基于超高效液相色譜-四級桿/靜電場軌道阱高分辨質譜非靶向篩查分析烤牛肉在不同溫度下的差異標記物

李波,孫世琨,蘇阿龍,禹潔,師希雄

1(甘肅農業大學 食品科學與工程學院,甘肅 蘭州,730070)2(甘肅省食品檢驗研究院,甘肅 蘭州,730000)

國際相關調查和移民研究表示,飲食與結直腸息肉密切相關。有研究表明息肉組患者食用紅肉頻次相對較高且經常吃紅肉的人患結腸直腸癌的風險更高,還可能增加患乳腺癌、胃癌、胰腺癌、肺癌、食道癌和膀胱癌的風險[1-3]。但是,因為加工方式、添加的調料等復雜的飲食因素,并沒有足夠的證據直接證明食用未經加工的紅肉和致癌之間存在顯著關聯,但可以明確的是,烹飪加工提高了肉類的消化率和適口性的同時,也會產生致癌物質,并且多存在于煎炸、燒烤或干制的高溫烹飪方式過程中[4]。

牛肉及牦牛肉的加工制品,是甘肅省的特色肉品加工業,它們的肉質和滋味都得到了國內外消費者的一致認可,但如果加工過程不規范或者控制條件不嚴格,會導致產品可能會含有對人體產生危害的組分,比如極高的加工溫度可導致致癌和致突變化合物的形成,包括已知的雜環胺、多環芳烴化合物、亞硝胺、脂質過氧化物和自由基[5-7]。TENG等[8]采用高效液相色譜并熒光檢測器對豬肉烹飪過程中的雜環胺進行檢測,鐘華珍[9]采用高效液相色譜并紫外檢測器對3種畜禽肉中的多環芳烴進行了測定,YAN等[10]采用超高效液相色譜-四級桿/靜電場軌道阱高分辨質譜(ultra performance liquid chromatography-quadrupole-exactive-mass-spectrometry,UPLC-Q-Exactive-MS)研究了不同溫度下烤豬肉的代謝物差異以選擇指示肉類加熱終點溫度的標記物。其中UPLC-Q-Exactive-MS利用數據庫檢索方便,不需要使用標準物質定性就可采集全面的目標物信息,因此在食品非靶向篩查中應用十分廣泛[11]。然而,非靶向篩選技術的瓶頸是會產生大量過于復雜和難以管理的數據集,無法進行人工分析,因此需要化學計量學的幫助。趙萍等[12]采用液相色譜-質譜聯用非靶向代謝組學方法對冷藏大鯢肉進行研究,并利用偏最小二乘法判別分析(partial least squares-discriminant analysis, PLS-DA)模型篩選共得到125種差異代謝物,獲得了7種潛在的生物標志物。孫斌等[13]利用GC-MS研究了延邊黃牛臀肉與眼肉組織的代謝物,并用主成分分析(principal components analysis, PCA)、正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis, OPLS-DA)等統計方式對數據進行分析,揭示出油酸等差異代謝物作為風味化合物的前體物質。結合先進的儀器,化學計量學能夠增強研究者對復雜系統的理解,并可以從海量數據中提取有價值的信息。該方法已用于區域分析、類型分類和食品鑒定中[14-15]。

目前,UPLC-Q-Exactive-MS非靶向代謝組學技術多數應用在醫藥學研究中。在食品領域,其主要應用于食品中的非法添加、外源性添加劑篩查、農獸藥殘留及內源性代謝產物的變化[16-20],鮮少有研究追蹤食品在加工過程中產生的風險代謝組分。本研究以甘肅省甘南地區牛肉為研究對象,采用UPLC-Q-Exactive-MS技術,結合PCA、PLS-DA、OPLS-DA及層次聚類分析(hierarchical clustering analysis, HCA)等多元統計方法,挖掘了在不同高溫條件下烤制牛肉的化學差異,篩查其風險與標志組分的內在關聯規律,轉變被動過程追溯為主動識別,能夠快速精準地識別潛在風險以期為烤牛肉制品加工生產企業的生產條件進行一定意義上的指導。

1 材料與方法

1.1 試劑

乙腈、己烷、乙酸乙酯、乙酸銨,色譜純;氫氧化鈉、鹽酸,分析純。

1.2 儀器與設備

T25 d勻漿機、Vorex 3渦旋混合器,艾卡公司;SiO-6512均質離心機,本立科技公司;P300H超聲波清洗器,德國艾爾瑪公司;UNIVERSAL320R高速離心機,德國海蒂詩公司;mv5氮吹儀,北京萊伯泰科公司;ME403T千分之一電子天平,梅特勒-托利多公司;Simplicity uv超純水機,默克公司;含Compound Discoverer(CD)分析軟件Q-Exactive-MS四極桿軌道阱質譜、Ultimate 3000高效液相色譜系統,賽默飛世爾科技公司;Kinetex C18(2.1 mm×100 mm, 1.7 μm粒徑)色譜柱,美國Phenomenex公司;KWS2060LQ-D1N電烤箱,格蘭仕公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣本收集

從本地批發具有代表性的地理區域(甘南)的鮮瘦牛肉。進行市場調查,以避免與牛肉來源相關的潛在關鍵標記的差異。牛肉貯藏在-20 ℃條件下。

1.3.2 樣本制備

同一來源的牛肉,使用電烤箱在130、160、200、220 ℃下烘烤牛肉片[4 cm×4 cm×3 mm,(5±0.1) g],雙面各涂抹大豆油2 mL分別烘烤5 min,不添加鹽和香料。烤好的牛肉在室溫下冷卻,然后切成小塊后勻漿。分析前,將處理好的牛肉末置于-20 ℃保藏。

1.3.3 代謝物提取

樣品代謝物的提取參考文獻[10]并做修改。采用連續兩步法從烤牛肉中提取盡可能多不同理化性質的化合物。將勻漿后的烤牛肉放入50 mL的Eppendorf試管中,加入5 mL 1 mol/L NaOH和7 mL乙酸乙酯,將上清液在室溫下以6 000 r/min均質1 min,然后渦旋振蕩2 min后置于超聲波清洗器中提取30 min。隨后,將提取液在4 ℃、9 000 r/min離心10 min,收集上清液。在剩余的組織中加入10 mL 1 mol/L HCl和5 mL己烷,然后按如上步驟所述進行同樣的處理,并保留上清液。將兩步的上清液合并在40 ℃的氮氣流下蒸吹至近干,用1 mL乙腈溶解,在4 ℃下13 000 r/min離心10 min,上清液通過0.22 μm尼龍濾膜過濾,待測。

1.3.4 空白和質量控制(quality control,QC)樣品

混合所有樣品的等量上清液制備QC樣品。根據質控樣品的重疊總離子流圖(total ion flow diagram,TIC)評估數據的重復性和儀器的穩定性;用空白樣品的TIC圖測定儀器和色譜柱的清潔度。

1.3.5 色譜參數

使用Kinetex C18 (2.1 mm×100 mm, 1.7 μm粒徑)色譜柱;色譜柱溫度:40 ℃;進樣量為5 μL;流動相:10 mmol/L的乙酸銨溶液(A)、乙腈(B);流動相流速:0.3 mL/min;梯度洗脫程序:0～1 min(0～30% B),1～9 min(30%～65% B),9～10 min(65%～95% B),10～17 min(95%～95% B),17～19 min(95%～30% B),19～20 min(30～30% B)。

1.3.6 高分辨質譜參數

1.3.6.1 離子源參數

離子源:加熱電噴霧電離源;樣品質譜信號采集分別采用正負離子掃描模式;全掃描采集范圍:m/z100～1 000;分辨率:全掃描70 000FWHM、對窄范圍母離子碎裂17 500 FWHM;電噴霧電壓:+3.6 kV的HESI+和-3.6 kV的HESI-;加熱器溫度:320 ℃;毛細管溫度:350 ℃;鞘氣流速:40;輔助氣流速:10;離子傳輸透鏡電壓:55 V。

1.3.6.2 掃描參數

自動增益控制目標離子數:1e6,最大注入時間:100 ms。歸一化碰撞能量:40、50、60的階梯式碰撞能量。為了提高精密度和準確度,在分析前分別用正負標定溶液對儀器進行校準。

1.4 數據分析

原始數據使用Compound Discoverer軟件(3.3.1)進行峰檢測、保留時間對齊等預處理。在Excel 2010中將數據整理為二維矩陣形式,保留了包含m/z值、保留時間、分子式、峰面積等信息,導入SIMCA 14.1軟件(Umetrics, Sweden)進行統計分析。采用PCA初步觀察樣品根據烤制溫度不同各組分間存在差異的情況。采用PLS-DA進一步進行分類并評價模型有效率,進行置換檢驗。在Compound Discoverer軟件中進行熱圖聚類分析并根據P值和單變量分析差異倍數FC值(fold-change)過濾掉統計上不顯著的特征。將化合物的峰面積定義為變量,序號作為觀測ID,采用OPLS-DA對130 ℃和220 ℃下處理過的牛肉樣品進行分析,根據變量投影重要度(variable importance in projection, VIP)(VIP>1),將實驗圖譜、化學式等與mzCloud、ChemSpider等線上數據庫比對尋找樣品潛在的特征化合物。

采用Excel 2010和Origin(8 Pro)進行數據統計和繪圖。

2 結果與分析

2.1 QC和空白

基于正離子模式和負離子模式得到TIC圖,結果如圖1-a、圖1-b所示。圖中不同的顏色表示5個質控樣品重疊的總離子流圖。橫坐標表示保留時間,重疊峰表明代謝產物的提取和檢測具有良好的重復性和檢測系統的高穩定性[21]。分析空白樣品的正負離子TIC圖,如圖1-c、圖1-d所示,沒有檢測到明顯的峰,說明樣品中沒有殘留物質或交叉污染。

a-5個質控樣品正離子模式TIC圖;b-5個質控樣品負離子模式TIC圖;c-空白樣品正離子模式TIC圖;d-空白樣品負離子模式TIC圖圖1 總離子流圖Fig.1 Total ion flow diagram

2.2 基于溫度變化的牛肉代謝產物分析

2.2.1 PCA和聚類熱圖分析

本研究使用Compound Discoverer軟件從Q-Exactive-MS正離子模式和負離子模式的總離子色譜圖中共提取了7 068個化合物。

利用代謝組學方法對牛肉在高溫過程中的分子代謝物進行表征,可以更好地控制、評價和理解肉類的品質。本研究的目的是利用UPLC-Q-Exactive-MS非靶向代謝組學方法分析不同的高溫加工溫度對牛肉代謝的影響。如圖2所示,不同烤制溫度的樣品具有明顯的層次聚類。采用PCA方法對不同溫度下烘烤的牛肉樣品進行分析,由圖3-a和圖3-b可見,生成的PCA得分圖顯示出明顯的分離。

a-正離子模式聚類熱圖;b-負離子模式聚類熱圖圖2 不同溫度牛肉樣品間顯著性差異離子層次聚類分析Fig.2 Hierarchical clustering significant differentially metabolites among different varieties of samples of beef

a-正離子模式PCA得分圖;b-負離子模式PCA得分圖圖3 PCA得分散點圖Fig.3 Scatter plot of PCA

2.2.2 PLS-DA

使用SIMCA軟件進行PLS-DA,可以處理PCA無法忽略的組內誤差和隨機誤差[22],并對該模型參數R2和Q2進行200次置換檢驗,判別模型是否發生過度擬合。如圖4所示,各組是明顯分開的,說明各組的代謝物具有顯著性差異。同時,本次分析中正離子模式下自變量擬合指數(R2X)為0.699,因變量擬合指數(R2Y)為0.967,模型預測指數(Q2)為0.525,負離子模式下自變量擬合指數(R2X)為0.56,因變量擬合指數(R2Y)為0.998,模型預測指數(Q2)為0.807,表明當前PLS-DA模型穩定可靠,具有良好的預測性。經過200次置換檢驗,Q2點的藍色回歸線與縱軸相交于負坐標軸,所有左側的藍色Q2值都低于右側的原始點,說明模型不存在過擬合,模型驗證有效,認為該結果可用于牛肉樣品的溫度差異分析。

a-正離子模式PLS-DA得分散點圖;b-正離子模式200個排列模型驗證;c-負離子模式PLS-DA得分散點圖;d-負離子模式200個排列模型驗證圖4 PLS-DA得分散點圖和200個排列模型驗證Fig.4 Scatter plot of PLS-DA and 200 permutation test model validation plot

2.3 潛在的標志物

2.3.1 OPLS-DA

由于共檢測到7 068個化合物,因此有必要降低數據維數。首先應注意在高溫烤制過程中,代謝產物含量的增加或減少是否具有統計學意義。利用方差分析(analysis of variance,ANOVA)的P值和FC值對從原始數據中提取的化合物在Compound Discoverer軟件中進行過濾。以log2(FC)>1或<-1;P值<0.05篩選化合物構建OPLS-DA模型以便快速定位潛在標記物,共篩選出正離子模式下差異上調化合物16個,差異下調化合物2 669個;負離子模式下差異上調化合物4個,差異下調化合物22個。OPLS-DA是建立在通過驗證的PLS模型的基礎上尋找差異化學物質的有監督的分析方法[23]。如圖5所示,正負離子模式下130 ℃和220 ℃處理的烤牛肉代謝產物顯著分開。在本研究中,正離子模式下OPLS-DA模型數值為R2X為0.905,R2Y為1,Q2為0.999,負離子模式下,R2X為0.899,R2Y為1,Q2為0.99,R2Y和Q2的高值表明模型解釋Y的高變化和OPLS-DA模型的預測優勢。

a-正離子模式OPLS-DA得分圖;b-負離子模式OPLS-DA得分圖圖5 OPLS-DA得分散點圖Fig.5 Scatter plot of OPLS-DA

2.3.2 差異化合物的鑒定

利用OPLS-DA模型生成的VIP值來選擇差異性表達代謝物。在本研究中,VIP>1的化合物被定義為潛在候選差異標記物,在正離子模式下共篩選出1 447個化合物,負離子模式下篩選出14個化合物。然而,這些化合物是由Compound Discoverer軟件自動從原始文件中提取的,需要進一步的人工檢查,去除同位素、等價物、重復物并且需要一個可接受的峰形以確保這些化合物的真實性。更重要的是檢查這些化合物是否是在130～220 ℃的牛肉加工過程中影響牛肉品質的重要因素,最后在正離子模式下篩選出4個潛在標記物,用Compound Discoverer軟件對這4種物質進行了化學方程式假設?；瘜W結構的預測基于同位素模式和ChemSpider數據庫,在m/zCloud數據庫的幫助下,對理論碎片和檢測到的碎片進行了比較。經過這個過程后,化合物被確定。上述4個選定標志物的參數如表1所示。

表1 四個選定差異標記物的化合物信息Table 1 Components identified with significant differences from the four selected markers

2.3.3 差異化合物的相對含量分析

查閱文獻可知,在高溫熱加工過程中,雜環胺的形成與肌酸、肌酐等前體物質密不可分[24]。3-氨基-1,4-二甲基-5H-吡啶[4,3-b]吲哚(3-amino-1,4-dimethyl-5H-pyrido[4,3-b]indol, Trp-P-1)是γ-咔啉類熱裂解雜環胺,為2B級潛在致癌物,可通過180 ℃的加熱條件下在含氨基酸、肌酸、還原糖的混合體系下生成[25-26];2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑[4,5-b]吡啶(2-amino-1-methyl-phenylimidazo[4,3-b]pyridine, PhIP)為熱生成型雜環胺,由前體物葡萄糖、氨基酸、肌酸等物質在熱反應環境中最終反應生成[27-28]。因此有必要探究烤牛肉中肌酸和肌酐在不同烤制溫度下的相對含量變化規律,以進一步了解前體物質與雜環胺生成的關系。肌酸是一種非蛋白質性氨基酸,存在于脊椎動物體內為機體提供能量,肌酸酐是在熱處理過程中形成的,它是一種生理惰性的肌酸酐環化產物[29]。圖6結果表明,在牛肉烤制過程中,隨著加熱溫度升高,雜環胺的含量越來越高,轉化為肌酐的肌酸越多,且極性雜環胺相對含量高于非極性雜環胺。此外,氨基酸的相對含量變化并不顯著,差異化合物鑒定研究中未篩查到,原因可能與脂肪流失、水解有關[30]。在Compound Discoverer軟件中共人工篩查到賴氨酸、纈氨酸、脯氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、組氨酸、異亮氨酸、色氨酸等9種氨基酸,本研究不進行進一步分析。

a-Trp-P-1和PhIP的含量變化趨勢; b-肌酐和肌酸的含量變化趨勢圖6 130～220 ℃下牛肉選定標記物的含量變化趨勢Fig.6 Trend of selected marker abundance in beef treated with temperature from 130 ℃ to 220 ℃

3 結論與討論

本實驗采用了基于UPLC-Q-Exactive-MS的非靶向代謝組學方法結合化學計量學優秀的分析能力,為牛肉熱加工過程中標記物的選擇和探索產生的有毒物質變化規律提供了有效的方法。實驗結果表明,不同溫度熱加工下的牛肉樣品中化學成分存在明顯差異。PCA可以在得分圖中顯示不同的分離組,所建PLS-DA模型具有良好的預測能力。用P值和FC值來篩選具有統計學差異的化合物,根據OPLS-DA模型,結合Compound Discoverer等分析軟件、線上數據庫和相關文獻來選擇對分類有顯著貢獻的特征化合物,結果在正、負離子模式下分別找到1 447個和14個差異化學成分,最終篩選出了4個特征標記。熱裂解雜環胺通常在高于300 ℃的加工條件下熱解產生,而其中的Trp-P-1卻可在180 ℃的加熱條件下生成,本研究驗證了這一點。由于本研究樣本數量較多,顯然需要進一步的實證工作來驗證此標記的有效性,但是研究強調了方法提供標記的潛力,可用于有針對性的分析以確證有害物質含量的變化規律。

高分辨質譜與化學計量學相結合可以用來研究在食品加工、貯存和運輸過程中復雜體系的樣品分析和差異代謝物的鑒定。本研究的方法在很大程度上依賴于在線數據庫,并且高分辨質譜價格昂貴也是阻礙該方法廣泛應用的重要原因。