超高效液相色譜-四級桿/靜電場軌道阱高分辨質譜法同時檢測補中益氣丸中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、甘草酸銨的含量

摘要： "建立了一種超高效液相色譜-四級桿/靜電場軌道阱高分辨質譜同時檢測補中益氣丸中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷和甘草酸銨含量的方法。采用超高效液相色譜-四級桿/靜電場軌道阱質譜，Hypersil Gold C18型色譜柱，乙腈-0.1%甲酸水梯度洗脫，流速0.4 mL/min，柱溫40 ℃，進樣量1 μL；采用電噴霧離子源，正離子模式下，在質荷比100～1 500范圍內全掃描，通過提取待測成分的精確質量數進行定量。結果表明，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、甘草酸銨線性范圍分別為0.089 1～1.425 0 μg/mL、0.098 4～12.600 0 μg/mL、7.425 0～29.700 0 μg/mL（r≥0.999 3），檢測限分別為5.57、4.10、5.80 ng/mL，定量限分別為22.26、12.30、23.20 ng/mL，精密度、重復性及樣品穩定性（24 h）良好，加樣回收率91%～105%（δRSD≤5.0%，n=6）。本方法簡便快捷、特異性強、靈敏度高，可同時檢測補中益氣丸中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、甘草酸銨的含量。

關鍵詞： 超高效液相色譜-四級桿/靜電場軌道阱高分辨質譜；補中益氣丸；毛蕊異黃酮葡萄糖苷；橙皮苷；甘草酸銨

中圖分類號： R284.1 文獻標志碼：A文章編號：1002-4026（2023）02-0016-07

開放科學（資源服務）標志碼（OSID）：

Simultaneous determination of calycosin 7-O-glucoside， hesperidin，

and ammonium glycyrrhizinate in Buzhongyiqi Pills via

UPLC-Q/Orbitrap HRMS

WU Dan1， HUANG Biyun1， WANG Jing2， LIU Long2*

（1. School of Pharmaceutical Sciences， Guangzhou Medical University， Guangzhou 511436，China;

2.Taizhou Medical Hi-Tech Zone Public Services Platform， Taizhou 225300，China）

Abstract∶ In this study， we have developed a novel method for the simultaneous determination of calycosin 7-O-glucoside， hesperidin， and ammonium glycyrrhizinate in Buzhongyiqi Pills based on UPLC-Q/Orbitrap HRMS using Hypersil Gold C18 chromatographic column. The gradient mobile phase comprised acetonile as well as water containing 0.1% formic acid. The flow rate， column temperature， and injection volume were 0.4 mL/min， 40 ℃， and 1 μL， respectively. Mass spectrometer was operated using an electrospray ionization source in the positive ion mode for detection. The scan range was 100～1 500 m/z. Quantification was performed by extracting the accurate mass of the target compounds.The linear ranges of calycosin 7-O-glucoside，hesperidin， ammonium glycyrrhizinate were 0.089 1～1.425 0 μg/mL，0.098 4～12.600 0 μg/mL， and 7.425 0～29.700 0 μg/mL （r≥0.999 3）， respectively. Furthermore， the limits of detection were 5.57 ng/mL， 4.10 ng/mL， and 5.80 ng/mL， respectively， while the limits of quantitation were 22.26 ng/mL， 12.30 ng/mL， and 23.20 ng/mL， respectively. The results demonstrated good precision， repeatability， and sample stability. Spike recoveries were 91%～105%（"δRSD≤5.0%，n=6）. This method is simple， accurate， and highly sensitive， which is suitable for the simultaneous determination of calycosin 7-O-glucoside， hesperidin， and ammonium glycyrrhizinate in Buzhongyiqi Pills.

Key words∶ UPLC-Q/Orbitrap HRMS; Buzhongyiqi Pills; calycosin 7-O-glucoside; hesperidin; ammonium glycyrrhizinate

補中益氣丸由黃芪（蜜灸）、黨參、甘草（蜜灸）、白術（炒）、當歸、升麻、柴胡、陳皮、生姜、大棗等10味中藥組成，具有補中益氣，升陷利濕的功效[1-2]。毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、甘草酸銨分別為黃芪、陳皮、甘草的主要有效成分。補中益氣丸收載于《中國藥典》2020版一部[3]成方制劑和單味制劑，其質量標準有鑒別、檢查和含量測定項，其中含量檢測項僅對黃芪甲苷進行定量測定，對其他有效成分未做要求。目前，文獻報道的補中益氣丸中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、甘草酸銨的含量檢測多采用高效液相色譜（HPLC）法、液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）法等[4-7]，以上分析方法可實現成分的含量檢測，但方法有一定的局限性。HPLC法分析時間較長，方法特異性較差，靈敏度較低；UPLC-MS/MS法雖能部分克服HPLC法的不足，但其實驗過程需優化待測成分離子對及碰撞能等，方法開發過程繁瑣復雜。超高效液相-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜（UPLC-Q/Orbitrap HRMS）法與UPLC-MS/MS法相比具有較高質量分辨率及高質量精度，可提高定性及定量分析準確度[8-9]，其靈敏度高，特異性強；且軌道阱高分辨質譜在全掃描模式下，除能提供準確的定性信息外，還可以通過提取化合物特征離子進行定量分析，方法簡便快捷，目前已廣泛應用于食品安全、藥品安全、中藥成分分析、代謝組學、蛋白質組學等領域[10-16]。本研究采用UPLC-Q/Orbitrap HRMS法同時檢測補中益氣丸中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷和甘草酸銨的含量，縮短了分析時間，提高了分析方法的靈敏度及特異性，為補中益氣丸質量標準的制定提供了技術參考。

1儀器與材料

1.1儀器

UPLC-Q/Orbitrap HRMS儀，液相系統為Dionex 3000型高壓液相色譜系統，并配備Q Exactive Focus加熱型電噴霧離子源，Xcalibur 質譜工作站（ 美國Thermo Fisher Scientific 公司）；ME155DU十萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；TLE3000萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Research移液器（德國 Eppendorf 公司）；KQ-300E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；CT15RT超速冷凍離心機（天美科學儀器有限公司）；Gen Pure超純水器（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2試劑與藥品

毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號RFS-M02001902019，成都瑞芬思生物科技有限公司）、橙皮苷（批號15070211，成都曼斯特生物科技有限公司）、甘草酸銨（110731-200614，中國食品藥品檢定研究院），對照品純度均大于98%；甲醇（色譜純，Merck公司）；乙腈（色譜純，Merck公司）；甲酸（色譜級，Thermo Fisher Scientific公司）；實驗用水為超純水，由GenPure Pro型超純水處理系統（Thermo Fisher Scientific公司）制備；補中益氣丸1（202201194，九芝堂股份有限公司）、補中益氣丸2（211004，仲景苑西制藥股份有限公司）、補中益氣丸3（20220123，江西藥都樟樹制藥有限公司）。

2實驗方法

2.1溶液制備

2.1.1對照品溶液的制備

分別稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、甘草酸銨對照品2 mg，精密稱定，用甲醇溶解并定容，制得質量濃度約0.2 mg/mL各對照品單標儲備液。分別精密量取各對照品單標儲備液適量至同一量瓶中，用甲醇稀釋制得混合對照品儲備液，混合對照品儲備液中各成分的質量濃度分別為毛蕊異黃酮葡萄糖苷7.13 μg/mL、橙皮苷63.00 μg/mL和甘草酸銨148.50 μg/mL。取混合對照品儲備液適量，用甲醇稀釋相應的倍數即得不同質量濃度的對照品溶液。

2.1.2樣品溶液的制備

取藥品約50粒，研細，過篩，取細粉0.500 0 g，精密稱定，置離心管中，加入80%甲醇10 mL，加蓋，稱定質量。置超聲波清洗器中，超聲提取60 min（溫度35 ℃，功率700 W，頻率40 kHz），提取完成后冷卻至室溫，稱定質量，用80%甲醇補足所失質量。超聲所得液體離心處理5 min（轉速1 000 r/min），取離心后上清液100 μL置于進樣瓶中，加入80%甲醇900 μL，混勻即制得樣品溶液。

2.2色譜及質譜條件

2.2.1色譜條件

Dionex 3000型高壓液相色譜系統；色譜柱Hypersil Gold C18 （100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；柱溫40 ℃；流動相0.1%甲酸-水（體積比）與乙腈；流速0.4 mL/min；梯度洗脫：0～3 min，10%乙腈；3～10 min，10%乙腈→80%乙腈；10～13 min，80%乙腈；進樣量1 μL。

2.2.2質譜條件

Q Exactive Focus 靜電場軌道阱高分辨質譜儀；離子源為加熱型電噴霧離子源；正離子全掃描模式，掃描范圍100～1 500 m/z，分辨率70 000；鞘氣流速4.82 L/min，輔助氣流速9.58 L/min，吹掃氣流速0 L/min；噴霧電壓3.5 kV，噴霧電流55.0 μA；毛細管溫度320 ℃，S-lens電壓55.0 V，輔助氣加熱溫度310 ℃。其他質譜參數見表1，待測化合物的質譜圖見圖1。

3實驗結果

3.1特異性考察

分別精密吸取空白溶液、對照品溶液及樣品溶液（批號202201194）1 μL，按2.2項下色譜及質譜條件進樣分析，采集空白溶液、對照品溶液及樣品溶液離子流圖，并提取各待測成分相應的特征離子峰得提取離子流圖，見圖2。由圖可得各待測成分之間分離效果良好，空白溶液對各待測成分的檢出無影響，方法特異性良好。

3.2檢測限及定量限考察

取2.1.1項下混合標準品儲備液，用甲醇逐級稀釋，制得不同質量濃度的對照品溶液。精密吸取不同質量濃度的對照品溶液1 μL，按2.2項下色譜及質譜條件進樣分析，采集各溶液離子流圖，提取各待測成分相應的特征離子峰，記錄相應的峰面積及信噪比S/N。選取S/N大于3時，各待測成分的質量濃度作為檢測限；選取S/N大于10時，各待測成分的質量濃度作為定量限。結果表明：各待測成分的檢測限分別為毛蕊異黃酮葡萄糖苷5.57 ng/mL，橙皮苷4.10 ng/mL，甘草酸銨5.80 ng/mL；各待測成分的定量限分別為毛蕊異黃酮葡萄糖苷22.26 ng/mL，橙皮苷12.30 ng/mL，甘草酸銨23.20 ng/mL。

3.3線性關系考察

取2.1.1項下混合對照品儲備液，用甲醇稀釋，制得不同質量濃度的對照品溶液。分別精密吸取不同質量濃度的對照品溶液1 μL，按2.2項下色譜及質譜條件進樣分析，采集各溶液離子流圖，提取各待測成分相應的特征離子峰，記錄相應的峰面積。對各待測成分的峰面積（Y）及質量濃度（X）進行線性關系考察，在各待測成分線性范圍內，計算線性回歸方程及相關系數，繪制線性曲線，結果見表2。結果表明各待測成分在相應的線性范圍內，其峰面積與質量濃度相關系數r≥0.999 3，線性關系良好。

3.4精密度考察

取2.1.1項下同一對照品溶液，按2.2項下色譜及質譜條件進樣分析，連續進樣6次。采集各溶液離子流圖，提取各待測成分相應的特征離子峰，記錄相應的峰面積，計算各待測成分峰面積的日內相對標準偏差（δRSD）。取同一對照品溶液，按2.2項下色譜及質譜條件進樣分析，每天進樣測試1次，連續測試6 d，記錄相應化合物的峰面積，計算各待測成分峰面積的日間δRSD。毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、甘草酸銨峰面積日內δRSD分別為2.41%、1.52%、1.45%，日間δRSD分別為3.15%、2.03%、1.36%，該方法精密度良好。

3.5重復性考察

取同一批次（批號202201194）樣品，按2.1.2項下方法制備樣品溶液，平行配制6份，分別精密吸取6份樣品溶液1 μL，按2.2項下色譜及質譜條件進樣分析，采集各溶液離子流圖，提取各待測成分相應的特征離子峰，記錄相應的峰面積，代入相應的線性回歸方程，計算6份樣品溶液中各待測成分的含量，計算含量的δRSD。毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、甘草酸銨含量的δRSD分別為2.22%、3.82%、4.00%，表明該方法重復性良好。

3.6穩定性考察

取同一樣品（批號202201194）溶液（按2.1.2項下方法制備），室溫條件下放置，按2.2項下色譜及質譜條件于0 、2 、4、6 、8、12、24 h進樣分析，采集各溶液離子流圖，提取各待測成分相應的特征離子峰，記錄相應的峰面積，計算峰面積的δRSD。毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、甘草酸銨峰面積δRSD值分別為2.61%、1.99%、1.76%，樣品溶液室溫下24 h內穩定性良好。

3.7加樣回收率考察

取已知含量的同一批次（批號202201194）樣品約0.5 g，精密稱定，分別按相應量約80%、100%、120%準確加入毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、甘草酸銨對照品，每組平行3份，按2.1.2項下方法制備樣品溶液，取樣品溶液按2.2項下色譜及質譜條件進樣分析，采集各溶液離子流圖，提取各待測成分相應的特征離子峰，記錄峰面積，代入相應的線性回歸方程，計算各待測成分含量、加樣回收率、平均加樣回收率及加樣回收率δRSD，部分結果見表3（全表見OSID科學數據與內容附表1）。結果表明各待測成分平均加樣回收率在94%～99%之間，回收率δRSD均小于5%，該方法準確性良好。

3.8樣品測定

本文選取3個不同廠家的補中益氣丸進行檢測。按2.1.2項下方法制備樣品溶液，每批次樣品平行制備3份樣品溶液，取各樣品溶液按2.2項下色譜及質譜條件進樣分析，采集各溶液離子流圖，提取各待測成分相應的特征離子峰，記錄峰面積，代入相應的線性回歸方程，計算各待測成分含量。結果表明，毛蕊異黃酮葡萄苷的含量分別為81.57、51.20、44.35 μg/g，橙皮苷的含量分別為155.72、1 050.96、152.32 μg/g，甘草酸銨的含量分別為2 950.27、2 991.62、2 953.11 μg/g，見表4。

4討論

4.1提取方法的優化

在樣品溶液制備過程中，本研究對樣品提取方法（超聲提取、加熱回流提取）進行考察，結果表明兩種提取方法提取效率相差不大，為簡化實驗操作，故選擇超聲提取；同時還對樣品提取溶劑（50%甲醇、80%甲醇、純甲醇、水）進行考察，結果表明80%甲醇作為提取溶劑，可獲得最多的提取物。

4.2色譜條件的優化

本文采用0.1%甲酸水作為流動相，可避免色譜峰拖尾現象，同時可提高待測成分的電離效率，提高方法靈敏度。同時為提高待測成分的分離效果，縮短分析時間，本研究對不同的流動相組合（甲醇-0.1%甲酸水，乙腈-0.1%甲酸水）及梯度洗脫程序進行考察，最后確定采用乙腈-0.1%水作為流動相，梯度洗脫，各待測成分分離效果好，分析時間較短，方法特異性強。

4.3定量離子的選擇

本研究所使用高分辨質譜儀具有高分辨率及高精確質量數，其在全掃描模式下，不僅可提供準確的定性信息，還可選取化合物特征離子進行定量分析，簡化了質譜參數的優化過程，方法更簡便快捷。研究分別采用正離子、負離子兩種模式對待測成分進行分析，發現各待測成分在兩種模式下均有響應，但正離子模式下響應明顯強于負離子模式，同時分別選取各化合物響應強的特征離子作為定量離子進行定量分析，各化合物定量離子數與理論質量數進行比較，偏差均在1.0 ×10-6之內，數據見表1。

5結論

本研究建立了UPLC-Q/Orbitrap HRMS檢測補中益氣丸中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、甘草酸銨含量的方法，結果表明，不同廠家之間毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷含量差異較大，甘草酸銨含量差別小，可能與原藥材（產地、種植、采摘等）及制劑生產工藝有關。本文所建立的分析方法簡便快捷、分析時間短、方法特異性強、準確度靈敏度高，可同時檢測補中益氣丸中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、甘草酸銨的含量，為其質量標準的制定提供了技術參考。

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