多重RT-PCR同時檢測6種馬鈴薯病毒及1種類病毒

鄒瑩 楊立杰 謝錦 趙冀 畢恒翊 陳火云 宋波濤 馬恢 聶碧華

關鍵詞：馬鈴薯；病毒；類病毒；檢測方法；多重RT-PCR

馬鈴薯是世界第三大糧食作物，也是我國重要的農業經濟作物。但馬鈴薯易受到多種病毒病危害，加之其繁殖方式為無性繁殖，容易發生退化而導致產量和品質嚴重下降。已報道能在田間侵染馬鈴薯的病毒和類病毒有60多種，其中馬鈴薯Y病毒（potato virus Y，PVY）、馬鈴薯X病毒（potato virus X，PVX）、馬鈴薯A病毒（potato virus A，PVA）、馬鈴薯M病毒（potato virus M，PVM）、馬鈴薯S病毒（potato vi-rus S，PVS）、馬鈴薯卷葉病毒（potato leaf roll vi-rus，PLRV）這6種病毒和馬鈴薯紡錘塊莖類病毒（potato spindle-tuber viroid，PSTVd）是我國流行的主要種類。由于缺少有效的藥劑清除侵入寄主細胞內的病毒，當前，馬鈴薯病毒病防治主要使用脫毒種薯，而在脫毒種薯生產過程中，對主要病毒和類病毒進行快速、準確的檢測是保證種薯質量的關鍵，因此，建立高效的病毒檢測方法對病毒病的防治具有重要意義。

酶聯免疫吸附法（enzyme-linked immunosor-bent assay．ELISA）是應用廣泛的病毒檢測方法，具有特異性強、靈敏度高、可一次性檢測大量樣品等優點，但該方法一次只能檢測一種病毒，無法檢測類病毒PSTVd，對病毒濃度較低的馬鈴薯塊莖樣品也有一定的局限性。反轉錄一聚合酶鏈式反應（re-verse transcription-polymerase chain reaction， RT-PCR）檢測技術具有簡單快速、特異性強、靈敏度高等優點，并且可以彌補ELISA檢測方法的不足。尤其是多重RT-PCR可以同時檢測多種目標病毒，可大大提高檢測效率。Peiman等利用多重RT-PCR技術從PVX、PVS和PLRV單獨或復合侵染的樣品中檢測出這3種病毒。羅文彬等建立了可同時檢測PVX、PVM、PVY、PVA和PVS的多重RT-PCR技術。Lorenzen等和Mallik等利用免疫捕捉多重RT-PCR檢測和鑒別了馬鈴薯Y病毒的5種主要病毒株系。但多重RT-PCR并非RT-PCR簡單的組合，其對各引物的特異性、匹配性有很高的要求，還要求各引物之間沒有互作，引物自身不形成二級結構，各引物退火溫度相近，擴增片段電泳能夠區分開等。因此，檢測的目標片段越多，建立多重RT-PCR難度也越大。能夠一次性檢測我國主要流行的全部6種病毒（PVX、PVY、PVS、PVM、PVA、PLRV）和一種類病毒（PSTVd）的多重RT-PCR檢測體系迄今尚未見報道。本研究建立并優化了可同時檢測PVX、PVY、PVS、PVM、PVA、PL-RV、PSTVd的多重RT-PCR檢測體系，為脫毒種薯生產和病毒病的防治提供重要的技術支撐。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1病毒及樣品

6種主要病毒（PVX、PVS、PI。RV、PVA、PVY、PVM）和1種類病毒（PSTVd）單獨侵染的馬鈴薯試管苗，在（20±2）℃，光周期L∥D=16h∥8h的培養室中培養并保存，試驗前用ELISA或RT-PCR確認上述材料中病毒的種類和感染的唯一性。此外，從田間種植的馬鈴薯高代系材料中收集了26份有疑似病毒病癥狀的馬鈴薯葉片樣品用于多重RT-PCR方法的驗證。所有RT-PCR檢測均以馬鈴薯脫毒組培苗作為健康對照。

1.1.2主要試劑

本試驗ELISA所用馬鈴薯病毒檢測試劑盒購自英國ADGEN公司；UNIQ-10柱式TRIzoI總RNA抽提試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、6bp的隨機引物、PCR特異引物均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；質粒小量提取試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司。

1.2方法

1.2.1總RNA提取及cDNA合成

取馬鈴薯葉片0.1～0.3g，采用UNIQ-10柱式TRIzoI總RNA抽提試劑盒提取葉片總RNA。20uL的cDNA合成體系含1ug總RNA、2.5pmol/L的6bp隨機引物、1.0mmol/L的dNTPs、4uL 5×M-MLV緩沖液、1.25U/uL的反轉錄酶、0.5U/uL的RNA酶抑制劑。總RNA與隨機引物混合后先在65℃變性5min，立即置于冰上冷卻2min，再加入其余組分在PCR儀中42℃反應90min，最后70℃滅活反轉錄酶15min。

1.2.2引物設計與篩選

首先從參考文獻中篩選獲得PVY、PVS、PVX、PSTVd及Cox工的特異性引物，然后依據產物不超過700bp，且與上述目標產物大小容易區分的原則，進行PLRV、PVM和PVA特異性引物的設計。先在NCBI上分別檢索這3種病毒的全長核苷酸序列、外殼蛋白核苷酸序列及P1蛋白核苷酸序列，使用Clustal 2.0及GeneDoc進行比對，再利用Primer Premier 5.0設計引物，引物信息見表1。通過本實驗室Peiman等建立的單重RT-PCR體系，用各病毒陽性材料的cDNA驗證引物的特異性。

1.2.3多重RT-PCR檢測體系的建立和優化

本實驗室Peiman等已建立了可同時檢測PVX、PVS、PVY、PLRV、PSTVd的五重RT-PCR檢測體系，本研究在此基礎上增加了PVM、PVA和內參基因Cor-工的特異性引物，同時基于產物大小能通過電泳區分的原則，用自主設計的PLRV引物和呂典秋等設計的PSTVd引物將原體系中的對應引物進行了替換，建立了總體積50uL。的八重RT-PCR反應體系，并對鎂離子、dNTPs、cDNA模板以及引物濃度進行了篩選。各因素終濃度設置如下：MgC12溶液（200、250、300 umol/L），dNTPs溶液（240、280、320 umol/L），每種病毒質粒模板（14、21、28ng/uL），各種病毒特異性引物（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6umol/L）。

1.2.4PCR產物的克隆和測序

PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后采用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒回收目的片段。回收產物與pMD18-T載體在16℃下連接過夜，連接產物轉大腸桿菌DH5a菌株，進行藍白斑篩選，挑取陽性單菌落轉移至20mL LB培養基中，150r/min、37℃培養過夜，菌液送至上海桑尼生物技術公司進行測序，測序獲得的核苷酸序列通過與NCBI數據庫進行比對，完成對病毒序列的確認。

1.2.5質粒提取及靈敏度檢測

使用質粒小量提取試劑盒提取質粒，用分光光度計測定各病毒質粒的濃度，并調整到相近濃度，然后將各病毒質粒溶液等體積混合。將該混合質粒按照1：10、1：102、1：103、1：104、1：10s、1：106、1：107比例稀釋后作為模板，用所建立的八重RT-PCR體系擴增，觀察電泳結果，分析該八重RT-PCR檢測體系的靈敏度。

1.2.6利用建立的八重RT-PCR體系對田間樣品進行檢測

為了驗證建立的RT-PCR體系，從田間收集26份馬鈴薯葉片樣品采用本研究建立的多重RT-PCR進行檢測。同時，每份葉片樣品取0.1g采用馬鈴薯病毒ELISA檢測試劑盒檢測PVY、PVM、PVS、PVX、PVA和PLRV．用單重RT-PCR檢測PSTVd進行驗證。

2結果與分析

2.1引物的特異性

以相應的病毒陽性材料cDNA模板進行單重RT-PCR擴增以驗證引物的特異性。各病毒和Co-工基因的擴增結果如圖1所示，PVY、PVM、PVS、PVX、PVA、PLRV、PSTVd和Co-工的擴增產物片段大小依次為181、226、275、565、630、681、359 bp和500bp。

為進一步驗證自主設計的擴增PLRV、PVM、PVA的引物和引自文獻的擴增PSTVd引物的特異性，對它們的擴增產物進行了回收純化及測序，將測序結果與GenBank上公布的相應病毒序列進行核苷酸序列比對。結果顯示，PLRV、PVM、PVA和PSTVd的擴增產物與相應病毒、類病毒參考序列一致性分別達98.7%（EU717546）、98.5%（HM991708）、99.8%（249088）和98.5%（EU879923），表明上述相應引物能成功擴增相應的病毒和類病毒目標片段。

上述結果表明，本研究設計和選擇的相關引物RT-PCR擴增效果良好，產物大小易于區分，同時具有較好的特異性，可以用于后續多重RT-PCR體系的構建。

2.2多重RT-PCR檢測體系的優化結果

用不同病毒及類病毒cDNA混合物作模板，以來自馬鈴薯脫毒苗的cDNA作健康對照，利用上述建立的多重RT-PCR檢測體系，對上述8對引物中的部分或者全部進行組合，以評估多重PCR的檢測效果。結果如圖2所示，在所有多重PCR體系中Cox工都獲得了較好的擴增。在簡單組合中，PVY、PVM、PVS和Coz工的4對引物能分別與PSTVd、PVX、PVA和PLRV中的任意一對引物組成擴增效果良好的五重PCR體系（圖2，泳道1～4）。在PVY、PVM、PVS、Co-工和PLRV組成的五重PCR的基礎上，進一步增加PSTVd、PVX、PVA中的一種，可組成六重PCR體系（圖2，泳道5～7），而增加其中的兩對引物還可以成功地進行七重PCR擴增（圖2，泳道8～9）。最后，所有8對引物也能完成同體系擴增反應，各產物能夠從大小上進行區分，具有較好的檢測效果（圖2，泳道10）。

2.3多重RT-PCR的靈敏度

進一步用各目標病毒的質粒進行靈敏度分析，將含PVX、PVY、PVA、PVS、PVM、PLRV、PSTVd濃度分別為190.73、168.91、158.08、178.37、176.09、180. 04ug/uL和174. 71ng/uL的質粒模板等體積混合后進行梯度稀釋，檢測結果如圖3所示。模板稀釋103后，所有目標病毒和類病毒仍然能夠獲得清晰的特異性擴增條帶（圖3，泳道1～4）；稀釋104后，多重RT-PCR還能檢測到PVA、PVX、PSTVd和PVY（圖3，泳道5）；稀釋105后，多重RT-PCR只能檢測到PVA和PVX（圖3，泳道6）；進一步稀釋到106、107后，多重RT-PCR檢測不到任何特異擴增條帶（圖3，泳道7～8）。由此可見，該多重RT-PCR反應體系對各種病毒和類病毒的檢測限有所差異，其中PLRV、PVS和PVM病毒能檢測到的最低濃度約為1.8×10-1 ng/uL，PVY和PSTVd能檢測到的最低濃度約為1.7×10-2 ng/uL，而對PVA和PVX病毒的檢測最為靈敏，能夠檢測到的最低濃度分別為1.6×10-3ng/uL和1.9×10-3ng/uL。

2.4田間樣品的病毒檢測結果

從大田收集了26份疑似感染病毒的馬鈴薯樣品，用本研究建立的多重RT-PCR體系進行檢測，同時用DAS-ELISA方法檢測6種馬鈴薯病毒，用單重RT-PCR檢測PSTVd，對建立的多重RT-PCR體系進行驗證。檢測結果顯示，所有樣品用多重和單重RT-PCR兩種方法檢測均未檢出類病毒PSTVd，而其余6種馬鈴薯病毒的多重RT-PCR與DAS-ELISA檢測結果完全一致（圖4），同時本研究建立的多重RT-PCR方法對PVY、PVM、PVS、PVX的檢出率均高于DAS-ELISA檢測，其中，多重RT-PCR還檢測出DAS-ELISA未檢測出的PVS病毒3例（圖4，泳道4，9，16）、PVY病毒1例（圖4，泳道2）、PVX病毒2例（圖4，泳道2，7）以及PVA病毒1例（圖4，泳道12）。部分檢測結果見圖4，表明本研究建立的多重RT-PCR檢測結果較DAS-ELISA靈敏度更高，可以應用于田間樣品的檢測。

3結論與討論

近年來，RT-PCR因具有快速、靈敏、特異性強等優點，在馬鈴薯病毒檢測中得到了較好的應用，尤其是多重RT-PCR檢測技術，能夠實現在一個反應中同時檢測多種病毒，檢測效率更高，操作更簡便，被廣泛研究和應用。本研究建立和優化了能同時檢測PVX、PVY、PVA、PVS、PVM、PLRV及PSTVd的多重RT-PCR檢測體系，是至今為止一次性檢測種類最多的方法。同時，本體系引入了馬鈴薯內源參考基因Co-工，可有效避免由于RNA降解或其他RNA質量問題導致的假陰性問題，使得該多重RT-PCR檢測體系更加嚴謹和完善。

引物的設計和篩選是多重RT-PCR體系建立的關鍵。引物要具有特異性，引物間退火溫度應接近，相互影響應較小，其擴增的目標片段又要易于區分，同時還要避免各目標片段差異過大對擴增效率及延伸時間造成影響，合理地選擇引物會使反應體系更容易被優化，本研究針對PVA，PVM和PLRV CP基因的保守核苷酸序列分別設計特異性引物，同時遵循以上引物組合的基本原則，應用單重RT-PCR體系對自主設計和文獻查找獲得的引物進行驗證，確定了該多重RT-PCR檢測體系中7種病毒／類病毒的最佳引物組合。反應體系和反應條件是影響多重RT-PCR擴增效果的兩大類因素，建立準確且穩定的多重RT-PCR檢測體系需要對影響多重RT-PCR反應的主要條件及反應程序進行單因子優化。張威等對所建立的三重RT-PCR進行優化的試驗結果表明，適當提高MgC12和dNTPs的濃度有利于提高擴增效率，但也并非越高越好，因為dNTPs會與溶液中的Mg2+結合，而TaqDNA聚合酶發揮活性需要游離的Mg2+，因此溶液中MgC12和dNTPs的濃度要保持一定的平衡，本研究優化的試驗結果與其相符，本研究結果表明，為使體系擴增效率最高，需保證有足夠量的dNTPs，當dNTPs濃度為達320umol/L時，擴增效果最佳，而MgC12過高或者過低都會影響體系的擴增效果，當其濃度為250umol/l。時所擴增的目的條帶最清晰。董代幸等對所建立的四重RT-PCR進行了優化，結果表明，各引物對的濃度和比例不當會使某些目標條帶擴增不出來或者產生非特異性擴增，同時，由于各目標片段大小不同，各引物的特異性也存在差異，引物濃度與相應模板的量也需要進行反復探究，本試驗遵循以上原則對各引物對的濃度、比例以及相應模板量進行優化，獲得了最佳擴增效果的各引物及模板用量。

特異性和靈敏度是評價多重RT-PCR體系的重要參數，引物特異性強、靈敏度高才能保證檢測結果的準確性。為了探究多重RT-PCR的靈敏度，本試驗將各病毒質粒模板混合并進行一系列稀釋后進行反應，結果顯示，各病毒／類病毒的最低檢測濃度在1.6×10-3～1.8×10-1ng/uL之間，說明該檢測體系靈敏度較高；另外，應用本研究建立的多重RT-PCR體系對26個不同品種（系）的田間樣品進行檢測，結果表明，該多重RT-PCR檢測體系比DAS-ELISA檢測的靈敏度高，可檢測出DAS-ELISA無法檢測出的感病情況。

本試驗首次實現了PVY，PVS，PVM，PVX，PVA，PLRV、PSTVd的同時檢測，突破以往多重RT-PCR檢測技術檢測病毒數量少的局限，且以馬鈴薯內源性參考基因（Cox）作為對照，保證了檢測結果的可靠性，經本試驗驗證，該體系可降低檢測成本，提高檢測效率，可用于馬鈴薯種薯質量檢測。