不同免疫增效劑對免疫豬瘟E2蛋白亞單位疫苗小鼠抗體的影響

摘要：為了研究不同免疫增效劑對免疫豬瘟病毒E2蛋白亞單位疫苗小鼠產生特異性抗體與鼠IFN-γ水平的影響。本研究將昆明白小鼠隨機分為6組： CpG-A組、CpG-B組、復合增效劑組[單磷酰脂質 A（MPL）：胞壁酰二肽（MDP）：β-葡聚糖=1：1：1]、納米顆粒組、豬瘟E2疫苗組，非免疫對照組（Control組）。實驗共使用6種免疫增效劑：CpG-A、CpG-B、單磷酰脂質 A（MPL）、胞壁酰二肽（MDP）、β-葡聚糖、納米顆粒與豬瘟E2 蛋白（40 μg/mL）混合制備疫苗，小鼠經皮下注射疫苗定期眼眥采血，分別使用豬瘟E2抗體檢測試劑盒與鼠IFN-γ檢測試劑盒測定豬瘟病毒E2蛋白特異性抗體和鼠IFN-γ水平。免疫后小鼠檢測結果顯示，首免后 35天 CpG-B組、復合增效劑組小鼠血清樣品豬瘟E2抗體均高于豬瘟E2組，CpG-B組與豬瘟E2組比較抗體水平差異顯著（F=0.048，p＜0.05），復合增效劑組與豬瘟E2組比較抗體水平差異極顯著（F=0.008，p＜0.01）；CpG-A、納米顆粒組與豬瘟E2組比較，抗體水平差異不顯著（FCpG-A=0.56、F納米顆粒=0.35，p＜0.05），CpG-B組與復合增效劑組效果對于豬瘟E2疫苗特異性抗體促進作用顯著。綜合以上研究結果首次表明，添加復合增效劑制成的疫苗進行單次免疫后，均能有效提高免疫后小鼠的豬瘟E2蛋白特異性抗體的水平；CpG-B與復合增效劑均能有效提高小鼠血清中豬瘟病毒中和抗體的水平；CpG-B能促進免疫后7～14 d小鼠IFN-γ的上調。本研究為昆蟲細胞-桿狀病毒系統表達的重組蛋白制備亞單位疫苗的免疫增效劑開發和研究奠定實驗基礎。

關鍵詞：免疫增效劑；中和抗體；豬瘟E2蛋白；鼠IFN-γ

豬瘟是由豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）引起的豬的一種急性、熱性、高度接觸性烈性傳染病，具有極高的致死率，給許多國家養豬業造成重大經濟損失。根據 “中華人民共和國農業農村部公告—第573號”內容，豬瘟為二類動物疫病，屬于WOAH必須上報的動物疫病。疫苗免疫是我國預防豬瘟病毒的主要手段，我國普遍利用自行研制的豬瘟兔化弱毒疫苗（C株）進行強制免疫來預防豬瘟病毒的流行。目前中國豬瘟仍然沒有被完全控制住，我國豬瘟的流行方式已經從頻繁發生的大流行轉變為許多地區周期性零星流行，多局限于“CSFV不穩定地區”的散發性流行[1]。對病豬場及附近尚未發病的豬，立即進行緊急接種豬瘟疫苗，病死豬的尸體應進行合理化的處理。這些都以期有效降低豬瘟的發生幾率，提高養殖戶的經濟效益[2]。近年來研發出的豬瘟病毒E2蛋白重組桿狀病毒滅活疫苗，免疫后具有特異性抗體水平高，免疫持續期長，無副反應，可鑒別診斷等特點，是一種新型豬瘟疫苗。該疫苗所選取的E2基因保留了信號肽序列，制苗使用在上清中正確表達的重組E2蛋白，表達量顯著提高，具有大規模推廣應用的潛力[3]。為提高豬瘟E2蛋白亞單位疫苗誘導機體的免疫反應，并減輕豬場對豬瘟疫苗的免疫壓力，本試驗開展免疫增效劑的研究，以期為豬瘟E2蛋白亞單位疫苗研究提供依據。

免疫增效劑是指單獨使用或者與抗原聯用均能提高機體免疫力的藥物。近年來研究表明，多種免疫增效劑均能夠提高免疫功能，并協同增強機體的抗體水平。CpG ODN（cytosine-phosphate-guanine oligodeoxynucleotide），未甲基化寡聚脫氧核苷酸，是指含有 CpG 基序的核苷酸序列。A型CpG ODN 能夠活化NK細胞，B型CpG ODN能刺激B細胞的增殖和活化，可上調表達 MHC II 分子、B 細胞表面分子、六種主要免疫球蛋白等多種基因，并促進多種細胞因子的分泌[4]。β-葡聚糖是機體免疫系統的一個溫和應激原，其通過腸道中樹突狀細胞和巨噬細胞的激活來刺激免疫系統。β-葡聚糖是一種微生物衍生的直鏈或支鏈的3-1，3-葡萄糖多糖，可與C型凝集素dectin-1和補體受體3（CR3）結合，促進分泌細胞因子和B細胞、T細胞的激活，增強體液和細胞免疫反應 [5]。單磷酰脂質A是革蘭氏陰性菌細胞外膜的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）主要成分之一。單磷酰脂質 A（monophosphoryl lipid A，MPL）作為LPS的重要組成部分在免疫信號傳導中參與了與這些生物大分子的結合和引發受體蛋白構象的變化，進一步將信號傳遞到細胞內產生免疫應答[6]。單磷酸脂質 A 具有比傳統鋁鹽佐劑更強的免疫活性、有效性和安全性，其作為佐劑已在多個上市疫苗中的應用[7]。胞壁酰二肽類免疫增效劑是指包括胞壁酰二肽（Muramyl dipeptide，MDP）在內的一類具有免疫調節活性的 MDP 衍生物和類似物。MDP 是分枝桿菌細胞壁骨架中的主要免疫活性單元，可通過口服、皮下、靜脈等多種途徑進入體內，在機體內發揮強烈的生物學效應，能夠增強機體的免疫應答能力，提高疫苗、菌苗、病毒亞單位及寄生蟲苗的保護力[8]。MDP在LPS誘導下可以顯著增加IL-1的產生，MDP對B淋巴細胞顯著增強的作用，MDP可以促進淋巴細胞的轉化，優先作用于B淋巴細胞，產生明顯的抗體介導免疫反應[9]。納米佐劑是指一類特殊的免疫佐劑，其獨特性在于是由納米材料所構成的。它不但能夠保護抗原免受降解，還可以作為抗原的靶向遞呈載體，同時其本身也具有刺激免疫的能力[10]。目前應用廣泛的納米材料多為聚合物，進入機體可以被生物降解為無毒性的小顆粒，安全性高，同時能夠激發免疫系統產生適當的免疫應答而不損害機體，生物相容性良好。

1 "材料與方法

1.1 "主要實驗材料

MPL、MDP和 β-葡聚糖均購自 Invivogen 公司；納米顆粒購自默克公司；CpG-A，CpG-B購自武漢艾美捷科技有限公司；豬瘟病毒抗體ELISA檢測試劑盒購自美國愛德士公司；SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒購自索萊寶生物科技有限公司；鼠IFN-γ ELISA檢測試劑盒購自美國Invitrogen公司；兔抗豬 IgG-HRP購自Sigma；豬瘟陽性血清購自中國獸醫藥品監察所菌毒種保存保藏中心。昆明白小鼠購自烏魯木齊市疾病預防控制中心。ISA 660VG 佐劑購自法國賽彼科公司。

1.2 "疫苗制備

將經鑒定后的豬瘟E2蛋白重組桿狀病毒按 MOI=2 接種于High Five懸浮細胞，27 ℃ 恒溫振蕩培養，培養 96 h 后收獲上清，經 30 ku 超濾濃縮-鎳親和柱層析分離純化。純化后的豬瘟E2蛋白進行 SDS-PAGE 分析，同時采用灰度分析測定蛋白濃度。豬瘟陽性血清（1：500）為一抗，兔抗豬 IgG-HRP（1：5000）為二抗，經 western blot 鑒定豬瘟病毒E2 蛋白的表達。豬瘟E2蛋白（終濃度 40 μg/mL）分別與 CpG-A（終濃度 20 μg/mL）、CpG-B（終濃度10 μg/mL）、復合增效劑組為MPL、MDP和 β-葡聚糖依照1：1：1比例混合制成（終濃度為20 μg/mL）、納米顆粒組（終濃度2 μg/mL）、混勻制備含不同免疫增效劑的豬瘟E2蛋白抗原混合液，按照 1：1（g/g）比例將 ISA 563VG 佐劑分別添加至上述豬瘟E2蛋白抗原混合液中，乳化制備4種疫苗，同時制備不含免疫調節劑的ISA 563VG 佐劑豬瘟病毒E2蛋白重組桿狀病毒疫苗。

1.3 "小鼠免疫及樣品采集檢測

將 18～22 g 昆明白小鼠48只隨機分為 6 組，每組 8只，第 1 組為CpG-A組，第 2 組為CpG-B組，第 3 組為復合增效劑組，第 4 組為納米顆粒免疫組，第 5 組為豬瘟E2組，第 6組為非免疫對照組（Control 組）。各組小鼠采用背部皮下免疫接種方式，免疫相應疫苗 0.1 mL/只。

1.4 "小鼠安全性監測

疫苗首免后連續觀察 7 d，記錄各組小鼠狀態。首免后0、7天，分別對各組小鼠體質量進行稱量，計算相對增重。

相對增重=（免疫后7日質量lt;ggt;-免疫前質量lt;ggt;）/（免疫前質量lt;ggt;）

1.5 "小鼠血清中豬瘟E2抗體ELISA檢測

將 1.3 中采集的各組小鼠血清依照豬瘟病毒抗體ELISA檢測試劑盒說明書稀釋，對各組小鼠首免后第0、7、14、21、35天血清進行抗體檢測。

1.6 "小鼠血清中IFN- γ檢測

將 1.3 中采集的各組小鼠血清依照鼠IFN-γ檢測試劑盒說明書稀釋，對各組小鼠首免后第7、14、21、35天血清進行鼠IFN-測定。

2 結果

2.1 豬瘟E2蛋白制備結果

豬瘟E2蛋白重組桿狀病毒接種 High Five細胞后收集培養液經濃縮純化后，進行 SDS-PAGE 電泳檢測及灰度分析測定結果顯示，檢測到與預期一致的 50 ku 目的條帶，蛋白濃度為 56μg/mL（圖 1.A）。western blot 特異性鑒定結果顯示該蛋白為豬瘟E2 特異性蛋白（圖 1.B）可用于疫苗制備。

2.2 免疫小鼠安全性觀察結果

免疫小鼠后 7 d內連續觀察并記錄小鼠狀態，結果顯示，除 Control 組小鼠外，其他各組小鼠在疫苗接種部位均出現被毛雜亂、突起潤濕現象，并在免疫后3 d內體表特稱全部恢復正常；觀察期內各組小鼠采食及活動正常；小鼠注射局部未觀察到潰爛、脫毛等不良癥狀。免疫0、7 d對小鼠體質量進行稱重，結果顯示 CpG-A 組、豬瘟E2組、納米顆粒組的小鼠體重相對增重值大于 Control 組，CpG-B組、復合增效劑組體質量相對增重值小鼠體重相對增重值小于 Control 組，但以上差異均不顯著（p＞0.05）（圖 2）。上述結果表明，各免疫增效劑對小鼠安全性良好。

2.3 免疫后小鼠血清豬瘟E2抗體ELISA檢測結果

各組小鼠分別于首免后第0、7、14、21、35天采集血清，經 ELISA 抗體檢測試劑盒檢測豬瘟E2蛋白特異性抗體。結果顯示， Control 組小鼠各時期血清樣品的豬瘟E2特異性抗體均為陰性；其他各組35 d全部為陽性；首免后第7、14、21天，各實驗組之間小鼠血清樣品豬瘟E2抗體水平差異不顯著（p＞0.05），首免后第35天其中CpG-B組、復合增效劑組小鼠血清樣品豬瘟E2抗體豬瘟E2組，CpG-B組與豬瘟E2組比較豬瘟E2抗體水平差異顯著（F=0.048，p＜0.05），復合增效劑組與豬瘟E2組比較豬瘟E2抗體水平差異極顯著（F=0.008，p＜0.01）；CpG-A、納米顆粒組與豬瘟E2組比較豬瘟E2抗體水平差異不顯著（FCpG-A=0.56、F納米顆粒=0.35，p＞0.05）（圖 3）。上述結果表明，免疫增效劑 CpG-B能夠顯著提高豬瘟E2亞單位疫苗免疫小鼠后抗體水平，復合增效劑能夠極顯著提高豬瘟E2亞單位疫苗免疫小鼠后抗體水平。

2.4 試驗小鼠中和抗體測定結果

各組首免后第14、21、35天血清進行中和抗體測定。結果顯示，復合增效劑組第35 天中和抗體效價最高；首免后第35天 CpG-B組中和抗體效價顯著高于豬瘟E2組（F=0.022，p＜0.05）；復合增效劑組中和抗體效價極顯著高于豬瘟E2組（F=0.0026，p＜0.01），Control 組豬只各時期血清樣品的中和抗體效價不高于1：4。結果表明，在首免后第35天，CpG-B組可顯著提高中和抗體水平，復合增效劑組能夠極顯著維持高水平中和抗體水平。

2.5 各組實驗鼠IFN-γ檢測結果

對首免后第7、14、21、35天血清中鼠IFN-γ進行測定。結果顯示，首免后第7天 CpG-B組鼠IFN-γ顯著高于豬瘟E2組（F=0.043，p＜0.05）；首免后第14天 CpG-B組鼠IFN-γ顯著高于豬瘟E2組（F=0.042，p＜0.05）；首免后第21、35天 復合增效劑組、CpG-B組間對比豬瘟E2組IFN-γ水平無差異顯著性。結果表明，CpG-B組在首免后0～14 d期間可提高鼠IFN-γ水平（5.77～52.09 pg/mL），其他增效劑組未能顯著維持高鼠IFN-γ水平。

3 討論

接種豬瘟疫苗是防控豬瘟疫病流行暴發的重要手段，我國長期采用全面接種豬瘟兔化弱毒疫苗來防控豬瘟，目前豬瘟在我國依然存在區域性散發情況，隨著隱性豬瘟感染病例逐年增多，迫使許多豬場采用加強免疫劑量及超前免疫的方式防控豬瘟，增加了豬場獸藥成本的同時免疫效果并不理想[11-12]。高瑩等[13]構建的重組桿狀病毒rAc-HE2oKm 可分泌表達重組 E2 蛋白，分泌表達重組蛋白可以有效形成病毒樣顆粒， 制備疫苗免疫仔豬，可誘導免疫仔豬產生高水平抗體和中和抗體，該蛋白具有較好的免疫原性。張文杰等[14]（2007）、李文良（2013）等[15]利用昆蟲細胞表達出高活性的重組E2蛋白，并且能夠分泌表達。Liu F X（2013）等[16]發現昆蟲細胞-桿狀病毒表達豬瘟病毒E2蛋白，可高效表達外源基因并對外源蛋白進行轉錄后糖基化、磷酸化等修飾，E2蛋白產物與天然蛋白功能高度相似，免疫原性顯著優于細菌、酵母表達體系。本研究利用昆蟲細胞-重組桿狀病毒系統進行豬瘟病毒 E2 蛋白表達，在制苗過程中加入免疫增效劑，分別在小鼠上開展了動物免疫實驗，并在免疫程序上設定為免疫一次，以期研究單次免疫添加增效劑疫苗對豬瘟E2蛋白特異性抗體的影響情況；對疫苗添加免疫增效劑的改良研究方向提供動物實驗數據支持。

Brown等[5]發現乳清蛋白、小麥蛋白與酵母 β-葡聚糖組合后具有良好的免疫增強功效，其作用以提高細胞免疫及增強巨噬細胞吞噬能力為主，以提高體液免疫及增強NK細胞活性為輔。由于單一佐劑有其使用的局限性，因此現有疫苗中大多會添加兩種以上的佐劑組成佐劑系統[17]。本研究中復合增效劑由三種增效劑混合制成（MPL、MDP 和 β-葡聚糖配比為1：1：1）， 三種組分均有提高機體非特異性免疫的功效。非特異性免疫的激發是提高特異性免疫的基礎，抗原分子經過巨噬細胞吞噬，并對抗原信息進行遞呈，刺激免疫系統激發非特異性免疫，進一步使B淋巴細胞活化﹑增殖﹑分化，從而增強了體液免疫中特異性抗體的水平。本研究結果表明，復合增效劑安全性良好，能顯著的激發特異性抗體的產生，可以作為豬瘟病毒E2蛋白亞單位疫苗的增效劑添加組分。由于免疫增效劑種類繁多，不同的種類﹑組合方式﹑劑量配比都是影響疫苗安全性有效性的關鍵因素，因此免疫增效劑作為疫苗更新發展的方向之一，是一項值得不斷深入研究的課題。

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