基于指紋圖譜和網絡藥理學的干姜質量標志物預測分析

摘要：基于指紋圖譜和網絡藥理學方法，分析預測干姜中潛在的質量標志物，為干姜的質量控制與評價提供參考。采用超高效液相色譜法建立干姜指紋圖譜，確認共有峰并進行指認，通過網絡藥理學方法構建活性成分-靶點-通路網絡圖預測干姜質量標志物，再利用分子對接方法驗證干姜質量標志物的生物活性。建立了10批干姜指紋圖譜，確定共有峰17個，并指認其5個共有成分，分別為6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚及8-姜烯酚；通過網絡藥理學對關鍵成分靶點的分析結果表明，此5種成分可作用于35個核心靶點，20條關鍵通路發揮抗癌、抗炎、抗氧化作用；分子對接結果表明，此5種成分與核心靶點結合能力均較強，具有較好的生物活性，初步預測6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚和8-姜烯酚可作為干姜的質量標志物。通過指紋圖譜結合網絡藥理學分析預測干姜的質量標志物，為干姜的質量控制和藥效作用機制研究提供了參考。

關鍵詞：干姜；質量標志物；指紋圖譜；網絡藥理學；分子對接

中圖分類號：R284.1 文獻標志碼：A 文章編號：1002-4026（2023）04-0035-07

開放科學（資源服務）標志碼（OSID）：

Forecast analysis of the quality markers of Zingiberis Rhizoma based on fingerprints and network pharmacology

FU Mengya^1，2，AO Huihao^1，2，BU Chao^1，2，PENG Tangyi¹，WU Deling²，HAN Yanquan^1*，HONG Yan^2*

（1. Grade Three-Level Laboratory of Traditional Chinese Medicine Preparation/Anhui Engineering Technology Research Center of Modernized Pharmaceutics， The First Affiliated Hospital of Anhui University of Traditional Chinese Medicine， Hefei 230031， China；2. Anhui Key Laboratory of Compound Chinese Medicine of Anhui Province，Anhui University of Traditional Chinese Medicine， Hefei 230012， China）

Abstract∶To analyze and predict the potential quality markers （Q-Marker） in Zingiberis Rhizoma based on fingerprints and network pharmacological methods. The fingerprints of 10 batches of Zingiberis Rhizoma slices were established by ultra performance liquid chromatography and the common peaks were identified; then the network diagram of active ingredient target pathway was constructed by network pharmacological method to predict the quality markers of Zingiberis Rhizoma; and the bioactivity of Q-Marker was verified by molecular docking method. Fingerprints of 10 batches of dried ginger were established， and 17 peaks were identified. Five chromatographic peaks were identified by the reference substances of Zingiberis Rhizoma， which were 6-gingerol， 8-gingerol， 10-gingerol， 6-shogaol， and 8-shogaol. The results of network pharmacology showed that these 5 components can act on 35 core targets， and 20 key pathways which play an anti-cancer， anti-inflammatory， and antioxidant role. Molecular docking showed that these 5 components had strong binding capacity with core targets and had good biological activity. It was preliminarily predicted that these five substances could be used as quality markers of dried ginger. Predicting the quality markers of Zingiberis Rhizoma by fingerprint and network pharmacology analysis will provide a reference for the quality control of Zingiberis Rhizoma and for further study on its pharmacodynamic mechanism.

Key words∶Zingiberis Rhizoma; quality markers; fingerprint; network pharmacology; molecular docking

干姜為姜科植物姜Zingiber officinale Rosc.的干燥根莖，歸心、胃、肺、脾經，主要有溫中散寒、回陽通脈、溫肺化飲等功效。化學成分主要包括姜辣素類、揮發油類和二苯基庚烷類等化合物，具有抗氧化、保護肝臟、抗炎和保護脾胃等藥理作用，臨床多用于消炎、鎮痛和止嘔等癥^［1］。

劉昌孝院士^［2］首次提出中藥質量標志物（quality marker，Q-Marker）的概念，其主要內容是以特有性、可測性、溯源與傳遞性、有效性為原則，以中藥安全性和有效性的標志性物質進行質量控制研究^［3］，現已應用于黃芩、白術^［4-5］等中藥質量研究中，為中藥質量控制研究提供了新思路。本研究采用超高效液相色譜法（ultra performance liquid chromatography，UPLC）建立干姜化學成分的指紋圖譜，對5個姜辣素成分進行指認，進一步運用網絡藥理學進行有效性分析，發現潛在的Q-Marker，并利用分子對接進行生物活性驗證，為建立干姜質量控制及作用機制研究奠定了基礎。

1 材料

1.1 儀器

Waters Acquity H-Class型超高效液相色譜儀（美國Waters公司），KQ-300DE超聲儀（江蘇昆山超聲儀器有限公司），DZF-6050真空干燥箱（上海博訊醫療設備廠），HFB-200高速中藥粉碎機（吉首市中州中藥機械廠），炒藥設備（自制）。

1.2 試藥

6-姜酚（純度≥98.0%，23513-146）、8-姜酚（純度≥98.0%，23513-088）、10-姜酚（純度≥98.0%，23513-157）、6-姜烯酚（純度≥98.0%，12121803）和8-姜烯酚（純度≥98.0%，191204-031）對照品（成都德思特生物技術有限公司），0.22 μm微孔濾膜（上海陸納生物科技有限公司），色譜級乙腈（美國TEDIA公司）；蒸餾水（北京屈臣氏蒸餾水有限公司）；乙醇、磷酸等試劑為分析純。

1.3 藥材

10批干姜飲片產地分別為四川、遼寧、浙江、云南、浙江、黑龍江和安徽等地，經安徽中醫藥大學第一附屬醫院韓燕全主任中藥師鑒定為姜科植物姜 Zingiber officinale Rosc.的干燥根莖。

2 方法與結果

2.1 UPLC指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜條件

Waters Acquity UPLC BEH C₁₈色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；乙腈（A）-水溶液（B）作為流動相，梯度洗脫（0～3 min，97%～80% B；3～4 min，80%～65% B；4～5 min，65%～60% B；5～6 min，60%～54% B；6～7 min，54%～45% B；7～14 min，45%～45% B；14～18 min，45%～10% B；18～23 min，10%～10% B；23～26 min，10%～0 B；26～28 min，0～97% B；28～30 min，97%～97% B）；檢測波長為280 nm；流速為0.25 mL/min；進樣量為2 μL，柱溫：30 ℃。

2.1.2 供試品溶液的制備

精密稱取10批不同產地干姜粉末0.25 g，分別標記放置于10 mL容量瓶中，滴入甲醇至容量瓶刻度，利用超聲（功率150 W，40 kHz）促使混合均勻，靜置放冷，再次加入甲醇補足，搖勻，0.22 μm濾膜過濾，待用。

2.1.3 對照品溶液的制備

精密稱定6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚和8-姜烯酚對照品，加甲醇定容，得質量濃度為6-姜酚0.039 30 mg/mL、8-姜酚0.017 60 mg/mL、10-姜酚0.013 95 mg/mL、6-姜烯酚0.005 44 mg/mL、8-姜烯酚0.003 20 mg/mL的混合對照品溶液。

2.1.4 方法學考察

（1）精密度實驗

將2.1.2項下制備的干姜供試品溶液，重復進樣6次，利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004版A）軟件進行評價，結果表明連續6次供試品進樣，其相似度均高于0.99，表示此方法精密度較好。

（2）重復性實驗

同2.1.2項下方法取干姜供試品溶液，分別制備6份待用，依照2.1.1項色譜條件依次進樣6次，利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004版A）軟件評價，結果顯示相似度均高于0.98，說明干姜樣品重復性良好。

（3）穩定性實驗

將2.1.2項下制備的干姜供試品溶液，依次于0、4、8、12、24 h進樣分析，分別檢測、記錄并保存色譜圖，以中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004版A）評價，相似度結果均高于0.98，表明樣品的穩定性良好。

（4）指紋圖譜的建立及相似度評價

取10批干姜，依照2.1.2項下方法準備供試品溶液，按2.1.1項色譜條件方法進行測定，結果依次導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004版A）進行處理，通過比較10批干姜飲片UPLC色譜圖檢測結果，確定17個共有峰，指紋圖譜結果見圖1。以UPLC圖譜共有模式為對照，對10批樣品進行相似度評價，10批次干姜與對照指紋圖譜相似度均大于0.98，結果見表1。

（5）共有峰指認及相對保留時間和相對峰面積

取干姜供試品溶液，按2.1.1項下條件依次進樣，將指紋圖譜導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004版A），進行色譜峰保留時間以及色譜行為的比較，確認17個共有峰，采用對照品對比方式指認了其中5個色譜峰，分別為6號色譜峰（6-姜酚）、7號色譜峰（8-姜酚）、8號色譜峰（6-姜烯酚）、11號色譜峰（10-姜酚）、12號色譜峰（8-姜烯酚），結果見圖2。結果表明各相對保留時間相對標準偏差小于1.5，符合指紋圖譜規定。

2.2 干姜網絡藥理學Q-Marker預測分析

2.2.1 活性成分確定

通過2.1.1項下方法對干姜進行定性鑒別，選擇6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚及8-姜烯酚5個特征成分作為候選化合物。利用PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索化合物，并下載其2D結構式用于靶點預測。

2.2.2 數據庫與軟件

中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php），PubChem數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），SwissTargetPrediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/ ），Uniprot數據庫（https：//www.uniprot.org/），STRING數據庫（https：//cn.string-db.org/），DAVID數據庫（https：//david.ncifcrf. gov/ tools.jsp），Cytoscape 3.9.1軟件。

2.2.3 中藥靶點預測

由TCMSP數據庫、PubChem數據庫、SwissTargetPrediction數據庫查找5個成分作用靶點，且使用TCMSP藥理學數據庫時以藥物口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18作為臨床篩選藥物標準^［6］；通過Uniprot數據庫（https：//www.uniprot.org/）將預測出靶點名轉換為基因名，將各數據庫篩選靶點合并刪除重復值，結果顯示得到相關成分靶點261種。

2.2.4 蛋白質與蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡分析

將261種相關成分靶點上傳至STRING數據庫，“Homo spanies”作為物種篩選條件，置信度蛋白交互參數評分值gt;0.9，保存為tsv格式文件；將得到的tsv文件導入Cytoscape 3.9.1軟件進行拓撲特征分析，見OSID科學數據與內容附圖1。將連接度（degree）大于2倍中位數值作為篩選條件，結果顯示共得到35個核心靶點，排名前10靶點基因分別為SRC、STAT3、PIK3CA、HSP90AA1、TP53、PTK2、MAPK3、JAK2、LYN、PLCG1，可能是干姜關鍵靶點。

2.2.5 核心靶點GO功能富集與KEGG信號通路分析

（1）基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析：將35個核心靶點通過使用DAVID數據庫進行分析，篩選條件設置為Plt;0.05、R_FDRlt;0.05，統計顯示共獲得174個條目。123個生物過程（biological process，BP）主要富集在信號傳導、肽基酪氨酸磷酸化、凋亡過程的負調控、蛋白質磷酸化等；20個細胞組成（cellular component，CC）富集于細胞質、細胞核、核質等區域；31個分子功能（molecular function，MF）主要富集在蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、蛋白激酶活性、蛋白質結合等，見OSID科學數據與內容附圖2。

（2）京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析：將35個核心靶點導入DAVID數據庫進行分析。結果顯示共得到137條信號通路，通路主要包含癌癥通路、前列腺癌、ErbB信號通路、PI3K-Akt信號通路等，其中前20條通路見OSID科學數據與內容附圖3。

2.2.6 成分-靶點-通路分析

將上述得到的5個活性成分、35個關鍵靶點、20條通路導入Cytoscape 3.9.1軟件進行分析，見OSID科學數據與內容附圖4。以成分、靶點和信號通路的degree為參考，結果顯示6-姜酚（degree值=14）相較于其他4個化合物有較高degree，表明6-姜酚可能是干姜的重要活性成分，PIK3CA、MAPK3、AKT3、SRC和HSP90AA1可能是干姜活性成分作用于腫瘤、神經活性配體等信號通路潛在的關鍵作用靶點。

2.3 分子對接分析

以6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚及8-姜烯酚為配體，核心靶點蛋白SRC、HSP90AA1和PIK3CA為受體，將獲得5個關鍵成分分別與核心靶點蛋白SRC、HSP90AA1和PIK3CA進行分子對接，見表2。成分與靶點結合力較好是以對接結合能小于－20.9 kJ/mol為依據^［7］。結果表明，HSP90AA1與6-姜酚的1個氨基酸殘基（GLN-23）相互作用（圖3（a）） 、與8-姜酚的4個氨基酸殘基（ASN-51、PHE-138、GLY-135、50Q-1225）有相互作用（圖3（b））；PIK3CA與10-姜酚的2個氨基酸殘基（TYR-63、TYR-26）相互作用（圖3（c））。

3 討論與結論

中藥成分復雜，具有多成分、多靶點的特點，因此要從多方面研究其作用機制^［8］。利用現代分析測試技術的指紋圖譜，可以較好體現中藥有效成分的復雜性與相關性；網絡藥理學通過對成分靶點進行分析并篩選其關鍵靶點及通路，能夠為更有針對性的中藥研究提供依據；Q-Marker的提出，明確了質量標準和控制方法，可以解決在中藥有效性基礎上中藥質量評估問題^［9-11］。

本研究通過對干姜化學成分進行表征，利用超高效液相色譜法建立干姜飲片指紋圖譜，選擇干姜主要成分6-姜酚作為參照峰。對10批干姜飲片進行相似度分析結果顯示，共檢出17個共有峰，并對其中5個色譜峰（6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚和8-姜烯酚）進行指認，且10批干姜飲片指紋圖譜相似度均大于0.98（中位數），表明不同批次干姜飲片化學成分具有一致性，可作為干姜飲片質量控制鑒別依據。

利用網絡藥理學方法對指認出的5個干姜成分進行有效成分篩選與靶點預測，通過Cytoscape 3.9.1軟件對PPI網絡中靶點進行拓撲特征分析，以degree值為參考，發現靶點非受體型酪氨酸激酶SRC（degree值=98）、磷脂酰肌醇4，5-二磷酸3-激酶催化亞單位δ異構體PIK3CA（degree值=72）、熱休克蛋白90α-HSP90AA1（degree值=68）、腫瘤蛋白p53-TP53（degree值=22）、磷酸化蛋白激酶3-AKT3（degree值=68）的連接度較高，可能是干姜發揮藥效作用的關鍵靶點。通過成分-靶點-通路網絡圖分析顯示除腫瘤信號通路（degree值=24）的連接度較大，PI3K-Akt信號通路（degree值=20）可能是干姜發揮作用的關鍵信號通路。

現代藥理研究表明干姜具有抗腫瘤、抗炎、保護胃黏膜和抗潰瘍等作用，SRC、PIK3CA、HSP90AA1、TP53和MAPK3等關鍵靶點在腫瘤發生中起著重要作用^［12］，經研究發現SRC在腫瘤細胞的增值、遷移和血管生成等多種信號傳導途徑中發揮重要作用^［13］；PIK3CA是EGFR信號通路下游的一個重要癌基因，對細胞增殖、轉移和凋亡等影響具有重要作用^［14-15］；HSP90AA1是調節細胞凋亡關鍵因子^［16］；TP53基因作為重要腫瘤抑制因子具有DNA損傷后阻止或消除細胞的能力及對異常癌基因阻止增殖的作用^［17］；MAPK3基因具有調節細胞多種功能，既可以抑制腫瘤也能促進腫瘤發展的作用^［18］。SRC、PIK3CA和HSP90AA1等關鍵靶點作用于PI3K-Akt信號通路、癌癥通路等關鍵信號通路發揮治療作用。6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚通過PI3K-Akt信號通路以達到抗肝癌的特點^［19］，抑制細胞增殖、促進細胞凋亡和抑制遷移等為主要表現；8-姜酚通過激活PI3K/AKT和mTOR信號通路，減少自噬小體形成，以抑制過度自噬，最終抑制心肌細胞凋亡^［20］；PI3K-Akt信號通路和EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥通路被認為是姜治療結腸癌的重要途徑^［21］；6-姜烯酚可致使SW480細胞增殖周期阻斷在G2/M期，并呈濃度依賴性地促進SW480凋亡，進而抑制細胞增殖，而且增強APC表達^［22］；馮悅等^［23］研究發現8-姜烯酚可以通過ROS-Vegf信號通路發揮抑制血管生成的作用。表明干姜Q-Marker的選取符合其藥理藥效特點。利用分子對接技術研究受體與配體之間的結合模式，將SRC、HSP90AA1和PIK3CA3個關鍵靶點與6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚及8-姜烯酚5個有效活性成分進行對接，結果顯示結合能均小于-20.9 kJ/mol，表明干姜核心活性成分與關鍵靶點結合較穩定，潛在Q-Marker有較好的生物活性，5種成分適合作為干姜Q-Marker成分。

綜上所述，本研究結合指紋圖譜和網絡藥理學方法，從化學可測性方面對干姜主要成分進行分析，通過篩選得出靶點、通路與干姜抗腫瘤、抗炎等藥理作用相契合，初步預測6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚和8-姜烯酚為干姜潛在的Q-Marker。進一步完善干姜質量控制體系，提高質量控制水平，可以為后期進一步研究干姜藥效及作用機制提供參考依據。

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