奶牛源單核細(xì)胞增生性李斯特菌分離鑒定及流行調(diào)查

摘要：為了解本地區(qū)規(guī)模化奶牛場(chǎng)單核細(xì)胞增生性李斯特菌的流行情況，本研究采集了320份奶牛鼻拭子，進(jìn)行單核細(xì)胞增生性李斯特菌的分離、培養(yǎng)和PCR鑒定。鑒定結(jié)果表明分離出6株單核細(xì)胞增生性李斯特菌，分離率1.88%，本研究為本地區(qū)奶牛單核細(xì)胞增生性李斯特菌的防控及保障動(dòng)物性食品安全奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：奶牛；單核細(xì)胞增生性李斯特菌；分離鑒定

單核細(xì)胞增生李斯特菌（listeria monocytogenes，LM）是重要的人畜共患致病菌和食源性病原菌[1]。由該菌引起的李斯特菌病發(fā)病率較低，多為散發(fā)，但發(fā)病急，病死率高，各種年齡、種類的畜禽以及人類均可感染發(fā)病，主要引起腦膜腦炎、中毒、流產(chǎn)和急性敗血癥等疾病。同時(shí)，單核細(xì)胞增生李斯特菌能夠污染肉、蛋、奶等動(dòng)物性食品，傳播給人類，因此，該菌對(duì)養(yǎng)殖業(yè)、食品安全及人類健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅[2]。該菌廣泛存在于自然界之中，但動(dòng)物是其主要的儲(chǔ)存宿主，帶菌動(dòng)物及患病動(dòng)物是主要傳染源。為掌握本地區(qū)奶牛源單核細(xì)胞增生性李斯特菌的流行情況，本研究采集了新疆烏魯木齊市、新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第十二師區(qū)域內(nèi)4家規(guī)模牛場(chǎng)鼻拭子樣品，開展牛源單核細(xì)胞增生性李斯特菌的分離鑒定，為本地區(qū)奶牛場(chǎng)單核細(xì)胞增生性李斯特菌的防控及保障公共衛(wèi)生安全提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

下列培養(yǎng)基購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司：李氏菌增菌肉湯（LB1，LB2），萘啶酸（C1）（李氏菌增菌肉湯lt;LB1gt;添加劑），萘啶酸（C2）（李氏菌增菌肉湯lt;LB2gt;添加劑），吖啶黃素（C1）（李氏菌增菌肉湯lt;LB1gt;添加劑），吖啶黃素（C2）（李氏菌增菌肉湯lt;LB2gt;添加劑），含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉湯（TSB-YE），含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆瓊脂（TSA-YE），PALCAM 培養(yǎng)基基礎(chǔ)，PALCAM選擇性添加劑；單增李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基購(gòu)自法國(guó)科瑪嘉CHROMagar公司；核酸提取試劑盒（磁珠法）中元匯吉生物技術(shù)股份有限公司；革蘭氏染色液購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；Taq "DNA Polymerase 購(gòu)自TaKaRa。

1.2主要儀器

PCR儀器購(gòu)自美國(guó)ABI；全自動(dòng)核酸提取儀；麥?zhǔn)媳葷醿x；細(xì)菌培養(yǎng)箱；生物安全柜。

1.3樣品采集

本試驗(yàn)采集規(guī)模化奶牛場(chǎng)奶牛鼻拭子樣品320份。采集拭子時(shí)將拭子輕輕插入牛的鼻腔，邊擦拭邊旋轉(zhuǎn)慢慢取出，快速放入盛有6 mL LB1的采樣管，蓋上蓋子，做好標(biāo)記，低溫運(yùn)送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌的培養(yǎng)。

1.4 增菌

將盛有拭子的LB1采樣管放在30 ±1 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h。移取0.1 mL LB1，轉(zhuǎn)種于10 mL LB2 增菌液內(nèi)，于30 ±1 ℃培養(yǎng)18～24 h。

1.5 分離

取LB2 增菌液劃線接種于PALCAM 瓊脂平板和李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基上，于36 ℃±1 ℃培養(yǎng)24～48 h，觀察各個(gè)平板上生長(zhǎng)的菌落。

1.6 純化

挑取可疑菌落在大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（TSA）平板上進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.7革蘭氏染色鏡檢

從TSA平板上挑取疑似菌落涂片固定，按照革蘭氏染色液試劑盒說明書中初染、媒染、脫色、復(fù)染等四個(gè)步驟進(jìn)行革蘭氏染色，并用顯微鏡鏡檢。

1.8 PCR鑒定

1）提取細(xì)菌基因組DNA。將鏡檢的疑似菌落接種胰蛋白胨大豆肉湯（TSB），36 ±1 ℃搖床中培養(yǎng)18～24 h。取菌液按照全自動(dòng)核酸提取儀和核酸提取試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)菌DNA的提取。

2）反應(yīng)體系配制。將上下游引物稀釋成25 μmol/L。取樣品 DNA 2 μL，上下游引物各0.1 μL，dNTP 2 μL，10×Buffer 2.5 μL，Taq 酶0.15 μL，DEPC水18.15 μL，反應(yīng)總體積為 25 μL，同時(shí)設(shè)置陰性和陽(yáng)性對(duì)照。

3）PCR 擴(kuò)增。將配置好反應(yīng)液的反應(yīng)管置于PCR儀器中，擴(kuò)增程序?yàn)轭A(yù)變性95 ℃ "5min；變性95 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s，延伸74 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；總延伸72 ℃ 5 min；保存4 ℃。

4）瓊脂糖凝膠電泳。用TAE溶液配制3%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，目的條帶274 bp。

5）測(cè)序。將PCR陽(yáng)性樣品的產(chǎn)物回收，送上海生工測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果在NCBI Genbank中進(jìn)行BLAST對(duì)比。

2 結(jié)果

2.1 分離鑒別培養(yǎng)基上菌落顏色及形態(tài)

陽(yáng)性菌落在PALCAM 瓊脂平板上為小的圓形灰綠色菌落，周圍有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷（圖1）；陽(yáng)性菌落在科瑪嘉李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基上的特征：規(guī)則藍(lán)色菌落帶有白色暈環(huán)（直徑＜3mm）（圖2）。

2.2 革蘭氏染色鏡檢

該菌為革蘭氏陽(yáng)性短桿菌，大小約為0.5μm×1.0～2.0μm，直或稍彎，兩端鈍圓，常呈V字形排列，偶有球狀、雙球狀，兼性厭氧、無芽孢，一般不形成莢膜，圖3。

2. 3 PCR鑒定結(jié)果

PCR擴(kuò)增后，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，6份樣品出現(xiàn) 274 bp 左右的條帶，與預(yù)期目的片段大小相符（圖4），陰陽(yáng)性對(duì)照均成立。將測(cè)序結(jié)果在 GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast比對(duì)，進(jìn)一步明確分離株為單增李斯特氏菌。本次一共檢測(cè)樣品320份，其中6份陽(yáng)性，314份陰性，陽(yáng)性率1.88%。

3 討論

本研究采集了4個(gè)規(guī)模化奶牛場(chǎng)的320份鼻拭子樣品，開展了單增李斯特氏菌的分離鑒定，奶牛帶菌率1.88%，雖然只是攜帶，沒有發(fā)病，但是當(dāng)奶牛機(jī)體免疫力下降時(shí)，鼻腔內(nèi)的單核細(xì)胞增生李斯特菌可快速繁殖進(jìn)入機(jī)體，引起奶牛發(fā)病，污染飼草料、水源、環(huán)境，并通過消化道、呼吸道快速傳播，是奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)的潛在威脅，應(yīng)引起足夠的重視。

牛感染單核細(xì)胞增生李斯特菌，俗稱牛李氏桿菌病，多發(fā)生在氣溫變化較大春秋季，犢牛最易感，主要臨床表現(xiàn)為行動(dòng)緩慢，神經(jīng)癥狀，共濟(jì)失調(diào)，突然死亡，懷孕母牛容易流產(chǎn)，病死率較高，并且該菌血清型較多，容易發(fā)生變異，沒有商品化疫苗來預(yù)防該病。牛一旦發(fā)病，往往來不及治療而死亡，且無特效治療方法，對(duì)養(yǎng)牛業(yè)產(chǎn)生較大的經(jīng)濟(jì)損失。單核細(xì)胞增生李斯特菌廣泛分布于自然界，對(duì)低溫、紫外線、酸堿等環(huán)境因素具有較強(qiáng)的抵抗力，預(yù)防本病的發(fā)生平時(shí)應(yīng)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，及時(shí)清理圈舍內(nèi)的糞便、污物，搞好環(huán)境衛(wèi)生，定期對(duì)牛舍進(jìn)行消毒，保持圈舍環(huán)境衛(wèi)生清潔，在牛場(chǎng)內(nèi)禁止飼養(yǎng)其他畜禽，消滅牛場(chǎng)內(nèi)的老鼠和其他嚙齒動(dòng)物，驅(qū)除外寄生蟲[3，4]。

本研究中李氏菌增菌肉湯LB1、LB2中添加了萘啶酸、吖啶黃素，抑制了大腸桿菌等其他細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖。單核細(xì)胞增生李斯特菌在PALCAM鑒別培養(yǎng)基和顯色培養(yǎng)基具有獨(dú)特的顏色和形態(tài)，便于菌落的識(shí)別和純化，這些方法提高了單核細(xì)胞增生李斯特菌的分離檢出率。最后用PCR分子生物學(xué)方法和測(cè)序?qū)Ψ蛛x的6株單增李斯特菌進(jìn)行鑒定，既得到了菌株，又提升了分離鑒定的可靠性和速度，在單增李斯特菌分離鑒定和流行調(diào)查中值得推廣。

參考文獻(xiàn)：

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