一株降解生物胺乳酸菌用于葡萄酒蘋果酸乳酸發酵的特性研究

潘思弋,徐佳敏,張惠玲,楊偉明,田曉菊*

1(寧夏大學 食品科學與工程學院,寧夏食品微生物應用技術與安全控制重點實驗室,寧夏 銀川,750021) 2(寧夏食品檢測研究院國家市場監管重點實驗室(枸杞及葡萄酒質量安全),寧夏 銀川,750001) 3(寧夏塞尚乳業有限公司,寧夏 銀川,750021)4(寧夏志輝源石葡萄酒莊有限公司,寧夏 銀川,750021)

生物胺(biogenic amines),是一類具有非揮發性的含氮低分子生物活性物質[1],前體化合物在氨基酸脫羧酶的作用下進行脫羧反應以及通過酮和醛的還原胺化而生成[2]。REDRUELLO等[3]研究發現在人體中,適量的生物胺可作為激素或神經遞質起著重要的生理作用。相反,在其過量的情況下會導致心臟、神經系統等產生不同程度的毒理學損傷。研究表明,一定濃度的酒精(<10%vol)可以提高氨基酸脫羧酶的活性,但酒精又會抑制胺類氧化酶的活性從而導致生物胺過度積累,所以對葡萄酒類產品中生物胺的限量標準理應比普通食品更加嚴格[4]。因此,控制葡萄酒中生物胺含量是非常必要的。

葡萄酒中的生物胺主要來自葡萄果實和釀造過程。葡萄果實中生物胺的種類和含量受氣候、品種及成熟度等因素的影響[5]。在葡萄酒釀造過程中,酒精發酵(alcohol fermentation,AF)和蘋果酸-乳酸發酵(malolactic fermentation,MLF)均會導致腐胺、酪胺、尸胺等生物胺的形成[6]。在酒精發酵階段釀酒酵母的代謝會生成少量的生物胺,而MLF階段乳酸菌的代謝是葡萄酒中生物胺形成的主要原因[7]。HAN等[8]對葡萄酒全部發酵階段中產生的生物胺含量進行了測定,發現葡萄酒從開始發酵到酒精發酵結束后尸胺、組胺、酪胺幾乎檢測不到,但在MLF階段這幾種生物胺的含量均明顯增加。生物胺在葡萄酒中一經產生就無法將其徹底消除,甚至在高溫條件下也無法將其完全破壞。因此,篩選優良的MLF啟動菌株是減少葡萄酒中生物胺含量的有效方法,通過接種無氨基酸脫羧酶活性的乳酸菌,可以控制自然菌的生長或降解由自然菌產生的生物胺[9]。故選用合適的釀酒乳酸菌可以降低葡萄酒中生物胺的含量,對葡萄酒的品質保證具有重要意義。

本文將實驗室前期篩選得到的一株LactobacillusplantarumNXU-Q12[10]應用于葡萄酒的MLF,測定蘋果酸降解能力以及是否降解酒石酸、檸檬酸、甘油,以評價該菌株的MLF特性;測定葡萄酒MLF前后該菌株的菌落數變化評價該菌株在葡萄酒中的適應性;分別采用高效液相色譜法、頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用(head space-solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometer,HS-SPME-GC-MS)和電子鼻測定葡萄酒中該菌株的生物胺降解率及經該菌株MLF后葡萄酒中的香氣成分,評估L.plantarumNXU-Q12的應用價值,為乳酸菌在葡萄酒MLF過程中的應用提供理論依據,并為葡萄酒的質量安全控制提供解決途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

本課題組分離鑒定的降解生物胺乳酸菌L.plantarumNXU-Q12(CGMCC No.23704)。

L.plantarumNXU-Q12的酸耐受性和乙醇耐受性已做過試驗,詳見徐佳敏等[10]的論文。

1.1.2 原料

赤霞珠葡萄,2021年10月于寧夏賀蘭山產區志輝源石葡萄酒莊采摘,糖含量(以葡萄糖計)為(216.41±8.23) g/L,總酸含量(以酒石酸計)為(4.3±0.20) g/L,pH值為3.89±0.01,總質量約為5 kg。

馬瑟蘭葡萄,2021年10月于寧夏賀蘭山產區志輝源石葡萄酒莊采摘,糖含量(以葡萄糖計)為(185.4±4.75) g/L,總酸含量(以酒石酸計)為(5.12±0.82) g/L,pH值為3.62±0.02,總質量約為5 kg。

1.1.3 試劑

NaOH、Na2CO3、NH3·H2O、CH3COCH3(均為分析純),天津大茂化學試劑廠;生物胺(色胺、組胺、腐胺等)、丹磺酰氯,美國Sigma公司;商業酵母菌XR、商業乳酸菌Oenococcusoeni,法國諾盟公司;L-蘋果酸試劑盒、甘油試劑盒,西班牙BioSystems公司。

1.1.4 培養基

MRS培養基(g/L):蛋白胨10,牛肉浸膏8,酵母浸粉4,葡萄糖20,磷酸氫二鉀2,MgSO4·7H2O 0.2,CH3COONa 5,(NH4)2HC6H5O72,Tween 80 1,MnSO4·H2O 0.04,pH值調至5.5。

蘋果酸降解培養基(g/L):蘋果酸3,硫酸錳0.05,半胱氨酸鹽0.5,酵母浸粉5,蛋白胨5,MgSO4·7H2O 0.2。

模擬葡萄酒環境培養基(g/L)[11]:無水乙醇100 mL,葡萄汁2,酒石酸3,檸檬酸0.5,葡萄糖2,果糖2,甘油5,乙酸鈉0.28,硫酸鎂0.13,硫酸錳0.03,FeSO4·7H2O 0.04,氯化鈣0.1,磷酸氫鉀0.6,硫酸銨1。110 ℃滅菌10 min,待該培養基溫度降至室溫時添加無水乙醇。

1.2 儀器與設備

W-CJ-2FD超凈工作臺,蘇州安泰空氣技術有限公司;YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌器、BSD-150生化培養箱,上海博訊實業有限公司;Y15葡萄酒全自動分析儀,Biosystems公司;8860-5977B頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用儀、1260高效液相色譜,美國Agilent公司;PEN 3.0電子鼻,德國Airsense公司。

1.3 試驗方法

1.3.1L.plantarumNXU-Q12生長特性及生物胺降解能力的測定

1.3.1.1L.plantarumNXU-Q12分解酒石酸、檸檬酸、甘油和蘋果酸的測定

將L.plantarumNXU-Q12于37 ℃下活化培養48 h,初始菌濃度調整為1×107CFU/mL,接種于蘋果酸降解培養基中25 ℃培養48 h。48 h后將培養液于4 ℃,8 000 r/min離心5 min,取上清液,參照楊江威[12]的方法測定酒石酸、檸檬酸含量,采用甘油試劑盒測定甘油含量;采用蘋果酸試劑盒測定蘋果酸的含量。

1.3.1.2L.plantarumNXU-Q12 SO2耐受性及其降解生物胺能力的測定

將L.plantarumNXU-Q12于含有精胺、色胺、腐胺、尸胺、酪胺、組胺(質量濃度均為1 mg/mL)的MRS液體培養基中活化,以2%接種量分別接種至SO2含量為20、40、60、80 mg/L的上述MRS液體培養基中,37 ℃靜置培養48 h,在600 nm波長下測定OD值,判斷SO2對L.plantarumNXU-Q12生長的影響。

采用高效液相法,參照徐佳敏等[10]的方法測定生物胺的含量并計算生物胺降解率。

1.3.1.3L.plantarumNXU-Q12溫度耐受性及降解生物胺能力的測定

將L.plantarumNXU-Q12于MRS液體培養基中活化,以2%接種量接種至含精胺、色胺、腐胺、尸胺、酪胺、組胺(質量濃度均為1 mg/mL)的MRS液體培養基中,分別于18、22、26、30 ℃條件下靜置培養48 h,在600 nm波長下測定OD值,判斷溫度對L.plantarumNXU-Q12生長的影響。5 500 r/min離心10 min,取上清液過0.22 μm微孔濾膜過濾,生物胺降解率的測定參照1.3.1.2節。

1.3.2L.plantarumNXU-Q12在葡萄酒釀造中的應用

1.3.2.1 種子液的制備

將L.plantarumNXU-Q12于MRS液體培養基中37 ℃活化24 h,測定菌濃度達到1×107CFU/mL,作為種子液。

1.3.2.2 干紅葡萄酒的釀造工藝及操作要點

釀造工藝如下:

葡萄→除梗、破碎→低溫浸漬→酒精發酵→MLF→發酵結束→過濾→葡萄酒→品質分析

操作要點:

a)除梗破碎:原料(赤霞珠、馬瑟蘭)采摘后,進行輕度破碎,均勻添加20 mg/L果膠酶、40 mg/L SO2。

b)低溫浸漬:低溫4 ℃浸漬24 h[13],利用固體二氧化碳來降溫,控制低溫浸漬條件。

c)酒精發酵:原料(赤霞珠、馬瑟蘭)入罐后以0.2 g/L比例接入活化好的商業酵母XR,啟動酒精發酵,發酵溫度控制在25～28 ℃,測定殘糖量小于4 g/L時結束酒精發酵,進行皮渣分離。

d)MLF:將酒精發酵結束后的赤霞珠、馬瑟蘭葡萄酒樣經0.45 μm微孔濾膜過濾除菌。以未接種乳酸菌的赤霞珠和馬瑟蘭葡萄酒樣作為空白對照(分別記作C0、M0),以1×107CFU/mLL.plantarumNXU-Q12種子液按2%添加量[14]分別接種于赤霞珠和馬瑟蘭酒樣中(分別記作C12、M12),同時商業乳酸菌O.oeni按照使用要求(0.01 g/L)進行活化,活化后分別接種于相同量的赤霞珠和馬瑟蘭葡萄酒樣中作為對照(分別記作CS、MS)。MLF溫度控制在18～20 ℃,在發酵完成后添加40 mg/L SO2,終止MLF。

1.3.2.3 葡萄酒MLF理化指標的測定

參照魯榕榕等[15]的方法測定MLF發酵液中不同時間段的乳酸菌菌落數;參照GB 5009.225—2016測定葡萄酒酒精度;參照GB/T 15038—2006測定葡萄酒總酸、還原糖、甘油等理化指標。

1.3.2.4 葡萄酒MLF前后生物胺含量的測定

葡萄酒MLF前后生物胺含量的測定參照1.3.1.2節。

1.3.2.5 葡萄酒中揮發性化合物的測定

參考祝霞等[16]的方法,使用HS-SPME-GC-MS對不同試驗處理的酒樣香氣成分進行檢測。各成分的含量采用內標法進行半定量分析。

1.3.2.6 電子鼻的測定

參考周桂珍[17]的方法,使用電子鼻技術對不同處理的酒樣進行檢測。

1.4 數據分析

每組試驗設置3個重復;采用Excel 2013軟件、SPSS Statistic 27.0軟件,對試驗數據進行處理;采用Origin 2021軟件、R統計軟件分別進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 L.plantarum NXU-Q12對甘油、酒石酸、檸檬酸和蘋果酸的分解

L.plantarumNXU-Q12對酒石酸、檸檬酸、甘油和蘋果酸的分解結果如表1所示。

表1 L.plantarum NXU-Q12對酒石酸、檸檬酸、 甘油和蘋果酸的分解效果Table 1 Results of tartrate, citric acid, glycerol, and malic acid decomposition by L.plantarum NXU-Q12

由表1可知,菌株L.plantarumNXU-Q12對酒石酸、檸檬酸和甘油的分解率分別為0.201%、0.649%、0.599%,對酒石酸、檸檬酸、甘油均無明顯的分解效果;菌株L.plantarumNXU-Q12對蘋果酸分解率為87.33%。綜上所述,菌株L.plantarumNXU-Q12具有較好的蘋果酸分解能力,適合葡萄酒的MLF。

2.2 L.plantarum NXU-Q12 SO2耐受性及其降解生物胺的能力

L.plantarumNXU-Q12在SO2含量分別為20、40、60、80 mg/L條件下的生長狀態如圖1-A所示,生物胺降解率如圖1-B所示。

由圖1-A可知,該菌株在SO2質量濃度為40～80 mg/L時可以生長,說明該菌株對SO2具有一定的耐受性;但隨著SO2濃度的升高,菌株L.plantarumNXU-Q12的生長狀態整體呈下降趨勢。

由圖1-B可知,隨著發酵液中SO2濃度的增加,菌株降解生物胺的能力減弱,當SO2質量濃度為80 mg/L時,L.plantarumNXU-Q12對生物胺的降解率達到最低值,主要原因是乳酸菌對SO2較敏感,并且SO2作為抗氧化劑會影響微生物中蛋白質與維生素的共價結合,從而抑制乳酸菌的生長活性[18],使生物胺氧化酶含量減少,導致生物胺降解率下降。

A-生長狀態;B-生物胺降解率圖1 不同SO2濃度下對L.plantarum NXU-Q12生長 及生物胺降解的影響Fig.1 Effects of L.plantarum NXU-Q12 growth and bioamine degradation rates at various SO2concentrations

2.3 L.plantarum NXU-Q12溫度耐受性及其降解生物胺的能力

L.plantarumNXU-Q12在溫度為18、22、26、30 ℃條件下的生長狀態如圖2-A所示,生物胺降解率如圖2-B所示。

不同溫度條件對乳酸菌的生長會產生影響,隨著溫度的上升,菌株生長狀態呈上升的趨勢。由圖2-A可知,該菌株在26～30 ℃生長狀態良好,當溫度低于22 ℃時,該菌株的生長狀態明顯受到抑制。

由圖2-B可知,隨著溫度的升高,該菌株的生物胺降解能力呈上升趨勢。在26 ℃時,該菌株對組胺、酪胺的降解率明顯升高;在30 ℃時,該菌株除色胺外其他4種生物胺降解率均大于25%。有研究表明,當菌株處于低溫環境時,菌株細胞膜會發生明顯的硬化現象,并且溫度越低其硬化現象越明顯,此外生物胺氧化酶的活性會降低[19],從而導致菌株的存活率降低。因此,菌株對生物胺的降解能力在低溫條件下減弱,但在18 ℃的葡萄酒MLF溫度,該菌株仍具有一定的生物胺降解能力。

A-生長狀態;B-生物胺降解率圖2 不同溫度對L.plantarum NXU-Q12生長 及生物胺降解的影響Fig.2 Effects of L.plantarum NXU-Q12 growth and bioamine degradation rates at different temperature

2.4 葡萄酒MLF發酵基本理化指標

赤霞珠葡萄酒和馬瑟蘭葡萄酒酒樣MLF前后酒精度、總酸、還原糖、pH、揮發酸、甘油含量的變化如表2所示。

表2 葡萄酒MLF前后基本理化指標Table 2 The physicochemical indexes of wine sample before and after MLF

由表2可知,與未進行MLF的兩種葡萄酒酒樣相比,總酸含量均有所下降,且pH值隨著總酸含量的降低而增大,其中經商業乳酸菌O.oeni發酵的兩種酒樣總酸含量均為最低值,而L.plantarumNXU-Q12與商業乳酸菌O.oeni相比,發酵后的酒樣中總酸含量差異并不明顯,說明L.plantarumNXU-Q12與商業乳酸菌O.oeni具有相當的MLF能力;MLF后的酒樣與未發酵酒樣中酒精度和殘糖含量變化不明顯,還原糖含量降低的原因之一是乳酸菌在發酵過程中為維持自身能量代謝會消耗一部分的還原糖[20];葡萄酒中揮發酸是評價其品質的指標,各個酒樣在MLF后均有所上升,但含量均低于國家標準(1.20 g/L)。

2.5 葡萄酒MLF前后生物胺含量的變化

赤霞珠和馬瑟蘭葡萄酒兩種酒樣中MLF前后生物胺含量的測定結果如表3所示。

表3 葡萄酒MLF發酵前后生物胺含量變化 單位:mg/L

由表3可知,菌株L.plantarumNXU-Q12發酵后的赤霞珠、馬瑟蘭酒樣中總生物胺含量與發酵前相比,分別降低了49.81%和65.22%;與商業乳酸菌O.oeni發酵的酒樣相比,菌株L.plantarumNXU-Q12發酵的赤霞珠、馬瑟蘭酒樣中總生物胺含量分別降低了31.07%和41.51%,說明菌株L.plantarumNXU-Q12具有一定的降解生物胺能力。

2.6 葡萄酒MLF過程中乳酸菌菌落數和L-蘋果酸含量的變化

將L.plantarumNXU-Q12和商業乳酸菌O.oeni分別接入酒精發酵結束的赤霞珠和馬瑟蘭酒樣中,對MLF過程中活菌數進行檢測,結果如圖3-A所示;對MLF過程中L-蘋果酸含量的變化進行檢測,結果如圖3-B所示。

由圖3-A可知,菌株L.plantarumNXU-Q12在兩種酒樣中生長趨勢均為先下降后上升再緩慢下降;而商業乳酸菌O.oeni在兩種酒樣中生長趨勢為先下降再上升。在MLF初期,L.plantarumNXU-Q12和商業乳酸菌O.oeni在不同葡萄酒酒樣中菌落數均急速下降,其原因是菌株在發酵初期未適應葡萄酒的環境,導致其生長受到明顯的抑制,當菌株逐漸適應這種環境后,菌落數逐漸上升[21],說明菌株L.plantarumNXU-Q12與商業乳酸菌一樣可以適應葡萄酒的環境并進行MLF。

由圖3-B可知,在MLF階段葡萄酒中L-蘋果酸的含量隨著發酵時間的延長而下降,L.plantarumNXU-Q12和商業乳酸菌O.oeni均在第32天時蘋果酸含量降到最低,這兩株菌發酵的赤霞珠和馬瑟蘭葡萄酒樣中蘋果酸含量下降呈相似的趨勢。在赤霞珠葡萄酒中,經L.plantarumNXU-Q12 MLF后L-蘋果酸含量從2.02 g/L降至0.05 g/L,而經商業乳酸菌O.oeni后L-蘋果酸含量從2.02 g/L降至0.10 g/L;在馬瑟蘭葡萄酒中,L.plantarumNXU-Q12完成MLF后L-蘋果酸含量從1.96 g/L降至0.02 g/L,商業乳酸菌O.oeni完成MLF發酵后L-蘋果酸含量從1.96 g/L 降至0.04 g/L,說明在赤霞珠和馬瑟蘭葡萄酒中L.plantarumNXU-Q12對L-蘋果酸的代謝都更徹底。綜上所述,菌株L.plantarumNXU-Q12具有良好的MLF性能。

A-活菌數;B-L-蘋果酸含量圖3 葡萄酒MLF過程中乳酸菌菌落數和蘋果酸變化Fig.3 Quantity changes in lactic acid bacteria colonies and malic acid during MLF in wine

2.7 葡萄酒風味物質分析

經HS-SPME-GC-MS檢測,分析不同酒樣中風味物質,詳見附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.035007)。

赤霞珠和馬瑟蘭兩種葡萄酒樣在沒有經過MLF之前,共檢測出風味物質分別為40種和46種,在經過MLF后,風味物質的種類及含量均有所增加,其中酯類、醇類和酸類為葡萄酒中主要的香氣物質,尤其以酯類(辛酸乙酯和癸酸乙酯)和羥基類(仲辛酮、大馬士酮)物質含量增加為主要特征,這兩類化合物含量的增加賦予了葡萄酒水果方面的香氣[22]。MLF結束后4種發酵酒樣(C12、CS、M12、MS)中分別檢測到45、43、50、50種風味物質,其中包含酯類18種,醇類16種,羰基類物質4種,酸類物質5種,萜烯類4種,其他物質3種。與商業菌株對比,L.plantarumNXU-Q12在赤霞珠葡萄酒樣中檢測出的揮發性香氣物質的種類和含量均有所增加,其中酯類物質含量顯著增加。

2.8 葡萄酒揮發性成分聚類分析及組成比較

利用R軟件對3種不同發酵處理(未進行MLF,分別接種商業乳酸菌O.oeni和L.plantarumNXU-Q12進行MLF)的赤霞珠和馬瑟蘭葡萄酒樣中香氣物質進行熱圖聚類分析,探究不同發酵處理下赤霞珠葡萄酒和馬瑟蘭葡萄酒中主要香氣物質間差異,比較結果如圖4所示。

圖4 菌株L.plantarum NXU-Q12與商業乳酸菌MLF 前后葡萄酒風味物質聚類熱圖Fig.4 Heat map of L.plantarum NXU-Q12 clustering of wine-flavor substances before and after MLF with commercial lactic acid bacteria

由圖4可知,不同顏色表示每種風味物質的含量,紅色越深則表明該物質含量越高,藍色越深表明該物質含量越低;52種香氣成分聚為4類:第1類香氣成分含量在M0、M12、MS發酵的酒樣中含量較高,包括正己醇、2-庚醇、3-羥基丁醛等13種物質;第2類香氣成分在M12、MS、C12發酵的酒樣中含量較高,包括癸酸乙酯、仲辛酮、癸酸乙酯等11種物質;第3類香氣成分在C12、CS、C0發酵的酒樣中含量較高,包括2,4-二叔丁基苯酚、異戊醇、乙酸異戊酯等17種物質;第4類香氣成分在M0、MS、CS發酵的酒樣中含量較高,包括1-壬醇、α-松油醇、反式-3-己烯-1-醇等11種物質。綜上所述,說明MLF對葡萄酒的風味物質有顯著影響;與O.oeni相比,菌株L.plantarumNXU-Q12發酵后葡萄酒部分風味物質含量更高。因此,菌株L.plantarumNXU-Q12具有良好的MLF能力。

2.9 電子鼻雷達圖分析

經電子鼻檢測和分析不同酒樣中揮發性成分進行雷達圖分析,結果如圖5所示。

圖5 不同葡萄酒樣的電子鼻雷達圖Fig.5 Electronic nasal radar of different wine samples

由圖5可知,電子鼻每個傳感器對葡萄酒樣均有明顯的響應,且響應值均不相同,其中W1S、W1C、W1W和W5S、W2S傳感器的響應值顯著高于其他傳感器,說明酒樣中含有較多的甲基類化合物、苯類、無機硫化物、氮氧化合物、醇類,而W3C、W6S、W5C、W2W、W3S傳感器基本無明顯變化,說明酒樣中芳香胺類、氫化物、短鏈烷烴、有機硫化物、長鏈烷烴含量較少,這與HS-SPME-GC-MS結果中不存在芳香胺化物和烷烴類化合物相符。酒樣M0、C0在W1S、W5S、W1W 3個傳感器響應值低于其他酒樣,說明酒樣M0、C0中甲基類化合物、無機硫化物、氮氧化合物含量較低。從傳感器信號強度的不同可以初步判斷L.plantarumNXU-Q12和商業乳酸菌O.oeni分別在赤霞珠、馬瑟蘭葡萄酒樣品之間的氣味物質差別不明顯,只是響應值大小不同。因此,菌株L.plantarumNXU-Q12適合葡萄酒的MLF。

3 結論

將降解生物胺的L.plantarumNXU-Q12作為發酵劑進行MLF,獲得的赤霞珠葡萄酒和馬瑟蘭葡萄酒兩種酒樣中各項理化指標均符合GB 15037—2006《葡萄酒》;經L.plantarumNXU-Q12 MLF發酵的兩種酒樣中L-蘋果酸含量均可以降至0.1 g/L以下,說明菌株L.plantarumNXU-Q12具有良好的MLF能力。同時,經L.plantarumNXU-Q12發酵的赤霞珠、馬瑟蘭葡萄酒樣中總生物胺含量比商業乳酸菌O.oeni發酵的酒樣中生物胺含量分別降低了31.07%和41.51%,說明該菌株在葡萄酒MLF過程中對生物胺降解具有降解能力。菌株L.plantarumNXU-Q12使兩種葡萄酒樣中辛酸乙酯、月桂酸乙酯、芳樟醇含量增加。在赤霞珠酒樣中,經菌株L.plantarumNXU-Q12發酵產生的酯類物質種類增多。因此,L.plantarumNXU-Q12不僅可以有效控制葡萄酒中生物胺含量,同時具有良好的葡萄酒MLF潛力,為L.plantarumNXU-Q12在葡萄酒MLF過程中的應用及安全控制奠定了理論基礎。