、籃狀菌屬、毛殼菌屬和鐮刀菌屬。

2.2高通量測序方法

2.2.1根際土基因組的DNA提取和PCR擴增及檢測

借助FastDNASpin Kit土壤DNA提取試劑盒，完成土壤樣品內基因組總DNA的提取，AG凝膠電泳測定目標DNA片段的完整性與大小，對其濃度與純度展開進一步準確測定。把提取所得基因組DNA當做模板，對于16S V4區引物（515F與806R）以及ITS 1區引物（ITS5-1737F與ITS2-2043R），經由真菌特異引物實施PCR擴增。利用QIAquick瓊脂糖凝膠試劑盒回收目標DNA片段后，進行文庫構建和上機測序。

2.2.2序列結果質量分析

自下機數據內對各樣本數據進行有效拆分，將引物序列截去，借助FLASH有效拼接各樣本的序列，獲得原始序列數據。在質控過濾以及嵌合體序列去除結束，獲得對后續分析有應用價值的有效數據。拼接的原始數據上傳至國家微生物科學數據中心（SUB1647514035706）。

從西洋參根際土的細菌和真菌分別獲得75 975條、71 075條高質量的基因序列，74 329條、68 907條分類注釋序列，用于后續構建分類單元（operational taxonomic unit，OTUs）和獲得注釋信息。有效細菌和真菌序列分別獲得1 138和116個OTUs（表3）。

以抽取的測序數據量（Sequences number）與對應的物種數（OTU numbers）來構建稀釋曲線，用于判斷當前測序深度下測序數據量是否能夠反映檢測到的物種數。從圖1（a）和（b）可以看出，兩組樣本隨著測序深度增加，曲線均已經趨于平緩，說明在當前測序深度下測序數據合理，可反映樣本中絕大多數細菌和真菌的物種信息。此外，根據稀釋曲線可以看出，細菌群落的物種數高于真菌群落的物種數，健康組物種數高于銹腐病組。

2.2.4OTU聚類、物種注釋和物種豐度分析

在97%相似水平下，使用Uparse對2組樣本的非重復序列進行OTU聚類。利用Mothur方法計算Alpha多樣性，SSU rRNA數據庫和MUSCLE軟件進行物種注釋和多序列比對分析。根據分類學分析結果，使用R語言對數據進行計算，可獲得樣本在門、綱、目、科、屬各個分類水平上的分類情況，進而了解微生物的種類及豐度，觀察一定條件下的物種的相對豐度。

2組根際土壤樣本細菌OTUs歸類到32門48綱110目213科432屬；真菌OTUs歸類到6門11綱17目26科26屬。在門和屬水平上對銹腐病組和健康組2組樣品的物種組成進行分析。圖2（a）是門水平下健康和銹腐病西洋參根際細菌的相對豐度累加圖，反映的是最大豐度排名前10的物種。其中，健康組和銹腐病組相對豐度占比0.4%以上的細菌名稱見表4。

圖2（b）為屬水平下健康和銹腐病西洋參根際細菌的相對豐度累加圖。由圖可得，未明確的藍細菌屬（unidentified Cyanobacteria）是優勢屬。其中，銹腐病組的擬桿菌屬（Bacteroides）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、土生單胞菌屬（Terrimonas）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、未明確的腸桿菌屬（unidentified Enterobacteriaceae）、鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）等根際細菌菌群明顯高于健康組，上述菌群在銹腐病組的占比依次為1.51%、1.08%、0.80%、0.76%、0.52%、0.45%。

兩組西洋參土壤中測得的真菌菌群較少，僅有6個門和10個屬，且占比不足15%，結果見圖2（c）和（d）。根際土真菌合計鑒定出6個門類，分別為子囊菌門（Ascomycota）、捕蟲霉門（Zoopagomycota）、被孢菌門（Mortierellomycota）、球囊菌門（Glomeromycota）、毛霉門（Mucoromycota）、擔子菌亞門（Basidiomycota），其中子囊菌門（Ascomycota）在鑒定出的土壤菌群中有較高的豐度（健康組7.76%；銹腐病組10.31%）。從屬水平看，鑒定出的真菌相對豐度較少。其中，從健康組中鑒定出異莖點霉屬（Paraphoma）、鏈格孢屬（Alternaria）、不整孢菌屬（Plectosphaerella）、被孢霉屬（Mortierella）、枝孢霉屬（Cladosporium）、鐮刀菌屬（Fusarium）、Cadophora、Ophiosimulans、Volutella以及頭束霉屬（Cephalotrichum）這10個菌屬，以鏈格孢菌（Alternaria）最多，占總真菌的0.46%。銹腐病真菌中以異莖點霉屬（Paraphoma）和不整孢菌屬（Plectosphaerella）最多，分別占總真菌的2.54%和0.10%。

2.2.6物種多樣性分析

Alpha多樣性可用于反映群落的物種豐富度和多樣性。在相似度97%的水平下，利用Coverage、Chao1、ACE、Shannon和Simpson等指數揭示西洋參根際土壤微生物群落的物種豐富度和多樣性（表5）。

Coverage用于表示樣品測序的覆蓋度，6個樣本在文庫中的覆蓋率高于99.9%，能夠代表西洋參根際土微生物的真實信息。Chao1和ACE指數可用來評估物種的豐富度。健康與銹腐病細菌組的Chao1指數分別平均為1 417.610和839.363，ACE指數分別平均為1 441.020和911.925，說明健康組細菌物種數量高于銹腐病組。真菌的Chao1指數分別平均為115.686和104.781，ACE指數分別平均為130.042和104.449，說明健康組真菌物種數量略高于銹腐病組。Shannon和Simpson指數可用于衡量西洋參根際土壤微生物的多樣性，其中Shannon指數大小與物種多樣性成正比，Simpson指數成反比。健康與銹腐病組細菌的Shannon指數分別平均為4.033和2.256，Simpson指數分別平均為0.573和0.732，說明健康組的細菌多樣性高于銹腐病組；真菌的Shannon指數分別平均為1.411和1.349，Simpson指數分別平均為0.363和0.370，說明兩組的真菌多樣性無明顯差異，健康組略高于銹腐病組。Alpha多樣性分析結果與根際土中細菌與真菌稀釋曲線分析一致。

3討論與結論

3.1傳統培養方法分離根際土壤微生物

近年來，研究發現芽孢桿菌屬是健康西洋參內生菌和根際土壤中的優勢菌，可以產生酶類、細菌素、多肽抗生素等多種次生代謝產物，是西洋參生長的有益菌[12]。在分離的24株細菌中，其中11株為芽孢桿菌，說明芽孢桿菌是西洋參根際土壤中的優勢菌[13]。在分離的25株真菌中，健康組西洋參土壤中青霉屬占比最多。芽孢桿菌屬和青霉菌屬是醫用抗生素的主要來源，且西洋參微生物次級代謝產物資源并未得到充分開發，這將在下一步工作中進行。

傳統方法在銹腐病組分離獲得假單胞菌（布氏假單胞菌、韓國假單胞菌和Pseudomonas grimontii）和根瘤菌，這與先前Choi等[10]在西洋參銹腐病參種分離獲得Pseudomonas marginalis、P. veronii、Pseudomonas sp.、Rhizobium legumninosarum和R. tropica等在屬水平結果一致，但在菌種水平上存在差異。此外，Punja等[9]的研究表明西洋參根部表面顏色的變化與酚類化合物在細胞中紊亂積累和細胞中鐮刀菌屬（Fusarium falciforme）的菌絲有關。本研究中，在銹腐病西洋參根際土中分離得到一株鐮刀菌（Fusarium falciforme），說明該菌株可能與西洋參出現銹腐病有關，需要進一步探究。

3.2染病和健康西洋參根際土壤微生物多樣性

目前，關于銹腐病侵染對西洋參根際土壤微生物群落多樣性造成的影響未見報道，本研究以健康和銹腐病西洋參根際土為研究對象，采用高通量測序技術，分析了兩者根際土微生物之間的群落結構及多樣性差異。從Chao 1、ACE、Shannon和Simpson（表4）4個多樣性指數變化可知，銹腐病原菌的入侵改變了西洋參根際土壤微生物群落的多樣性。從整體上看，土壤細菌群落多樣性高于真菌群落多樣性，感染銹腐病后的根際土壤中的細菌多樣性減少；土壤真菌多樣性略有減少，并無明顯差異。其中，土壤細菌的變化規律與沈宗專等[14]關于罹患青枯病的番茄土壤細菌相似，原因可能是細菌多樣性與生態系統生產力之間存在正相關性。真菌的變化規律與伍曉麗等[15]關于健康和根腐病根際土壤真菌組成的研究相似，此外，研究發現連作障礙也可能與真菌多樣性減少有關[16]。

3.3染病和健康西洋參根際土壤細菌群落組成及差異性

此項研究分析了威海市的健康和感染銹腐病西洋參的根際土壤細菌群落結構。被銹腐病感染后，藍細菌門（Cyanobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）和軟壁菌門（Tenericutes）比例大幅降低，如此可見三者皆對銹腐病原菌具備一定敏感性。另外，一旦患銹腐病，擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和酸桿菌門（Acidobacteria）大幅上調；同時疣微菌門（Verrucomicrobia）和衣原體門（Chlamydiae）產生，說明這些菌株可能有誘導或者防御西洋參銹腐病的作用。

3.4感病和健康西洋參根際土壤真菌群落組成及差異性

通過ITS測序鑒定出的西洋參根際土壤真菌在門水平下組成相對簡單，包括6個門類，其中子囊菌門（Ascomycota）最多。感染銹腐病后子囊菌門（Ascomycota）、被孢霉門（Mortierellomycota）和擔子菌亞門（Basidiomycota）比例明顯增加，說明這些真菌可能誘導或者防御西洋參銹腐病。從屬水平看，鑒定出的真菌的相對豐度較少，銹腐病組鑒定出異莖點霉屬（Paraphoma）和不整孢菌屬（Plectosphaerella）最多；健康組的鏈格孢菌（Alternaria）最多。目前，已利用傳統方法在健康組土壤中分離到了帚枝霉屬、曲霉屬、鏈格孢屬和不整孢屬；在銹腐病土壤中分離到了毛殼菌屬、鐮刀菌屬和鏈格孢屬等。當前進行傳統培養菌株鑒定的較少，在未來的研究中，筆者將依據高通量測序結果進一步分離和鑒定。

本研究結合傳統分離及高通量測序非培養技術兩種方法，獲得了大量西洋參根際土壤真菌和細菌微生物群落信息，初步明確了健康和銹腐病西洋參根際土所包含的微生物群落組成及多樣性，探討了微生物在健康和銹腐病西洋參根際土之間的差異。本研究充分挖掘西洋參根際土壤中的微生物資源，探討健康和銹腐病西洋參微生物之間的聯系，為建立西洋參根際土壤微生物系統、病原學研究及生物防治提供參考，為西洋參功能菌株篩選及活性成分的富集提供數據支撐。

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