CO2對豬肉中單增李斯特菌抑制模型的優選及建立

張文敏,董慶利,劉陽泰,辛寶,錢文文,任曉梅,段亮亮

1(陜西中醫藥大學 公共衛生學院,陜西 咸陽,712046) 2(上海理工大學 健康科學與工程學院,上海,200093)

肉及肉制品富含蛋白質、礦物質和維生素,是人們攝取營養物質的主要來源。單增李斯特菌因其在自然界中廣泛存在且對苛刻環境的耐受力強的特性,對肉及肉制品的食用安全造成嚴重威脅。單增李斯特菌是全球范圍內嚴重威脅公眾健康安全的食源性致病菌,導致的食品安全問題不僅給消費者安全帶來極大的危害,也造成了巨大的社會經濟損失,因此采取有效措施控制食品中單增李斯特菌的污染迫在眉睫[1-2]。

氣調包裝是豬肉常用的包裝方式之一,包裝材料的存在可避免豬肉被二次污染[3]。另外,包裝內的CO2氣體溶解于食品后,進入細菌內部,通過降低細菌的胞內pH值、延緩新陳代謝速率及改變細菌的生理狀態抑制多種有害菌的生長[4]。研究表明10%～20%的CO2即可抑制有害菌生長,40%～60%的CO2具有更好的抑制效果,100%的CO2能夠完全抑制需氧微生物的生長[5]。但是CO2濃度太高,會導致肉的多汁性降低,顏色發暗,常在包裝內充入O2以維持豬肉的色澤[6]。

目前,國內外的研究常常基于致病菌濃度的減少評估食品安全控制措施的有效性。先前的研究也多集中于探討CO2對單增李斯特菌最大污染濃度(Nmax)的影響[7-8]。致病菌在食品中能夠達到的Nmax由致病菌的生長特性決定,遲滯時間(λ)、最大比生長速率(μmax)和Nmax等生長動力學參數是描述致病菌生長特性的重要指標。通過對致病菌的生長動態進行數學建模可以獲得致病菌的生長動力學參數。另外,數學模型的正確選擇對準確預測微生物的生長動態至關重要。構建正確的生長模型可向食品安全決策者提供更為精確的微生物生長信息,對于保障食品質量和食品安全具有十分重要的意義。

本試驗的目的是基于預測模型研究CO2氣體對豬肉中單增李斯特菌生長特性的影響。首先分別應用Baranyi模型、Logistic模型和修正的Gompertz模型擬合不同CO2濃度條件下單增李斯特菌的生長曲線。根據用池信息準則(Akaike′s information criteria,AIC)和貝葉斯信息準則(Bayesian information criteria,BIC)模型評價參數,選取擬合優度最好的一級模型。基于一級模型獲得的單增李斯特菌的生長動力學參數,用Ratkowsky-type擬合CO2抑菌的二級模型,探討CO2氣體對單增李斯特菌生長動力學參數λ、μmax和Nmax的影響,為CO2氣體應用于豬肉安全控制作出準確、科學的評估和預測。

1 材料與方法

1.1 菌種

試驗所用單增李斯特菌(ATCC 13932,血清型4b)由本實驗室保藏。單增李斯特菌血清型4b為主要導致消費者食物中毒和孕婦流產的血清型[9]。血清型的選取考慮了豬肉被單增李斯特菌污染最嚴重的場景。

1.2 培養基與耗材

含0.6%酵母膏的胰酪胨大豆肉湯(trypticase soy-yeast extract broth, TSB-YE)、PALCAM瓊脂(PALCAM Agar)、PALCAM添加劑、無菌均質袋、試管、封口膜,青島海博生物技術有限公司;氣調保鮮盒、氣調保鮮膜,蘇州市凱康機械設備有限公司。

1.3 儀器與設備

YXQ-LS-S2型滅菌鍋,上海博訊實業有限公司;HLQ-8型斬拌機,安徽華菱西廚裝備有限公司;SW-CJ-IFD型生物安全柜,江蘇蘇州安泰空氣技術有限公司;THZ-103B型恒溫培養搖床,上海一恒科學儀器有限公司;HWS-250型恒溫恒濕培養箱,上海比朗儀器有限公司;XW-80A型漩渦儀器,上海精科實業有限公司;均質機,浙江新芝生物科技有限公司;高速冷凍離心機,賽默飛世爾科技(中國)有限公司;氣調包裝機,蘇州凱康包裝機有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 細菌培養和接種液制備

單增李斯特菌的工作菌株劃線保存在TSA-YE培養基上,放在4 ℃的冰箱中保存,每個月活化1次。試驗前1 d,用滅菌的接種環從TSA-YE培養基上挑取一株菌苔,接種于100 mL TSB-YE培養基中,并在37 ℃、110 r/min的搖床上培養18 h,使細菌生長到穩定期(大約108CFU/mL)。取10 mL菌懸液在冷凍離心機中離心收集菌體(4 ℃,8 000 r/min,5 min)。菌體用10 mL無菌生理鹽水重懸,重復2次。最后用無菌生理鹽水將單增李斯特菌菌液稀釋到104～105CFU/mL左右備用。

1.4.2 肉樣處理與接種

試驗前1 d從超市購買豬后腿瘦肉,快速運回實驗室冷藏。試驗前將整塊的豬后腿瘦肉切成小塊,放在用75%酒精擦拭滅菌過的斬拌機中斬拌3 min,將制得的肉糜放在預先紫外殺菌的托盤中,轉移到無菌操作臺,紫外輻照1 h,期間每隔15 min翻動肉糜,使得肉糜的外部和里面都能被紫外輻射滅菌。

在生物安全柜中,稱取已滅菌的肉樣25 g/份,分裝在無菌均質袋中,每份肉樣接種1 mL單增李斯特菌接種液。將接種了菌液的肉樣用無菌均質機正反面各拍打2 min,使得菌液在肉樣中均勻分布。肉樣中單增李斯特菌的濃度約為103CFU/g。精確接種濃度用PALCAM平板計數測定。取兩份肉樣接種1 mL無菌生理鹽水作為陰性對照組。

1.4.3 氣調包裝、貯藏及微生物計數

在生物安全柜中,將接種了單增李斯特菌的豬肉從無菌均質袋中轉移到已經紫外輻照殺菌的氣調保鮮盒中。將氣調保鮮盒分成5組(每組40份樣品),按表1進行氣調包裝。其中,對照組(TC)近似于無菌空氣包裝。將每組包裝好的豬肉分成兩個亞組(每組20份樣品),一組放置在13 ℃恒溫培養箱中培養,模擬“溫度濫用(abuse temperature)”條件下豬肉中單增李斯特菌的生長情況;另一組放置在25 ℃恒溫培養箱中培養,模擬室溫條件下豬肉中單增李斯特菌的生長情況。

表1 氣調包裝中的氣體配比 單位:%

在肉樣儲存過程中,每隔適宜時間取樣對單增李斯特菌濃度進行計數,取樣時間間隔由預試驗結果確定。總的來說,CO2濃度越高,取樣間隔時間越長。

1.5 一級生長模型的構建

分別使用Baranyi模型、修正的Gompertz模型(M-Gompertz模型)和Logistic模型對單增李斯特菌在不同條件下的生長曲線進行擬合,并對單增李斯特菌生長曲線的動力學參數λ、μmax和Nmax進行估計。

所用Baranyi模型的表達式如公式(1)所示:

(1)

Gompertz模型的表達式如公式(2)所示:

Y(t)=Y0+(Ymax-Y0)exp

(2)

Logistic模型的表達式如公式(3)所示:

(3)

式中:Y0、Yt和Ymax,在初始時刻、t時刻和達到穩定期時的單增李斯特菌濃度,ln CFU/g;μmax,最大比生長速率,ln CFU/(g·h);λ,細菌生長的遲滯時間,h。

1.6 一級生長模型的優選

用AIC和BIC對建立的一級模型進行數學評價。AIC和BIC是評價模型性能的擬合優度指標,可以權衡模型的復雜性和準確性,可以在多個相互競爭的模型中將最佳模型選擇出來[10]。AIC和BIC的值越小,所建立的模型的擬合優度越好。AIC和BIC的數學表達式如公式(4)、公式(5)所示:

(4)

(5)

式中:n,觀察到的數據點個數;SSE,殘差平方和;k,模型參數的個數。

1.7 二級模型的構建

基于最優的一級模型獲得的生長動力學參數,用平方根模型擬合CO2抑菌的二級模型。平方根模型的形式如公式(6)、公式(7)所示[11]:

(6)

(7)

式中:a和b是回歸系數;CO2 max和CO2 min分別是對方程進行外推,得出單增李斯特菌生長速率為零時的最高和最低CO2濃度值,即回歸線和CO2軸的截距所得數據,也就是說CO2 max和CO2 min不是真實的單增李斯特菌生長的最大CO2濃度和最小CO2濃度,而是理論上的最大CO2和最小CO2值。

1.8 數據處理與統計分析

應用Microsoft Excel 2010將單增李斯特菌菌落數“CFU/g”轉換為“lg CFU/g”。應用Microrisk Lab軟件(https://www.microrisklab.top/)擬合單增李斯特菌的一級生長模型,并且獲得AIC和BIC參數。應用Origin 8.0軟件(美國OriginLab公司)構建CO2對單增李斯特菌的二級抑制模型。每個試驗至少做3次獨立重復試驗。應用SPSS 17.0軟件(美國IBM公司)對數據進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 CO2對單增李斯特菌的抑制作用

CO2氣體對13、25 ℃貯存豬肉中單增李斯特菌的抑制情況見圖1。由圖1可知,兩種溫度條件下,均是TC組單增李斯特菌的λ最短,μmax最大,到達穩定期的時間最短。隨著CO2濃度的增加,單增李斯特菌的λ延長,μmax減小,到達穩定期的時間延長。CO2濃度越高,對單增李斯特菌的抑制作用越強。在13 ℃(25 ℃)貯存時,TC組、T20%CO2組、T40%CO2組、T60%CO2組和T80%CO2組中單增李斯特菌的Nmax最終能夠達到7.20 lg CFU/g(8.40 lg CFU/g)左右。

a-13 ℃;b-25 ℃圖1 CO2對豬肉中單增李斯特菌的抑制作用Fig.1 The inhibition effect of CO2 on L.monocytogenes in pork meat

葉可萍[12]及LEE等[13]的研究表明,在15、25 ℃貯存豬肉中,單增李斯特菌分別在50、20 h左右生長到穩定期,Nmax分別約為6.30 lg CFU/g、7.30 lg CFU/g。本試驗得到的單增李斯特菌Nmax比上述研究稍高,可能是因為使用了無菌豬肉,單增李斯特菌生長不受其他微生物影響。

研究結果顯示,CO2濃度越高,對單增李斯特菌的抑制作用越強。這與CO2在食品中的溶解特性有關。氣調包裝中,溶解于豬肉中水相和脂肪的CO2起到抑菌作用[14]。CO2在食品中的溶解量和CO2在氣調包裝氣體中所占的體積成正比,CO2占的比例越大,在食品中的溶解量越多,從而進入細菌細胞內部的CO2量越多,對單增李斯特菌的抑制作用越強。

CO2對單增李斯特菌生長動力學參數的具體影響,需要進一步對一級生長模型擬合得到的λ、μmax和Nmax值進行統計學分析。

2.2 CO2對單增李斯特菌λ的影響

分別用Baranyi模型、M-Gompertz模型和Logistic模型對不同CO2濃度下單增李斯特菌的生長曲線進行擬合,獲得的λ見表2。

13 ℃貯存時,單增李斯特菌的λ隨著CO2濃度的增加而延長,CO2濃度越高,對單增李斯特菌的抑制作用越強。由Baranyi模型擬合得到的TC組單增李斯特菌λ是10.68 h,和TC組相比,T20%CO2組、T40%CO2組、T60%CO2組和T80%CO2組中單增李斯特菌的λ分別延長了0.18、0.65、0.83、1.06倍。由統計分析結果可知,CO2體積分數達到40%時,才能顯著延長單增李斯特菌的λ(P<0.05)。在5種試驗條件下,Logistic模型和Baranyi模型對單增李斯特菌λ的擬合無顯著差異(P≥0.05);在T60%CO2組,Gompertz模型擬合的單增李斯特菌λ大于Logistic模型擬合的λ。

25 ℃貯存時,同樣地,隨著CO2濃度的增加單增李斯特菌的λ延長。由Baranyi模型擬合得到TC組單增李斯特菌的λ是3.43 h,和TC組相比,T20%CO2組、T40%CO2組、T60%CO2組和T80%CO2組中單增李斯特菌的λ分別延長了0.19、0.90、1.9、2.04倍。在5組試驗條件下,Gompertz模型擬合的單增李斯特菌λ大于Baranyi模型和Logistic模型擬合的λ。

研究結果表明在13、25 ℃貯存條件下,CO2都能延長單增李斯特菌的λ,說明CO2在單增李斯特菌的遲滯期就能作用于細菌細胞。我們的研究結果和GEYSEN等[15]與DEVLIEGHERE等[16]的研究一致。GEYSEN等[15]應用Baranyi模型構建了7 ℃時單增李斯特菌在不同CO2濃度下的生長模型,結果發現,25% CO2條件下單增李斯特菌的λ比13.5% CO2條件下長4 h。DEVLIEGHERE等[16]的研究也表明CO2濃度越高,單增李斯特菌的λ越長。但是BENNIK等[17]卻指出CO2氣體對單增李斯特菌的λ無影響。

先前的研究得到不一致的結果,可能是因為單增李斯特菌的λ長短不僅和試驗時所處的生長條件有關,還和單增李斯特菌細胞先前所處的“歷史環境”有關[8,18]。有研究表明單增李斯特菌的歷史環境能夠影響細胞的生理狀態,進而影響細胞在進入一個新環境時對該環境的適應能力(λ)[19-20]。

表2 CO2對單增李斯特菌λ的影響 單位:h

2.3 CO2對單增李斯特菌μmax的影響

分別用Baranyi模型、M-Gompertz模型和Logistic模型對不同CO2濃度下單增李斯特菌的生長曲線進行擬合,獲得的μmax見表3。

13 ℃貯存時,隨著CO2濃度的增加,單增李斯特菌的μmax降低。由Baranyi模型擬合得到TC組單增李斯特菌的μmax是0.089 lg CFU/(g·h),和TC組相比,T20%CO2組、T40%CO2組、T60%CO2組和T80%CO2組中單增李斯特菌的μmax分別降低了21%、36%、44%和47%。由統計分析結果可知,CO2體積分數達到60%時,才能顯著降低單增李斯特菌的μmax(P<0.05)。在T60%CO2組,Gompertz模型擬合得到的μmax大于Logistic模型擬合的μmax;其余4組中,3種一級模型擬合的μmax無顯著差異(P≥0.05)。

25 ℃貯存時,同樣地,隨著CO2濃度的增加,單增李斯特菌的μmax降低。由Baranyi模型擬合的TC組單增李斯特菌的μmax是0.320 lg CFU/(g·h)。和TC組相比,T20%CO2組、T40%CO2組、T60%CO2組和T80%CO2組中單增李斯特菌的μmax分別降低了26%、40%、57%和69%。由統計分析結果可知,CO2體積分數達到20%時,即能顯著降低單增李斯特菌的μmax(P<0.05)。在5種試驗條件下,Logistic模型擬合的μmax均小于Baranyi模型擬合得到的μmax。

表3 CO2對單增李斯特菌的μmax值的影響Table 3 The μmaxof L.monocytogenes under different CO2 concentrations

2.4 CO2對單增李斯特菌Nmax的影響

13 ℃貯存時,由Baranyi模型擬合得到的TC組單增李斯特菌的Nmax為7.23 lg CFU/g。在5組試驗中,單增李斯特菌的Nmax沒有顯著性差異(P≥0.05),3種一級模型擬合得到的Nmax也無顯著性(P≥0.05)差異。25 ℃貯存時,由Baranyi模型擬合得到的TC組單增李斯特菌的Nmax為8.40 lg CFU/g。在5組試驗中,單增李斯特菌的Nmax沒有顯著性變化(P≥0.05)。在TC組、T20%CO2組和T80%CO2組,Gompertz模型擬合得到的單增李斯特菌Nmax顯著(P<0.05)高于Baranyi模型和Logistic模型擬合得到的Nmax。

由致病菌導致消費者患病的劑量-效應模型可知[22],消費者患李斯特菌病的概率由攝入該菌的劑量及毒性大小共同決定。消費者攝入單增李斯特菌的劑量由該菌在食品中的最終Nmax與和攝入食物的份量共同決定。因此,攝入食物份量一定時,在食品中的Nmax是影響消費者攝入單增李斯特菌劑量的主要影響因素。由單增李斯特菌導致的食品安全問題不僅給消費者帶來極大的食用風險,也給食品加工業造成了巨大的經濟損失。不同的抑菌技術可從不同方面控制單增李斯特菌的生長,因此可將CO2與其他抑菌措施聯合起來應用到食品中,以更好的提高食品食物微生物安全[23]。

表4 CO2對單增李斯特菌的Nmax值的影響Table 4 The Nmaxof L.monocytogenes under different CO2 concentrations

綜合分析3種模型擬合得到的單增李斯特菌的生長動力學參數發現,Logistic模型會低估μmax,M-Gompertz模型會高估λ,低估μmax和高估λ在風險評估中會低估單增李斯特菌的風險。3種一級模型對不同溫度與CO2濃度下單增李斯特菌生長曲線的擬合優度還需要通過數學評價參數進行科學的評價。

2.5 一級模型的優選

由圖2可知,13 ℃貯存時,建立的TC組、T20%CO2組、T40%CO2組、T60%CO2組和T80%CO2組單增李斯特菌的生長曲線中,有4組是Baranyi模型的AIC和BIC數值最小(除去T60%CO2組);在25 ℃貯存時建立的5組單增李斯特菌的生長曲線中,有4組是Baranyi模型的AIC和BIC數值最小(除去T40%CO2組)。綜上所述,在建立的10條單增李斯特菌生長曲線中,有8條是Baranyi模型的AIC和BIC數值最小。因此,Baranyi模型、Gompertz模型和Logistic模型中,Baranyi模型比較適宜于描述不同CO2條件下單增李斯特菌的生長曲線。

M-Gompertz模型和Logistic模型是經驗模型,二者的模型涵義容易理解,模型結構也和簡單,因此常被預測微生物學家應用于描述細菌的生長。但是由本試驗和前人的研究結果可知[13],M-Gompertz和Logistic模型通常會低估細菌的生長能力,這在風險評估中屬于“低估風險”。Baranyi模型從細胞生長過程中的參數進行考慮,既描述了微生物隨時間的變化規律,又考慮了微生物的生理學階段即生長遲滯期。另外,理論上模型中參數越多對細菌生長的情況會描述的越準確,但是參數過多會導致模型使用不方便且建模者的工作量增加,還會造成過模型擬合的現象。Baranyi模型則很好的協調了模型的參數和模型準確性之間的關系,使用了最少的并且具有生理學意義的參數對細菌的生長狀況做了最準確的描述。

2.6 二級模型的建立

將Baranyi模型擬合的λ和μmax代入Ratkowsky-type模型,分別得到CO2與單增李斯特菌λ和μmax的關系(圖3)。

a-13 ℃時AIC;b-13 ℃時BIC;c-25 ℃時AIC;d-25 ℃下BIC圖2 用AIC和BIC評價三個一級生長模型的擬合優度Fig.2 Comparison of AIC and BIC of three primary models

a-13 ℃時λ值;b-13 ℃時μmax值;c-25 ℃時λ值;b-25 ℃下μmax值圖3 CO2抑制單增李斯特菌生長的二級模型Fig.3 Secondary models of L.monocytogenes inhibited by CO2 atmosphere

從構建的二級模型看出,13 ℃貯存時CO2 min和CO2 max體積分數分別為-20.15%和160%,表明在13 ℃時,理論上在CO2體積分數為-20.15%和160%時,單增李斯特菌依然可以生長。25 ℃貯存時,CO2 min和CO2 max體積分數分別為0.38%和100%,表明在25 ℃時,理論上在CO2體積分數為0.38%和100%時,單增李斯特菌依然可以生長。另外,圖3的結果還表明,在同一溫度下,CO2的濃度與單增李斯特菌λ2成正比,與μmax成反比。

模型的數學評價結果表明,Ratkowsky-type模型能夠很好的擬合CO2對單增李斯特菌的抑制作用(R2≥0.87),可以用來描述CO2對單增李斯特菌生長特性的影響。從建立的模型可以計算任意CO2濃度條件下單增李斯特菌的λ和μmax,不需要進行傳統的微生物計數就可以監控單增李斯特菌的生長動態。

3 結論

Baranyi模型、Gompertz模型和Logistic模型3種一級模型中,Baranyi模型對不同CO2氣調包裝豬肉中單增李斯特菌生長的擬合性優于其他兩種一級模型。CO2體積分數為20%時就可以抑制單增李斯特菌生長,并且CO2濃度越高,抑制作用越強。和TC組相比,13 ℃(25 ℃)貯存時,20% CO2、40% CO2、60% CO2和80% CO2可將單增李斯特菌的λ分別延長0.18(0.19)、0.65(0.90)、0.83(1.97)、1.06(2.04)倍,可將μmax分別降低21%(26%)、36%(40%)、44%(57%)和47%(69%)。CO2對單增李斯特菌的Nmax無顯著影響(P≥0.05),可將CO2與其他抑菌技術聯用以更好地提高食品的微生物安全。另外,Ratkowsky-type模型能夠很好的擬合CO2與單增李斯特菌λ及μmax的關系(R2≥0.87),可以用來描述CO2對單增李斯特菌生長特性的影響。