光照調整對于牛乳中褪黑素質量濃度的影響及其檢測

任皓威，王丹，劉鵬，姜毓君

(東北農業大學黑龍江省乳品工業技術開發中心，哈爾濱 150086)

光照調整對于牛乳中褪黑素質量濃度的影響及其檢測

任皓威，王丹，劉鵬，姜毓君

(東北農業大學黑龍江省乳品工業技術開發中心，哈爾濱 150086)

通過調整奶牛的光照周期使牛乳中富含褪黑素成分，并通過液相色譜技術對于富含褪黑素的原料乳進行檢測，結果發現褪黑素質量濃度有顯著提高。色譜條件：色譜柱Zorbax eclipse XDB C18柱；流動相為甲醇∶水=60∶40，流速為1 mL/min，熒光檢測器Ex= 286 nm，Em=345 nm。

褪黑素；光照；牛乳及乳制品；檢測

0 引言

褪黑素(Melatonin,MT)主要是由哺乳動物和人類的松果體分泌的一種吲哚類激素。褪黑素的化學式為C13H16N2O2，分子量為232.278 u。在體內主要由肝臟代謝，幾小時后可由尿液排出體外。

作為牛乳中發現的主要幾中激素類物質之一，且在人乳中也有發現，主要對于光照周期產生反應[1，2]。褪黑素的生物合成受光周期的制約，夜間褪黑素分泌量比白天多5～10倍，在清晨2：00到3：00達到峰值。并據此推測，乳中褪黑素的波動可能是母乳喂養嬰兒過程中時間信息溝通的方式[3，4]。

1 試驗動物及樣品采集

本研究應用泌乳期娟珊奶牛21頭，按照光照周期時間及強度不同，分為對照組和試驗組I和試驗組II。在試驗期間，保持牛舍清潔、通風良好，試驗用牛只自由飲水采食，并嚴格保持光照條件進行飼養。

在試驗過程中根據奶牛泌乳階段的不同，分為泌乳初期、泌乳盛期、泌乳中期和泌乳后期4個階段，每組泌乳期奶牛7頭，每頭19個采樣時點進行乳樣采集。樣品采集后，立即裝入滅菌塑料管-20℃凍存。

2 原料乳及乳制品中褪黑素的檢測方法

在本研究中對于原料乳及乳制品中褪黑素的檢測，參照了國家標準《保健食品中褪黑素含量的測定（GB/T 5009.170-2003）》、黃宏南等和Peniston-Bird等的檢測方法[5-7]，并加以改進。

2.1 儀器與試劑

儀器為Agilent 1100LC型高效液相色譜儀；G1321A熒光檢測器。

Strata樣品提取柱(C18-E 55um，100 mg/mL)。試劑為甲醇（HPLC級）。

2.2 色譜條件

色譜柱Zorbax eclipse XDB C18柱；流動相為甲醇∶水=60∶40，流速為1 mL/min，熒光檢測器Ex=286 nm，Em=345 nm，進樣量10 μL。

2.3 褪黑素標準溶液的制備

精確稱取20 mg褪黑素標準品于100 mL容量瓶中，加入體積分數為70%乙醇溶解后定容至刻度，準確吸取2 mL上述溶液與10 mL容量瓶中，加入流動相，定容至刻度，此溶液質量濃度為0.040 g/L。

2.4 樣品前處理

準確量取5 mL乳液于10 mL具塞試管中，加入1∶1鹽酸，震蕩、超聲20 min后取出，離心15 min，過濾。

2.5 樣品富集和解析

用針筒吸取10 mL甲醇通過Strata柱，流速為3～5 mL/min，再用20 mL蒸餾水2次沖洗小柱，將甲醇洗凈。然后將上述濾液分次通過Strata柱(3～5 mL/ min)富集，再用質量分數為5%甲醇10 mL沖洗2次，加1 mL甲醇解吸，收集解吸液，過0.45 μm微孔濾膜后進樣。

2.6 數據處理

試驗數據以平均值(X)±標準差(SD)表示，統計分析用SAS軟件包的方差分析軟件進行分析。試驗結果各表中字母相同表示差異不顯著(P＞0.05)，字母不同表示差異顯(P＜0.05)。

3 巴氏殺菌乳和酸乳的試制

以富含褪黑素的原料乳進行了巴氏殺菌乳的試制。其生產流程如下：

原料儲存罐5℃→預熱55℃→牛奶標準化→預熱66℃→均質200 kg/cm2→殺菌72℃→保溫20 s→冷卻4℃→巴氏殺菌奶儲罐→消毒奶軟包裝機。

在此基礎上，又進行了攪拌型酸奶的試制。其生產流程如下：

巴氏殺菌72℃，15 s→均質150 kg/cm2，60℃→冷卻42～43℃→發酵罐，攪拌1～2 min→發酵劑→42～43℃，2.5～3 h→終點pH=4.4，酸度120°T→灌裝→包裝→冷卻7～10℃。

4 結果與分析

4.1 褪黑素標準品色譜圖

在色譜條件下，測定褪黑素標準品溶液，得到液相色譜圖（圖1）；測定富含褪黑素乳樣品液相色譜圖（圖2）。

4.2 標準曲線繪制及回收率測定

用定容后的褪黑素標準品溶液，配制標準品質量濃度分別為40，60，80，100，120，140，160，180 ng/L，將標準品依次進樣，檢測每個質量濃度相應的峰面積，繪制標準曲線。其回歸方程為Y=13.95X+1.48（R= 0.998）。按試驗方法測定3次回收率，平均可達92%。

4.3 樣品測定與結果計算

依次將經前處理后樣品進行色譜檢測，以標準品峰保留時間定性，并根據樣品組分的峰面積在標準曲線上查出相應的褪黑素質量濃度，每個樣品檢測3次。根據標準曲線進行計算原料乳、巴士殺菌乳及酸奶中褪黑素的濃度。

4.4 樣品測定結果

原料乳中褪黑素檢測結果數據分別為，對照組為（11.64±0.92）ng/L；試驗組I為（29.44±1.02）ng/L；試驗組II為（33.15±1.21）ng/L，試驗組較對照組有顯著提高（p＜0.05）（圖3）。經液相色譜法檢測，高褪黑素質量濃度原料乳經巴氏殺菌后，褪黑素質量濃度變化差異不顯著（p＞0.05），可保留98%以上，具體數據為巴氏殺菌前為（30.27±1.10）ng/L；巴氏殺菌后為（29.85±0.98）ng/L（圖3）。高褪黑素質量濃度原料乳經巴氏殺菌后進行攪拌型酸奶的試制，經液相色譜法檢測，褪黑素質量濃度變化差異不顯著（p＞0.05），可保留95%以上，具體數據為巴氏殺菌前為（29.85±0.98）ng/L；制成攪拌型酸奶后為（29.52±0.89）ng/L（圖3）。

3 討論

褪黑素作為一種大腦產生的激素，幫助調節24小時的身體周期，并且在牛奶中自然存在。乳中的褪黑素具有晝夜模式，既午夜濃度最高，中午濃度最低（表1）[1，2]。褪黑素的產生隨年齡增長而下降，從而導致失眠和晝夜節律性變化。血液中褪黑素變化已被證明可改善老人睡眠質量。褪黑素可以幫助調節身體的節律，具有較豐富褪黑素的夜間牛奶，可幫助人們提高睡眠質量。

表1 乳中褪黑素質量濃度比較

Valtonen等2005年為了研究褪黑素（10～40 ng/L，這種劑量水平不影響白天血液中褪黑素的質量濃度）對于老人睡眠質量的作用，采用含有褪黑素的夜間牛奶作為飲料。經研究發現，使用大約0.5 L的褪黑素夜間牛奶可改善老人睡眠質量和生理狀況。

由于褪黑素的良好作用，富含褪黑素的乳制品已經成為乳品市場一個新成員。1999年，英格曼乳業的夜間牛奶（高褪黑素牛奶）保留了牛奶中天然褪黑素，盡管價格較高，但由于健康需求，銷售一直穩步增長。類似的產品也已經在日本問世（Nakazawa Foods的Adult Milk），英國也有兩個牛奶品牌（Cricketer Farm的Night Time Milk和Red Kite的Slumber Bedtime Milk）推出了高褪黑素牛奶。

目前對于褪黑素的分析技術包括放射免疫法、酶聯免疫法、氣-質聯用法、紫外分光光度法、液相色譜法和電化學法等。放射免疫法簡單、靈敏,但需要放射性試劑,該方法利用甲醛將褪黑素與牛甲狀腺球蛋白連接后免疫新西蘭白兔獲得高品質褪黑素抗血清,125I標記褪黑素獲得標記物，非平衡競爭法建立褪黑素放射免疫分析方法。是乳中褪黑素質量濃度的檢測方法較常見的方法之一[1，2，8]，但該方法由于其需要使用放射性試劑而受到限制。其他幾種方法也因為檢測儀器和檢測方法靈敏度等的限制，沒有被廣泛采用。

近年來較多采用的是液相色譜法，高效液相色譜法的色譜條件根據褪黑素是弱極性物質，均采用ODS柱，通過調整流動相即可獲得較好的色譜行為，常用甲醇為有機改性劑。大部分測定方法以甲醇-水為流動相，僅是比例有所不同，從70∶30到50∶50[9-11]。

4 結束語

本研究得到的原料乳、巴氏殺菌乳和酸乳中褪黑素質量濃度，經液相色譜檢測結果與上富含褪黑素乳制品中褪黑素質量濃度相當。但在我國尚沒有類似的產品問世，本研究對于我國的富含褪黑素乳制品生產提供了支持。為提高我國乳制品附加值，為富含褪黑素的功能性乳制品開發提供了依據。

[1]ILLNEROVA H,BURESOVA M，PRESL J.Melatonin Rhythm in Human Milk[J].J Clin Endocrirwl Metab.1993，77：838-841.

[2]ERIKSSON L，VALTONEN M，LAITINEN J T，et al.Diurnal Rhythm of Melatonin in Bovine Milk：Pharmacokinetics of Exogenous Melatonin in Lactating Cows and Goats[J].Acta Vet Scand，1998，39(3)：301-310.

[3]LAITINEN，J VAKKURI，O.Breast-feeding provides Rhythmic Source of Melatonin to the Infant.Program of the first European congress of endocrinology，Copenhagen，1987.130

[4]KOLDOVSKY O，ILLNEROVA H，MACHO L，et al.Milk-borne Hormones：possible Tools of Communication between Mother and Suckling[J].Physiol Res.1995，44(6)：349-351.

[5]《保健食品中褪黑素含量的測定（GB/T 5009.170-2003）》，2003

[6]黃宏南，林宏琳，牛乳中天然褪黑素HPLC-PDA-FLD測定方法研究[J].中國衛生檢驗雜志2005，15(10)：1216-1217.

[7]PENISTON-BIRD JF，DI WL，STREET CA，et al HPLC Assay of Melatonin in Plasma with Fluorescence Detection[J].Clinical Chemistry，2003，39：2242-2247.

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Influence of light rhythm on melatonin in milk and detection

REN Hao-wei，WAN Dan，LIU Peng，JIANG Yu-jun
(Heilongjiang Dairy Industry Technical Development Center，Northeast Agricultural University，Harbin150086，China)

In order to get the melatonin rich milk，the method by adjusting the light rhythm of cows was used.And a method for determination of melatonin in milk and dairy products by high-performance liquid chromatography(HPLC)was used.And then separated on Zorbax eclipse XDB C18 column with a mixed solution of methanol/water 60/40 as mobile phase，and detected at Ex=286 nm，Em=345 nm with a Fluorescence detector.

Melatonin；light；milk and dairy products；detection

TS252.7

A

1001-2230（2011）04-0055-03

2011-01-10

黑龍江省優勢農產品生產與加工研發平臺產業化項目（193082）。

任皓威（1980-），男，博士，從事乳品科學方面研究。

姜毓君