瀕危植物金花茶組織培養(yǎng)技術研究進展

摘要：金花茶是世界珍稀觀賞樹種和種質資源，素有“植物界大熊貓”的美譽，兼具極高的觀賞、營養(yǎng)和藥用價值，具有廣闊的市場前景。近年來，金花茶人工種植規(guī)模不斷擴大，面臨種苗供給不足問題。植物組織培養(yǎng)技術是種苗規(guī)?；a的有效途徑，是緩解金花茶種苗供給不足問題的關鍵。文章從外植體的選擇和消毒，培養(yǎng)基和生長調節(jié)劑、培養(yǎng)條件、生根培養(yǎng)與移栽等方面對金花茶組織培養(yǎng)技術進行綜述，并探討了金花茶組織培養(yǎng)過程中存在的問題及解決對策。該文旨在為金花茶高效組培體系的建立提供科學理論依據和技術指導。

關鍵詞：金花茶；組織培養(yǎng)；外植體；培養(yǎng)基；生根培養(yǎng)與移栽

中圖分類號：S685.14 文獻標志碼：A

Research Progress of Tissue Culture Technology of Endangered Plant Camellia nitidissima

HE Kaiming1， LUO Yun2， GAN Chunyan3*

（1Golden Camellia Park of Nanning， Nanning， Guangxi 530004， China; 2Nanning Qingxiushan Tourism Development Co.， Ltd.， Nanning， Guangxi 530031，China; 3Guangxi Forestry Research Institute， Nanning， Guangxi 530002， China）

Abstract： Camellia nitidissima， a rare ornamental tree and germplasm resources in the world， known as the “plant world of pandas”， and was highly valued for ornamentation， nutrition and medicinal use， enjoying broad market prospects. In recent years， the artificial cultivation scale of C. nitidissima was expanding， encountering problem of insufficient seedling supply. Plant tissue culture technology， an effective way to produce seedlings on a large scale， is the key to alleviate the problem of insufficient C. nitidissima seedling supply. This paper reviewed C. nitidissima tissue culture technology in terms of explant selection and sterilization， medium and growth regulators， culture conditions， rooting culture and transplantation， meanwhile problems and countermeasures were discussed in C. nitidissima tissue culture. This paper aims to provide scientific theoretical basis and technical guidance for efficient C. nitidissima tissue culture system.

Key words： Camellia nitidissima; tissue culture; explant; medium; rooting culture and transplantation

金花茶（Camellia nitidissima ）俗稱“福地黃花山茶”，是山茶科山茶屬植物，為林下常綠灌木或小喬木，是目前發(fā)現的唯一一種花瓣呈現金黃光澤的山茶花。因其僅分布在E 104°～108°56′和N 20°32′～23°53′之間的狹窄范圍內[1]，金花茶素有“植物界的大熊貓”的美譽，是世界珍稀觀賞樹種，與銀杉、桫欏、珙桐等珍貴“植物活化石”齊名，國外還將其稱為“東方魔茶”[2]。金花茶不僅色澤鮮艷，花期較長，而且具有極高的觀賞價值和藥用價值，我國民間也常將金花茶的花和葉用于治療咽喉炎、腹瀉、腎炎、痢疾和月經不調等疾病[3]。最近的研究表明金花茶富含黃酮類、植物多酚類和皂苷類等多種藥理活性的化合物[4]，這些化合物對人體健康有益，在抗衰老、抗氧化和抗腫瘤等方面有優(yōu)良的表現[5]。此外，在2010年時金花茶被批準為新資源食品[6]。

由于具有極高的觀賞、營養(yǎng)和藥用價值，金花茶受到了市場廣泛關注，人工種植面積在逐年擴大，具有廣闊的市場前景[7]。金花茶的繁育技術包括種子繁育、扦插繁育、嫁接繁育、組培快繁和雜交育種等[8]。但由于存在種子繁育結實率、發(fā)芽率和出苗率低；扦插和嫁接容易攜帶母株自身病毒，成活率和生根率低；雜交繁育成活率低等技術難題：金花茶依然面臨著種苗供需問題。組培快繁具有一致性好，增殖系數高，條件可控等優(yōu)點，是種苗規(guī)?；a的有效途徑，是緩解金花茶種苗供給不足問題的關鍵。但金花茶組織培養(yǎng)存在容易污染，外植體滅菌不夠徹底和組培苗移栽成活率較低等問題，這些嚴重制約了金花茶產業(yè)的快速發(fā)展。目前金花茶組織培養(yǎng)方面的綜述并不多，本文從金花茶組織培養(yǎng)影響因素及存在問題和解決對策兩個方面開展綜述和討論，不僅可以為金花茶高效組培體系的建立提供科學理論依據和技術指導，也將為金花茶種質資源的進一步開發(fā)利用提供參考。

1 金花茶組織培養(yǎng)概述

金花茶的無性繁殖方面研究開展相對較晚，始于20世紀80年代，包括無性系選育、愈傷組織誘導試驗、離體胚誘導等研究[9]。因金花茶僅生長在熱帶季風氣候區(qū)的中國西南部和越南北部，有關金花茶的研究主要集中在國內，國外研究極少。本文以中國知網為數據源，以“金花茶組培”“金花茶組織培養(yǎng)”“金花茶離體培養(yǎng)”“金花茶組培快繁”等關鍵詞作為主題進行搜索，檢索1980―2023年在國內發(fā)表的相關文獻，剔除重復和實際內容不相關文獻后共檢索到63篇文獻。從圖1可看出：1980―2015年間保持每年低于3篇的發(fā)文量，大部分只有一篇文獻，僅1986、2005和2014年這3年，達到3篇；2016年發(fā)表的金花茶組織培養(yǎng)方面文章最多，達10篇；2016―2020年間，發(fā)文量保持在3篇以上，這表明現階段我國金花茶植物組織培養(yǎng)研究的成果越來越多?？傮w來說，隨著我國經濟發(fā)展，人們越來越追求綠色健康的生活，為此，金花茶得到了廣泛的應用與開發(fā)[10]，但是金花茶的組培快繁研究工作目前還處在起步階段，有待開展更廣泛和更深入的研究。

2 組織培養(yǎng)影響因素

2.1 外植體

2.1.1 外植體的選擇

植物細胞的獨特之處在于它們在分化狀態(tài)下，仍保持全能性和發(fā)育可塑性，并在適當的培養(yǎng)條件下，以激素依賴的方式去分化、增殖并隨后再生成成熟植株[11]。外植體是從活體植物上切下的組織或器官，用于初次接種的離體培養(yǎng)材料[12]。從理論上來說，所有的植物細胞在適宜條件下都有發(fā)育成完整植株的可能。但是，不同植物本身的特異性、同一植物不同組織器官、同一組織器官不同發(fā)育年齡和生理狀態(tài)等因素，會影響愈傷組織誘導率或體胚體系的成功建立，這主要是源于這些組織器官的細胞分化能力不同[3]。因此，選擇合適的外植體是組培快繁體系能否成功建立的首要問題，對于建立植物穩(wěn)定高效的組培體系至關重要[13][14]。

在金花茶組織培養(yǎng)過程中，種子、葉片、子葉胚、胚根、種胚、頂芽、花藥、花絲、莖尖和莖段都可以作為外植體。由表1、表2可知：種子是金花茶外植體最常用部位，可能是由于種子具有極幼嫩的分生組織細胞，并且具有外種皮包裹，能有效隔絕病菌，在不同成熟度的種子中，直徑gt;1.0 cm的種子具有最佳的萌發(fā)效果；莖段也是金花茶最常用的外植體材料之一，不同品種金花茶莖段都表現出優(yōu)良的誘導率，這可能因為莖段具有遺傳性穩(wěn)定，再生能力強的特點。金花茶不同組織作為外植體的愈傷組織誘導率有差異，這與山茶屬植物不同組織芽器官發(fā)生和體細胞胚發(fā)生均有不同程度的差異結果相似[14]。最適合誘導體胚發(fā)生的外植體一般是種子和幼嫩葉片。

2.1.2 外植體消毒

在選定合適的外植體后，隨即進行的就是篩選適宜的消毒方式。外植體的滅菌能夠有效預防組織培養(yǎng)過程中的污染及褐化問題，對組織培養(yǎng)能否順利進行的影響非常大[23]。不同外植體類型對

滅菌劑的種類﹑濃度以及處理時間長短的敏感程度不同，因此，外植體消毒需要從消毒劑的種類選擇和消毒時間的控制兩方面進行討論[12]。

在對崇左金花茶外植體進行消毒時選擇了4種消毒劑（NaClO溶液、75%乙醇、0.1% HgCl2、0.2% HgCl2），結果表明，乙醇配合升汞對崇左金花茶外植體的消毒處理仍然非常有效[24]。設計不同濃度的HgCl2對四季金花茶和金花茶種子進行滅菌，發(fā)現0.1% 的HgCl2的滅菌效果最佳[9]。采用70%乙醇浸泡金花茶花絲和花藥1、3、5、10、15 min，污染率分別為（58.7 ± 6.1）%、（35.3 ± 4.2）%、（14.0 ± 4.0）%、0、0[20]。采用75%乙醇配合0.1%升汞對金花茶莖段進行消毒時發(fā)現，在6～12 min內，污染率與浸泡時間成反比；當浸泡時間延長時，盡管污染率降低了，隨著浸泡時間的繼續(xù)延長，存活率下降[16]。出現這種現象的原因可能是因為外植體所帶細菌在短時間內不易被徹底消殺，而消毒時間過長又容易損傷外植體組織細胞。采用30 min流水沖洗 + 30 s 75%乙醇 + 8 min 0.2% HgCl2分段清洗的方式對金花茶成年葉片進行消毒，愈傷誘導率可達98.33%[18]。楊舒婷等[24]研究發(fā)現，崇左金花茶種子較好的滅菌方法為洗潔精清洗表面 + 40 min流水沖洗 + 40s 75%乙醇 + 20～30 min 0.1% HgCl2 + 20 min 0.2% HgCl2；幼嫩葉片較好的滅菌方法為用洗潔精清洗表面 + 30 min流水沖洗 + 40 s 75%乙醇 + 5 min 0.1% HgCl2" + 5 min 0.1% HgCl2；莖段的滅菌方法是洗潔精清洗表面 + 30 min流水沖洗 + 25s 75%乙醇 + 10 min 0.1% HgCl2 + 5 min 0.2% HgCl2。試驗結果表明，不同外植體較適合的滅菌方式不一致，可能是由于外植體結構的不同導致，種子具有種皮，不易攜帶病菌，葉子長期暴露在野外條件下，攜帶病菌的幾率大大增加。綜上所述，采用單一消毒劑不利于金花茶外植體滅菌，采用不同消毒劑分段消毒能夠有效進行金花茶外植體滅菌。

2.2 培養(yǎng)基和生長調節(jié)劑

2.2.1 基本培養(yǎng)基的篩選

組織培養(yǎng)技術的關鍵因素之一是篩選合適的基本培養(yǎng)基?；九囵B(yǎng)基中含有植物細胞生長所需的各種元素，不僅為外植體提供營養(yǎng)，對外植體的分化狀態(tài)有直接影響，還能有效遏制褐化現象的發(fā)生，因此，基本培養(yǎng)基對于愈傷組織誘導率、增殖系數和生根率的影響極其重要[25]。

本文對金花茶組織培養(yǎng)過程中不同誘導途徑的最優(yōu)培養(yǎng)基和生長調節(jié)劑方案進行了歸納，結果如表2所示。愈傷組織是金花茶組織培養(yǎng)中最常見的誘導分化途徑，體胚和不定芽誘導較為少見，可能是因為金花茶的不定芽較難分化和體胚誘導分化不易獲得胚性愈傷組織；相同外植體，不同誘導分化途徑所需的最優(yōu)培養(yǎng)基方案不同；相同誘導途徑下，外植體不同，最優(yōu)基本培養(yǎng)基方案也不同。采用正交試驗探究3種培養(yǎng)基、3種生長調節(jié)劑在防城港金花茶芽增殖過程中的作用，結果表明基本培養(yǎng)基在芽增殖過程中起主導作用，并且在相同生長調節(jié)劑水平下，相比于Miller和DCR培養(yǎng)基，MS的增殖系數最高，平均增殖系數7.7[26]。采用傳統的白糖瓊脂培養(yǎng)基對‘黃樽’薄葉金花茶進行組培生根和苗木移栽，在生長早期采用無糖培養(yǎng)，后期補充白糖能顯著提高生根率和移栽成活率[27]。陶志華等[9]采用WPM和MS兩種培養(yǎng)基誘導崇左金花茶和金花茶胚芽的生長，結果表明這兩種培養(yǎng)基均能誘導胚芽繼續(xù)生長，WPM的誘導率（87.78%～88.89%）高于MS的誘導率（68.89%～71.11%），WPM更適合誘導崇左金花茶和金花茶胚芽的生長。綜合以上分析，金花茶組織快繁的理想培養(yǎng)基是MS和WPM。

2.2.2 生長調節(jié)劑

植物組織培養(yǎng)常用的生長調節(jié)劑包括芐氨基腺嘌呤（BA）、6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）、激動素（KT）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）和吲哚丁酸（IBA）等，這些生長調節(jié)劑對植物分化的作用不盡相同[33]。為滿足培養(yǎng)目的，通常需要在基本培養(yǎng)基中添加不同種類的生長調節(jié)劑。

多數研究者認為，在金花茶的體胚發(fā)生過程中，添加適量的細胞分裂素有利于體胚的形成和發(fā)育，被廣泛應用于誘導體胚發(fā)生最常用的生長激素是2，4-D和BA，一般認為2，4-D不利于金花茶體胚發(fā)生[15]。然而林莉等[28]發(fā)現，低濃度的2，4-D有助于球胚的成熟和子葉胚的增殖，同時BA對體胚的增殖也是有利的。金花茶試管苗添加NAA和IBA處理后均能生根，且生根率較高，IBA整體效果優(yōu)于NAA；2種激素的最高生根成活率濃度都是200 mg·L-1，而不是400 mg·L-1[34]。采用不同濃度的NAA、IAA、IBA分別和相同濃度的6-BA進行組合，愈傷誘導率：IAAgt;IBAgt;NAA[9]。將1 mg·L-1 BA和不同濃度的NAA和2，4-D進行組合后發(fā)現，0.1 mg·L-1 NAA + 0.2 mg·L-1或0.5 mg·L-1 2，4-D是最優(yōu)激素配方，NAA對誘導率的影響最大（見表2）[32]。當基本培養(yǎng)基相同時，添加NAA有助于促進芽高生長，添加6-BA有利于芽的分化和增殖，并且6-BA的濃度越高，平均增殖系數越高[26]。采用正交實驗探究不同濃度的IBA、IAA、NAA組合對金花茶組培芽生根率影響，結果表明，IAA在培芽生根過程中起主導作用，IBA起輔助作用[35]。三種生長調節(jié)劑濃度的平均增殖系數的極差值為Ｒ6-BAgt;ＲNAAgt;ＲIBA，NAA、IBA的平均增殖系數極差值僅有0.90和0.30，影響不顯著，6-BA的平均增殖系數極差值為2.66，影響達極顯著水平[22]。

2.3 培養(yǎng)條件

外植體的器官分化和生長會受到組培過程中的光照強度、光照時長、光質、溫濕度、培養(yǎng)基PH值、培養(yǎng)基中無機鹽成分和礦質元素等影響[33]。

在接種初期選擇光照強度800～2000 lx培養(yǎng)7～10 d后，選擇光照強度4000～6000 lx繼續(xù)培養(yǎng)，有利于金花茶的芽殖培養(yǎng)；6500～8000 lx強光會灼傷芽從而影響生根，但是如果光照強度過低，則降低了金花茶葉片的光合作用速率，降低有機養(yǎng)分的合成從而引起營養(yǎng)缺乏，使芽的生長能力大大減弱[26]。金花茶的生根率在不同光照條件下有明顯差異：當光照強度為800～6000 lx時，生根率隨著光照強度的增高而增高；在6000 lx時達到最大值96.30%；當超過6000 lx時，組培芽出現不同程度的灼傷現象，生根率下降到63.00%[35]。當溫度在21～25℃時，金花茶組培芽的增殖系數最高達12.3；當溫度達到26～30℃時，出現葉片發(fā)黃，最后落光致死的情況[31]。以富含礦質元素的珍珠巖或沙子為基質，反而抑制了種子的萌發(fā)[32]。MS培養(yǎng)基的不定芽增殖率最高，MS培養(yǎng)基所含的氮鉀元素比Miller和DCR都高，因此推測高濃度的氮鉀元素更有利于不定芽誘導[26]。劉芳等[35]認為高N培養(yǎng)基可以促進金花茶不定芽誘導，但是對于根系發(fā)育有一定的抑制作用。

2.4 生根培養(yǎng)與移栽

不定根誘導與組培苗移栽是金花茶組織培養(yǎng)的關鍵過程，生根率和移栽成活率是評價金花茶組培產業(yè)化的重要指標。

試管內生根和試管外生根是目前金花茶組織培養(yǎng)生產無根苗常用的2種生根方式[28]。黃曉娜等[34]采用微枝試管外生根技術探究金花茶的生根率和存活率，發(fā)現其生根成活率遠低于生根率。也有研究者通過添加生長調節(jié)劑促進組培苗不定根的產生，但是操作較為復雜，不易推廣[29]。吳麗君等[27]發(fā)現培養(yǎng)基質與附加物的不同組合對生根早期的生根率影響達到極顯著水平，生根率范圍是41.1%～84.4%，在生根后期，不同處理對生根率的影響不顯著。

目前已經開展了很多金花茶的組培快繁研究[18-20， 24]，但很少涉及移栽的具體方面。影響移栽成活率的因素有很多，如覆膜、煉苗時間、移栽基質和時間、生長環(huán)境的溫濕度和光照強度等。金花茶移栽基質以V泥炭土∶V黃泥∶V河沙＝2∶1∶1為混合基質的煉苗效果較好，移栽成活率可達91%[29]。吳麗君等[22，27]通過實驗發(fā)現：相較于純黃心土，由黃心土、珍珠巖、椰糠和蛭石混合成的基質更利于金花茶芽苗的移栽，這可能因為混合基質的保水透氣性比純黃心土更好；在生根培養(yǎng)后期，添加15 g·L-1白糖 + 15.0 mg·L-1 K2HPO4后移栽成活率達93.3%，這有效提高了‘黃樽’薄葉金花茶的移栽成活率。

3 存在問題及對策

3.1 污染及消毒對策

污染問題是大部分植物組織培養(yǎng)過程中面臨的最常見問題，也是首要待解決問題，金花茶組織培養(yǎng)也面臨相同的難題。外植體自身攜帶較多病菌，消毒不徹底，滅菌室和超凈臺處的無菌操作不規(guī)范，器皿滅菌不徹底等因素都會造成污染。因此，做好滅菌工作能有效防止污染，主要的滅菌措施有以下三點。（1）在考慮外植體部位的選擇時，應該優(yōu)先選擇自帶病菌少的部位，可以極大程度減少污染。如種子或種胚等由于有種皮的保護，不易被污染且具有很高分化潛能的分生組織細胞，是良好的外植體材料；如果選用葉片，盡量選擇嫩葉，因為相較于老葉，嫩葉葉片薄，更容易消毒，而且受周圍環(huán)境污染程度小，不易攜帶病菌；如果選用莖尖、嫩葉等作為外植體，優(yōu)先考慮室內栽培的植株，野外取材時，可以先對母本進行噴施殺菌。（2）根據材料的不同選擇最合適的消毒劑和消毒方法，優(yōu)化后的消毒方法能夠有效抑制污染和死亡個數，提高愈傷組織的誘導率，有效遏制褐化現象的發(fā)生。（3）進行無菌操作時要嚴格按照操作規(guī)范進行。

3.2 增殖系數低及解決對策

繼代增殖的高低會對組培快繁的收益產生直接影響。增殖系數低是植物組織培養(yǎng)的又一瓶頸問題。同其他山茶屬植物一樣，金花茶的愈傷組織誘導較容易，但是想要獲得較高的繼代增殖系數依舊困難。提升增殖系數的措施有：（1）繼續(xù)擴大試驗內容，增加外植體、基本培養(yǎng)基和生長調節(jié)劑方面的試驗，盡快建立穩(wěn)定高效的增殖體系；（2）可以借鑒山茶屬植物的研究經驗和模式，如油茶，茶樹、紅山茶等[36]植物在組培快繁方面的研究開展得更為廣泛；（3）加強對金花茶組織培養(yǎng)過程中生理變化的研究，尤其是生長激素與次生代謝物之間的內在聯系，以便在后續(xù)的試驗中選擇更適合的生長激素類型和配比。

3.3 褐化現象及解決對策

褐化問題源于外植體多酚氧化酶活性發(fā)生變化，容易釋放并積累褐色物質[25]。外植體褐化現象在不同植物組培過程中都會發(fā)生，人們一直在努力抑制褐變發(fā)生[37]。褐化現象不但影響組織培養(yǎng)的效果，甚至會造成外植體死亡而導致試驗失敗。褐化現象在初代培養(yǎng)中較為常見，并且褐變程度會隨著不同植物、不同取材部位、消毒時間長短、培養(yǎng)基中的糖成分和濃度不當以及激素過度使用等因素而改變?？朔鸹ú杞M培褐化的措施主要有：（1）選取分化潛能高的外植體，初期暗培養(yǎng)，避免酚類物質轉化成醌類物質，最后進行多次轉接，降低褐化的可能；（2）外植體消毒后盡快接種，避免切口與空氣接觸時間過長被氧化；（3）探索更佳的外植體預處理方法，比如適當低溫、浸泡抗氧化劑（抗壞血酸和檸檬酸等）溶液來減少酚類毒害，降低褐化可能，提高材料利用率；（4）優(yōu)化培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件，可以適當添加吸附劑，如活性炭和聚乙烯基聚吡咯烷酮（PVPP），可以結合酚類化合物，使其毒性降低[38]；（5）添加氨基酸，如甘氨酸、天冬酰胺、l-谷氨酰胺和l-脯氨酸到愈傷組織培養(yǎng)基中作為還原性氮的來源，這些氨基酸易于被植物細胞代謝，并刺激細胞更快地生長和發(fā)育[25]。

4 結語

金花茶種類豐富，有很高的觀賞價值和藥食用價值，具有廣泛的市場前景，因此加快金花茶組織培養(yǎng)技術的研究，是市場發(fā)展的必然需求。金花茶組培繁育過程較為復雜，盡管已經開展了許多組織培養(yǎng)的研究，但是仍面臨許多棘手的問題：外植體的選擇和滅菌，培養(yǎng)基的篩選和條件控制，繼代培養(yǎng)增殖率低，組培苗移栽成活低等是當前急需解決的問題，控制污染是組培快繁需要解決的首要問題。金花茶組培快繁體系的建立與完善，對于金花茶優(yōu)良品種的保存和加快其商業(yè)化發(fā)展具有重要意義。

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責任編輯：黃倩盈