用于干預(yù)潰瘍性結(jié)腸炎的異甘草素納米顆粒研究

張琳婧,錢楠,俞步濤,陳昱瑤,馬家輝,張晨曦,王偉,成向榮*

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無錫,214122)2(蘇州市食品檢驗(yàn)檢測中心,江蘇 蘇州,215000)

異甘草素(isoliquiritigenin, ISO)是一種來源于甘草、具有查爾酮結(jié)構(gòu)的膳食功能因子,被證明在抗腫瘤、增強(qiáng)免疫、減輕炎癥等方面具有藥理作用[1-2]。研究表明,ISO能夠通過抑制MAPK途徑改善葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium, DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎[3],對腫瘤壞死因子造成的刺激有回調(diào)作用,上調(diào)結(jié)腸抗炎介質(zhì)PPARg蛋白的表達(dá)[4],在腸道炎癥性疾病的治療過程中表現(xiàn)出低毒性和有效的干預(yù)作用,具有治療腸道黏膜炎癥的開發(fā)潛力。潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種慢性且非特異性的腸道疾病,主要影響結(jié)腸黏膜和黏膜下層,炎癥反應(yīng)會增加并導(dǎo)致嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞浸潤,病程長且易反復(fù)發(fā)作,現(xiàn)有藥物的治療多伴隨不同程度的副作用[5],因此,使用低毒高效的膳食功能因子干預(yù)手段成為迫切的需求。但I(xiàn)SO在水中的溶解能力較差,生物利用度低,限制了此類膳食功能因子營養(yǎng)制劑的臨床開發(fā)利用[6]。

目前對異甘草素制劑的遞送系統(tǒng)開發(fā)主要集中在脂質(zhì)體、微乳、納米顆粒等復(fù)合物,其中納米顆粒可以提供更強(qiáng)的藥物負(fù)載能力,改善難溶藥物的溶解度,提高生物可及性,從而達(dá)到更好的靶向治療效果[7-8]。馬啟珍等[9]使用卵磷脂作為穩(wěn)定劑制備納米結(jié)晶,提高了異甘草素的體外釋放速度,但并未考慮包埋效率與消化過程中的遞送行為,應(yīng)用潛力低。劉勇華等[7]選用沉淀-高壓均質(zhì)法制備納米混懸劑,穩(wěn)定性高,但依賴表面活性劑提高穩(wěn)定性,影響藥劑的分散能力。謝育嬌[6]使用三嵌段聚合物復(fù)配制備高穩(wěn)定性的異甘草素混合膠束,但制備過程引入了有機(jī)試劑,制備成本高。因此,需要開發(fā)一種制備方法簡單、天然低毒的納米顆粒遞送系統(tǒng),提高ISO在體內(nèi)的吸收利用能力。研究表明,玉米醇溶蛋白(zein)的兩親性使其具有較高的自組裝能力,具備有效包裹小分子生物活性物質(zhì)的能力,但其消化穩(wěn)定性差,導(dǎo)致生物可及性低,給藥效率受到限制。多糖與zein納米顆粒之間的靜電相互作用會影響溶液中納米顆粒的聚集狀態(tài),從而改變暴露表面積,能夠提高zein納米顆粒的消化穩(wěn)定性,增強(qiáng)天然產(chǎn)物的封裝效率[10]。果膠作為一種廣泛應(yīng)用在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的多糖,在酸性條件下的穩(wěn)定性能保護(hù)果膠到達(dá)下消化道后被利用,是構(gòu)建口服藥物納米顆粒的重要原料[11]。

本研究采用反溶劑沉淀法制備負(fù)載異甘草素的zein-果膠復(fù)合納米顆粒,以納米顆粒分散體穩(wěn)定性對相關(guān)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,探索納米顆粒的基本理化性質(zhì),并通過比較體外模擬消化水平及對潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)小鼠的干預(yù)效果評價(jià)zein-ISO納米顆粒改善作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

果膠,蘇州賽邁爾生物科技有限公司;玉米醇溶蛋白、胰蛋白酶、胃蛋白酶、膽鹽,上海源葉生物科技有限公司;異甘草素、葡聚糖硫酸鈉(相對分子量為40 000),上海麥克林生化科技股份有限公司;甲醇(色譜純)、其他試劑(分析純),國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

8周齡C57BL/6 J小鼠(雄性),體重18～20 g,江蘇華創(chuàng)信諾醫(yī)藥科技有限公司,動物生產(chǎn)許可證號[SCXK(蘇)2020—0009]。所有動物實(shí)驗(yàn)均得到中國無錫江南大學(xué)動物倫理委員會的批準(zhǔn)(倫理審核編號:JN.No20221215c0560110[533])。飼養(yǎng)于江南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心[許可證號:SYXK(蘇)2021—0056],溫度(20～24 ℃)、濕度(40%～70%)、人工光照-黑暗12 h循環(huán)。

1.2 儀器與設(shè)備

磁力攪拌器,德國IKA公司;真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海申順生物科技有限公司;真空冷凍干燥機(jī),寧波新芝生物科技股份有限公司;Zetasizer nano ZS型納米粒度及Zeta電位儀,英國Malvern公司;D2 PHASER型X-射線衍射儀,德國布魯克AXS公司;SU 8100型場發(fā)射掃描電子顯微鏡,日本日立公司;IS10型傅立葉紅外光譜儀,美國Nicolet公司;高效液相色譜,日本島津公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 納米顆粒制備

稱取一定量的玉米醇溶蛋白溶于一定濃度的乙醇溶液中,加入ISO,磁力攪拌30 min充分溶解,形成zein-ISO溶液。將制備好的溶液用注射器快速注入pH為4的水中,在900 r/min轉(zhuǎn)速下,磁力攪拌5 min。利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除溶液中的乙醇,旋蒸結(jié)束后,添加pH為4的水補(bǔ)充乙醇的損失。將果膠溶于70 ℃的熱水中,用1 mol/L的HCl將果膠溶液的pH調(diào)至4,果膠的最終質(zhì)量濃度為1 g/L。最后將納米顆粒分散液倒入果膠溶液中,磁力攪拌30 min后4 000 r/min離心10 min,倒出上清液,即可獲得負(fù)載ISO的zein-果膠納米顆粒[12]。

1.3.2 制備方法的優(yōu)化

以納米顆粒粒徑、電位以及分散指數(shù)(polydispersity index,PDI)為主要指標(biāo),考察不同因素對納米顆粒分散體穩(wěn)定性的影響。

1.3.2.1 zein質(zhì)量濃度對納米顆粒的影響

取zein分別溶于10 mL 體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液中,制得10、20、30、40、50 g/L的zein溶液,隨后按照zein∶ISO=10∶1的質(zhì)量比加入ISO,后續(xù)操作參考1.3.1節(jié)。

1.3.2.2 乙醇濃度對納米顆粒的影響

配制體積分?jǐn)?shù)分別為70%、75%、80%、85%、90%的乙醇溶液后移取相同體積溶解100 mg玉米醇溶蛋白,制備質(zhì)量濃度為10 g/L的zein溶液,隨后按照zein∶ISO=10∶1的質(zhì)量比加入ISO,后續(xù)操作參考1.3.1節(jié)。

1.3.2.3 ISO添加量對納米顆粒的影響

取100 mg zein溶解于10 mL 體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液中,分別加入不同質(zhì)量的ISO(4、6、8、10、12 mg),后續(xù)操作參考1.3.1節(jié)。

1.3.2.4 zein與果膠質(zhì)量比對納米顆粒的影響

取100 mg zein溶解于10 mL 體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液中,隨后按照zein∶ISO=10∶1的質(zhì)量比加入ISO,室溫下磁力攪拌5 min,取上述溶液各5 mL快速注入20 mL,pH=4的水中,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),再按照zein-ISO溶液∶果膠溶液=10∶1、5∶1、2∶1、1∶1、1∶2的體積比將納米溶液倒入果膠溶液中,磁力攪拌30 min后4 000 r/min離心10 min,倒出上清液。

1.3.3 納米顆粒的理化性質(zhì)表征

利用納米粒度及Zeta電位儀測定納米顆粒的粒徑、PDI及電位。用pH=4的水稀釋相應(yīng)的納米體系,取1 mL樣品放入樣品池進(jìn)行檢測。參數(shù)設(shè)置:平衡時(shí)間為30 s,溫度為25 ℃。

利用掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM)觀察納米顆粒的微觀結(jié)構(gòu)。取3 μL納米顆粒分散液滴加硅片上,隨后放置于干燥器中,室溫下自然干燥,將硅片用導(dǎo)電膠固定在樣品盤上,使用SEM在3.0 kV加速電壓下選擇合適的倍數(shù)進(jìn)行觀察并拍照。

利用X-射線衍射(X-ray diffraction,XRD)評價(jià)納米顆粒結(jié)構(gòu)。取適量凍干粉末放置于硅片上,放入衍射儀中進(jìn)行測定。儀器參數(shù)設(shè)置:掃描角度為5°～50°,掃描步長為0.05°,掃描時(shí)間0.5 s。

通過傅立葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)對凍干后的樣品進(jìn)行紅外曲線測定。儀器參數(shù)設(shè)置:掃描波長范圍為650～4 000 cm-1,掃描次數(shù)為32次,分辨率為4 cm-1。

1.3.4 包埋率和裝載率的測定

參照郭遠(yuǎn)治[13]、YANG等[14]的方法測定包埋率和裝載率。將制備完成的zein-ISO離心30 min后,用甲醇稀釋上清液,在ISO的最大吸收波長下通過紫外-分光光度法測定吸光度。ISO在372 nm處有吸收峰,與謝育嬌[6]的研究結(jié)果相同。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇372 nm作為ISO紫外分光光度法的檢測波長。根據(jù)甲醇中分別溶解ISO的標(biāo)準(zhǔn)曲線對ISO的含量進(jìn)行測定。包埋率和裝載率分別以公式(1)和公式(2)計(jì)算:

(1)

(2)

1.3.5 納米顆粒的體外模擬消化

根據(jù)YANG等[14]的方法稍作修改進(jìn)行體外胃腸模擬消化。將ISO與等量zein-ISO(以ISO計(jì))納米顆粒分別分散在30 mL的蒸餾水中并按照1∶1的體積比與30 mL模擬胃液(主要成分為胃蛋白酶3.2 mg/mL和NaCl 2 mg/mL)進(jìn)行混合。用1 mol/L的HCl將溶液pH調(diào)至1.2后,放置于37 ℃恒溫水浴消化120 min,分別在30、60、90、120 min時(shí)收集1 mL 樣品并以1 mL模擬胃液補(bǔ)齊,高速離心取上清測定ISO濃度。用1 mol/L NaOH溶液將pH調(diào)至7.5以終止胃消化。之后繼續(xù)加入60 mL模擬腸液(主要成分為K2HPO46.8 mg/mL,胰蛋白酶2 mg/mL,膽鹽 10 mg/mL和NaCl 8.8 mg/mL)混合,最終溶液pH控制在7.5左右,接著消化2 h,分別在150、180、210、240、300、360 min時(shí)收集1 mL樣品并以1 mL模擬腸液補(bǔ)齊,高速離心后取上清測定ISO濃度,具體方法見1.3.4節(jié)。對每個(gè)取樣點(diǎn)的游離ISO濃度進(jìn)行測定后,以公式(3)計(jì)算胃腸模擬消化過程中ISO的釋放率:

(3)

1.3.6 動物實(shí)驗(yàn)

1.3.6.1 動物分組與給藥

動物實(shí)驗(yàn)共14 d。第1～7天,預(yù)適應(yīng)飼養(yǎng),使用普通飼料與普通飲用水喂養(yǎng)所有動物。預(yù)適應(yīng)飼養(yǎng)結(jié)束后,將40只C57BK/6 J雄性小鼠隨機(jī)分為5組,分別為空白對照組(CON組)、造模組(DSS組)、玉米醇溶蛋白組(zein組)、異甘草素組(ISO組)、玉米醇溶蛋白-異甘草素納米顆粒組(zein-ISO組),每組8只。第8～14天,各實(shí)驗(yàn)組小鼠均用普通飼料喂養(yǎng),除空白對照組繼續(xù)使用普通飲用水喂養(yǎng)外,其他各組使用30 g/L的DSS溶液作為飲用水喂養(yǎng)。同時(shí),ISO組與zein-ISO組每日分別灌胃ISO與zein-ISO,灌胃劑量以ISO計(jì)為20 mg/kg·bw;zein組每日灌胃等量zein(以zein-ISO中zein計(jì)),上述灌胃樣品均溶于200 μL PBS緩沖液中,CON組和DSS組每日灌胃等體積PBS緩沖液。第15天,實(shí)驗(yàn)結(jié)束,處死動物。

1.3.6.2 動物處死與取材

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,采用異氟烷麻醉小鼠,摘眼球取全血,頸椎脫臼法處死。然后立即解剖截取結(jié)腸,將結(jié)腸置于冰盒上,使用生理鹽水沖洗腸道內(nèi)容物,濾紙吸干,將結(jié)腸自然伸展平鋪在A4白紙上,測量各組結(jié)腸長度并拍照。

1.3.6.3 疾病活動指數(shù)(disease activity index, DAI)評分測定

參照ZHANG等[15]的方法對各組小鼠進(jìn)行DAI評分標(biāo)準(zhǔn)做出修改,記錄每只小鼠的DAI評分,以評估結(jié)腸炎疾病的狀態(tài),通過各組小鼠體重、糞便性狀、糞便的隱血情況在內(nèi)的綜合指標(biāo),用作評估DAI評分。具體評分細(xì)則如表1所示。

表1 DAI評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 The standard of DAI scores

1.3.6.4 結(jié)腸組織生化指標(biāo)檢測

取各組結(jié)腸組織加入適量生理鹽水制備組織勻漿,離心后取上清液。按試劑盒說明書測定腫瘤壞死因子-α(tumour necrosis factor-α, TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)。

1.3.7 血液中ISO濃度的測定

參照馮穎淑[16]的方法檢測血漿中ISO濃度。小鼠眼球取血于肝素鈉提前處理過的離心管中,離心取上層血漿。取100 μL血漿于2 mL離心管中,加入甲醇1.5 mL,渦旋1 min,20 ℃,5 000 r/min離心10 min后取上清,40 ℃氮?dú)獯蹈?加入100 μL甲醇復(fù)溶后轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中。使用HPLC檢測ISO的濃度,檢測條件為:色譜柱為Galaksil(EF-C18Bio,5 μm),柱溫為30 ℃,流速為0.8 mL/min,流動相為甲醇-0.2%磷酸溶液(體積比為60∶40),檢測波長為372 nm,進(jìn)樣量:20 μL。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)測定3次,采用Graphpad prism 8.0和Origin 2022軟件作圖。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示,采用SPSS 23軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)和Duncan檢驗(yàn)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 zein質(zhì)量濃度對納米顆粒分散體穩(wěn)定性的影響

如圖1-a所示,粒徑與PDI隨著zein溶液質(zhì)量濃度的增大,呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢。在zein溶液質(zhì)量濃度保持在20～40 g/L時(shí),納米顆粒溶液的PDI均小于0.3,此時(shí)粒徑的分布均一性較好。這可能是因?yàn)樵谫|(zhì)量濃度逐漸升高的過程中,zein溶液通過自組裝的方式,逐漸形成粒徑較小且較為均一、分散的納米顆粒;自組裝過程結(jié)束后,隨著質(zhì)量濃度逐漸升高,過多的zein會包裹在外圍,使體系中的納米顆粒粒徑變大[17]。此外,在zein溶液質(zhì)量濃度為20 g/L時(shí),zein-ISO納米顆粒電位絕對值最大,體系最穩(wěn)定;當(dāng)zein質(zhì)量濃度進(jìn)一步提高,zein-ISO納米顆粒電位逐漸穩(wěn)定至-30 mV。因此,選擇質(zhì)量濃度為20 g/L的zein溶液制備zein-ISO納米顆粒,此時(shí)體系穩(wěn)定,粒徑更小。

2.1.2 乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)對納米顆粒分散體穩(wěn)定性的影響

如圖1-b所示,隨著乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)增大,粒徑與PDI均呈現(xiàn)先減小后變大的趨勢。賴嬋娟等[18]的研究表明,隨著乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)升高,zein納米顆粒的粒徑表現(xiàn)出類似的變化趨勢。溶液中存在溶劑與蛋白之間的作用,乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)不同造成其親水/疏水性不同,由此導(dǎo)致玉米醇溶蛋白結(jié)構(gòu)在溶液中展開以及聚集的程度也不同,產(chǎn)生了不同大小的納米顆粒。當(dāng)乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%時(shí),納米顆粒粒徑與PDI最小,分布均一性較好。此外,此時(shí)納米顆粒的電位為-31.5 mV,體系穩(wěn)定性好。因此選用體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液制備zein-ISO納米顆粒。

2.1.3 ISO添加量對納米顆粒分散體穩(wěn)定性的影響

如圖1-c所示,隨著ISO的添加量增多,zein-ISO納米顆粒粒徑先減小后變大,PDI逐漸增加,但趨勢不明顯。當(dāng)ISO添加量為4～10 mg時(shí),納米顆粒粒徑均低于150 nm,隨著ISO的含量增加,納米顆粒電位逐漸升高,說明芯材過多,體系不穩(wěn)定,zein和果膠無法包埋體系中所有ISO。這一結(jié)果與RODRIGUEZ-FELIX等[19]的研究相似。因此選擇ISO添加量為6 mg,此時(shí)zein-ISO納米顆粒粒徑為127.5 nm,電位為-32.1 mV,形成的納米顆粒溶液較為穩(wěn)定。

2.1.4 zein與果膠質(zhì)量比對納米顆粒分散體穩(wěn)定性的影響

多糖對于納米顆粒體系的穩(wěn)定有著重要作用。如圖1-d所示,隨著體系中果膠含量增加,納米顆粒粒徑和PDI先減小后增大,在zein與果膠質(zhì)量比為2∶1時(shí)粒徑最小,在144 nm左右。此外,果膠濃度較低時(shí),納米顆粒的電位絕對值相對較小,靜電作用弱,無法維持體系穩(wěn)定,可能造成顆粒的聚集。隨著果膠比例增加,電位達(dá)到-31.1 mV,能夠得到粒徑較小且均勻的納米顆粒(PDI在0.2左右)。果膠是一類來源豐富的天然陰離子多糖,溶解在水中形成帶負(fù)電荷的酸性溶液[20],zein的等電點(diǎn)在6.2附近[21],締合相互作用發(fā)生在果膠電離(帶負(fù)電荷)和蛋白帶正電荷(低于其等電點(diǎn))的條件下[22]。在酸性條件下,果膠可以吸附在zein的表面,并通過靜電作用、空間位阻作用提高體系的穩(wěn)定性,果膠比例的上升促進(jìn)了這一相互作用。但果膠比例過大可能會導(dǎo)致多余果膠發(fā)生交聯(lián)或者果膠重復(fù)包裹蛋白,使粒徑變大。這與ZHANG等[23]通過反溶劑法制備玉米醇溶蛋白-黃原膠納米顆粒的發(fā)現(xiàn)相似。因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇zein∶果膠=2∶1的質(zhì)量比制備zein-ISO納米顆粒。

2.2 zein-ISO納米顆粒理化性質(zhì)表征

根據(jù)2.1節(jié)的結(jié)果,選擇zein溶液質(zhì)量濃度20 g/L、乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)80%、ISO添加量為6 mg、zein與果膠質(zhì)量比為2∶1制備zein-ISO納米顆粒,并對樣品的理化性質(zhì)進(jìn)行表征。

2.2.1 納米顆粒分散體穩(wěn)定性

zein和zein-ISO納米顆粒粒徑、電位以及PDI的結(jié)果如圖2所示。酸性環(huán)境為果膠-蛋白相互作用提供了良好的反應(yīng)條件,優(yōu)化工藝得到的zein納米顆粒平均粒徑大小為102.3 nm,PDI<0.15,電位絕對值大于30 mV,體系穩(wěn)定。使用反溶劑法制備納米顆粒的粒徑大小,通常與蛋白濃度、乙醇濃度、攪拌速度等因素相關(guān)[24]。隨著ISO加入,納米顆粒粒徑變大,LI等[25]利用zein包埋姜黃素的過程中發(fā)現(xiàn)同樣的趨勢,此時(shí)ISO成功包封在納米顆粒中。zein-ISO的PDI也呈現(xiàn)變大的趨勢,電位絕對值有所下降。但2種納米顆粒的電位均小于-30 mV,說明成功制備了較為穩(wěn)定的zein-ISO納米顆粒。

a-zein溶液質(zhì)量濃度對粒徑和PDI的影響;b-zein溶液質(zhì)量濃度對電位的影響;c-乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)對粒徑和PDI的影響; d-乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)對電位的影響;e-ISO添加量對粒徑和PDI的影響;f-ISO添加量對電位的影響;g-zein與果膠質(zhì)量比對粒徑和 PDI的影響;h-zein與果膠質(zhì)量比對電位的影響圖1 不同優(yōu)化條件對納米顆粒分散體穩(wěn)定性的影響Fig.1 Effects of different optimization conditions on the stability of nanoparticle dispersions注:圖中柱上小寫字母不同表示組間差異顯著(P<0.05),字母相同表示組間差異不顯著(P≥0.05)。

a-粒徑;b-PDI;c-電位圖2 zein和zein-ISO納米顆粒的分散體穩(wěn)定性Fig.2 Dispersion stability of zein and zein-ISO nanoparticles

2.2.2 微觀形態(tài)特征

掃描電鏡觀察到的zein原料、zein和zein-ISO納米顆粒微觀形態(tài)特征如圖3所示。zein原料是不規(guī)則形狀,類似于塊狀,表面帶孔,這與孫麗君等[26]觀察到的結(jié)果是一致的。zein和zein-ISO納米顆粒都呈現(xiàn)較為均一的球狀納米結(jié)構(gòu),形態(tài)相差不大,粒徑均分布在100～200 nm,與納米粒度激光儀的測定結(jié)果一致。這一對比說明利用反溶劑法制備納米顆粒是可行的。

a-×30 000;b-×10 000圖3 zein原料、zein、負(fù)載ISO的zein納米顆粒的掃描電鏡Fig.3 SEM of zein raw materials, zein, and ISO loaded zein nanoparticles

2.2.3 XRD

對比分析納米顆粒(zein、zein-ISO)、芯材ISO、果膠(pectin)和物理混合物ZPI(zein+pectin+ISO)的凍干樣XRD圖譜,如圖4所示。由圖4可以發(fā)現(xiàn),zein在9°和20°處顯示出2個(gè)寬峰,果膠在13.3°和21.5°處出現(xiàn)衍射峰,證明二者均為無定形結(jié)構(gòu)[27-28]。ISO在7.9°、11.7°、14.9°、17.3°、21.3°、24.5°、26.7°等多處出現(xiàn)多個(gè)尖銳的衍射峰,說明純ISO呈現(xiàn)高度結(jié)晶狀態(tài)[29]。物理混合物ZPI的衍射圖譜中同時(shí)存在zein的特征峰(9°和20°)和ISO的部分特征峰(15°～30°)。與此相比,zein-ISO與zein衍射圖譜的相似性表明,反溶劑法使ISO成功負(fù)載在zein納米顆粒內(nèi)部,以無定形形式存在,有助于提高化合物的水溶性[30]。

2.2.4 FTIR

a-ISO、zein和負(fù)載ISO的zein納米顆粒;b-果膠、物理混合物(ZPI)圖4 ISO、zein、負(fù)載ISO的zein納米顆粒、果膠、 物理混合物(ZPI)的XRD圖譜Fig.4 XRD patterns of ISO, zein, zein nanoparticles loaded with ISO, pectin, and physical mixture (ZPI)

a-ISO、zein和負(fù)載ISO的zein納米顆粒;b-果膠、物理混合物(ZPI)圖5 ISO、zein、負(fù)載ISO的zein納米顆粒、pectin、 物理混合物ZPI的FTIR圖譜Fig.5 FTIR patterns of ISO, zein, zein nanoparticles loaded with ISO, pectin, and physical mixture (ZPI)

2.3 體外模擬消化穩(wěn)定性

體外模擬消化廣泛應(yīng)用于預(yù)測生物活性物質(zhì)生物可及性,具有條件易控制、相對便宜、快捷等優(yōu)點(diǎn)。ISO通過溶解在消化液中被機(jī)體吸收利用,所以使用模擬消化后ISO在消化液中的溶解占比表示ISO的生物利用度,具體操作步驟及釋放率計(jì)算方法見1.3.5節(jié)。

隨著體外模擬消化進(jìn)行,2種納米顆粒的釋放率變化如圖6所示。由圖6可見,模擬胃消化結(jié)束時(shí),有23.28%游離的ISO被釋放,zein-ISO納米顆粒中只有18.85%被釋放。這可能是因?yàn)榇藭r(shí)pH值低于果膠的pKa,造成納米顆粒外層果膠的質(zhì)子化,影響了胃蛋白酶對玉米醇溶蛋白納米顆粒的消化水解。在模擬腸液消化階段,zein-ISO納米顆粒的釋放率顯著高于游離ISO。此時(shí)模擬腸液為中性環(huán)境(pH=7.5),果膠與zein之間的靜電相互作用減弱,在胰蛋白酶的作用下,zein納米顆粒被水解,促進(jìn)了ISO的釋放[36]。體外模擬消化結(jié)束時(shí),zein-ISO納米顆粒的總釋放率達(dá)到了72%,明顯高于游離ISO(34.4%),并且在腸液中的釋放率(53.15%)高于胃液(18.85%)。以上結(jié)果說明,zein納米顆粒包埋可提高ISO在消化液中的生物利用度,腸道可能是ISO釋放的主要部位,zein-ISO納米顆粒具有靶向腸道釋放和緩釋的潛力。

2.4 包埋率和裝載率

對納米顆粒中ISO的包埋率和裝載率進(jìn)行了測定,zein-ISO納米顆粒的包埋率達(dá)到了91.66%,但裝載率較低(5.52%)?？赡苁且?yàn)樵谠摷{米顆粒的形成過程中,單位質(zhì)量的壁材能裝載的溶解狀態(tài)的ISO有限,改進(jìn)納米顆粒載藥方式可能會使裝載率上升。如林爽[37]通過對比核殼結(jié)構(gòu)EGCG/Cys(Rapa)載藥納米顆粒與均勻分散結(jié)構(gòu)EGCG/Cys(Rapa)載藥納米顆粒的載藥率發(fā)現(xiàn),核殼結(jié)構(gòu)納米顆粒直接以藥物形核,因此有較高的載藥率。

圖6 ISO和zein-ISO納米顆粒模擬消化的釋放曲線Fig.6 Release profiles of ISO and zein-ISO nanoparticles during gastrointestinal digestion

2.5 干預(yù)結(jié)腸炎作用評價(jià)

2.5.1 對結(jié)腸炎小鼠體重的影響

造模期間,各組動物體重變化如圖7所示。CON組小鼠體重穩(wěn)步上升,DSS組小鼠體重持續(xù)下降約10.2%。與CON組相比,DSS組在最后一天的體重顯著降低(P<0.001)。與DSS組相比,zein組小鼠體重沒有顯著變化(P≥0.05),ISO和zein-ISO組能顯著緩解小鼠體重的下降(P<0.001),其中zein-ISO組的恢復(fù)效果更接近CON組。結(jié)果表明,被包封在納米顆粒中的ISO比直接灌胃ISO在緩解結(jié)腸炎小鼠體重下降方面更有效。

圖7 zein-ISO納米顆粒對結(jié)腸炎小鼠體重變化率的影響Fig.7 The effect of zein-ISO nanoparticles on body weight change in colitis mice注:#表示與空白組相比差異顯著(P<0.05),##表示與空白組相比差異 非常顯著(P<0.01),###表示與空白組相比差異極顯著(P<0.001); *表示與模型組相比差異顯著(P<0.05),**表示與模型組相比差異非 常顯著(P<0.01),***表示與模型組相比差異極顯著(P<0.001)(下同)。

2.5.2 對結(jié)腸炎小鼠DAI評分及結(jié)腸長度的影響

如圖8-a所示,與CON組相比,DSS組小鼠DAI評分顯著升高(P<0.001)。與DSS組相比,ISO、zein-ISO組的DAI評分均顯著降低(P<0.001)。zein處理后,小鼠DAI評分有下降的趨勢,但不顯著。灌胃zein-ISO比ISO更有利于降低DAI評分,這可能是因?yàn)榧{米顆粒中壁材的保護(hù)作用在一定程度上減少了ISO在胃中的釋放,并且適宜的顆粒粒徑范圍有利于其選擇性透過腸上皮細(xì)胞,更容易穿透黏液層[38],減輕DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎損傷。這與XIAO等[39]的研究結(jié)果相似。結(jié)果表明,DAI評分升高是DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎的重要表現(xiàn),各干預(yù)組不同程度地緩解了DAI評分的升高,但在灌胃相同濃度下負(fù)載在納米顆粒中的ISO的緩解效果優(yōu)于游離的ISO。

DSS誘導(dǎo)后會使結(jié)腸長度變短,所以從結(jié)腸長度可以直觀觀察DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎嚴(yán)重程度。量取各組小鼠結(jié)腸長度后進(jìn)行比較,結(jié)果如圖8-b、圖8-c所示。CON組小鼠結(jié)腸平均長度為8.52～0.59 cm,糞便成型度較高。DSS誘導(dǎo)后小鼠結(jié)腸平均長度顯著縮短(P<0.001)至6.33～1.35 cm,結(jié)腸蜷縮彎曲且肉眼可見腫脹充血。與DSS組相比,ISO組小鼠結(jié)腸長度顯著增加(P<0.05);zein-ISO組小鼠結(jié)腸長度幾乎與CON組一致,達(dá)到了極顯著水平(P<0.001)。以上結(jié)果說明,納米顆粒包裹ISO更能改善結(jié)腸長度縮短的疾病狀態(tài),這些趨勢與DAI評分基本一致。

a-DAI評分;b-結(jié)腸長度;c-結(jié)腸照片圖8 zein-ISO納米顆粒對結(jié)腸炎小鼠DAI評分及結(jié)腸長度的影響Fig.8 The effect of zein-ISO nanoparticles on DAI scores and colon length in colitis mice

2.5.3 zein-ISO對結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織炎癥因子水平的影響

結(jié)腸組織中的炎癥因子水平也是側(cè)面體現(xiàn)結(jié)腸炎嚴(yán)重程度的表觀指標(biāo)之一。對小鼠結(jié)腸組織炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平進(jìn)行評價(jià),結(jié)果如圖9所示,與CON組相比,DSS誘導(dǎo)后小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β和IL-6水平均顯著升高(P<0.001),說明在DSS的作用下,促進(jìn)多種炎癥細(xì)胞因子的釋放,從而調(diào)節(jié)T細(xì)胞的增殖、生長和分化,加速炎癥反應(yīng)的發(fā)生[40]。與DSS組相比,zein組各炎癥因子水平并無顯著差異。ISO組小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β的水平明顯下降(P<0.05),IL-6的水平顯著降低(P<0.01)。zein-ISO極顯著降低了小鼠結(jié)腸組織中這些炎癥因子的水平(P<0.001)。負(fù)載在納米顆粒中的ISO比游離的ISO在結(jié)腸組織抗炎方面表現(xiàn)的更好,與ZHANG等[41]的研究一致。結(jié)果表明,zein-ISO可通過下調(diào)結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中炎癥細(xì)胞因子的表達(dá),緩解小鼠的潰瘍性結(jié)腸炎,效果明顯優(yōu)于游離的ISO。

a-TNF-α;b-IL-1β;c-IL-6圖9 zein-ISO納米顆粒對結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織炎癥因子水平的影響Fig.9 Effects of zein-ISO nanoparticles on the levels of inflammatory factors in colon tissue of colitis mice

2.5.4 血液吸收情況

通過檢測給藥小鼠血液中ISO的濃度反映不同形式ISO給藥后的機(jī)體吸收情況。以20 mg/kg的劑量灌胃ISO和zein-ISO后,zein-ISO組血液中ISO質(zhì)量濃度[(2.68±0.13) μg/mL]比ISO組[(0.48±0.01) μg/mL]高了4.58倍。這一結(jié)果與ZHANG等[42]相似,用負(fù)載異甘草素的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體處理的大鼠的異甘草素血漿濃度顯著高于用異甘草素溶液處理的大鼠。結(jié)果表明經(jīng)過納米顆粒包裹后能有效增加ISO在小鼠體內(nèi)的吸收,為提高難溶性天然產(chǎn)物的生物可及性提供了思路。

3 結(jié)論

本研究選用zein與果膠作為包覆材料,使用反溶劑沉淀法成功制備了負(fù)載ISO的復(fù)合納米顆粒。單因素優(yōu)化試驗(yàn)表明,選擇zein溶液質(zhì)量濃度20 g/L、乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)為80%、ISO添加量為6 mg、zein與果膠質(zhì)量比為2∶1,制備得到的zein-ISO納米顆粒包埋率達(dá)到了91.66%,具有較高的溶解性與穩(wěn)定性,在掃描電鏡下呈大小均一的規(guī)則球狀。體外模擬消化實(shí)驗(yàn)表明,zein-ISO納米顆粒可以提高ISO在腸道的釋放率,具有使其靶向腸道釋放和緩釋的潛力。動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,zein-ISO納米顆?？梢蕴岣逫SO在小鼠血液中的濃度,更顯著地降低結(jié)腸組織中炎癥因子水平,有效地干預(yù)了潰瘍性結(jié)腸炎。zein-ISO為水不溶性膳食功能因子的納米顆粒開發(fā)提供了新的思路。