中國南方稻田及其周邊環境根結線蟲種類鑒定

徐幸 卓富彥 楊芳 袁斌 彭云良 郭榮 姬紅麗

關鍵詞：稻田；擬禾本科根結線蟲；混合侵染；生物測定；特異性引物

根結線蟲Meloidogyne spp．廣泛分布于世界各地，是對全球農業危害最嚴重的植物病原線蟲。根結線蟲侵染植物根部后，根部外觀畸形形成根結，導致根系的吸收能力降低，被害株地上部則長勢衰弱、葉色異常，甚至提早死亡。此外，根結線蟲的侵染還容易導致土壤中植物寄生性病原真菌侵入而造成復合侵染。目前，世界上已報道98種根結線蟲，其中有40余種在我國已有發生記載。根結線蟲可以隨苗木、土壤、灌溉水和農用器械等傳播擴大危害范圍。隨著我國農業種植結構調整，根結線蟲病在我國發生和危害日益加重，一般病區導致作物減產15%～25%，部分田塊損失更高達70%以上甚至絕收。

我國于1959年在海南省水稻上發現根結線蟲病。進入21世紀后，稻田及其周邊溝渠、菜地、苗圃等環境中不斷發現擬禾本科根結線蟲Meloido-gyne grarninicola，分布范圍已包括海南、廣東、廣西、福建、湖南、浙江、湖北、江蘇、江西、四川等多省。徐幸等發現成都平原40%的稻田及周邊旱地受到數種根結線蟲侵染，其中優勢種為擬禾本科根結線蟲。長期以來，水旱輪作被認為是控制根結線蟲病的有效手段，但擬禾本科根結線蟲危害性強，寄主范圍廣泛，并適應水旱輪作環境，其發生和傳播將給各地水稻和其他作物生產帶來嚴重問題，因此有必要全面了解根結線蟲在我國水稻主產區的分布現狀和種類，為制定相應的傳播阻斷策略和防控措施奠定基礎。

1材料與方法

1.1樣品采集

2019年11月-2020年2月．由全國農技推廣服務中心組織南方水稻產區所在?。ㄖ陛犑校灾螀^）農業廳植物保護部門，委托轄下2～3個縣（市／區）植保植檢站在3～5個鄉（鎮）采集土樣，各鄉（鎮）選擇一個點，采集連片稻田及周圍旱地共10塊田樣品。田塊不論大小均沿“Z"字形路線設10個取樣點，挖取0～20cm耕作層土壤樣品裝袋，同一塊田10個點共取土壤樣品0.5～1.0kg，樣品袋內裝入記載樣點地理位置和田塊栽種作物類型信息的標簽，連同樣品清單寄往四川省農業科學院植物保護研究所實驗室。共采集了15個省（直轄市／自治區）的48個縣（市／區）的1181份土樣（表1）。其中海南72份，廣東60份，廣西60份，福建130份，上海82份，江蘇90份，安徽60份，江西100份，湖南110份，湖北64份，四川90份，重慶60份，云南83份，浙江60份，貴州60份。

1.2根結線蟲生物測定

2020年3月初將采集的各田塊土樣粉碎，每份土樣加入一定體積的滅菌河沙（土樣和河沙體積比為3：1）后充分混勻，平均分成3份放入帶托盤（直徑15cm）的盆（下底直徑14cm）中，共計3543盆。澆透水后，每盆土壤表面一半播種20粒左右市購番茄種子（‘美國紅冠’，四川省良明農業科技有限公司），另半邊播種20粒左右水稻品種‘日本晴’種子。種子表面覆蓋一層滅菌細土后，用75%百菌清可濕性粉劑600倍稀釋液噴霧至稍有積水以預防立枯病。花盆擺放在塑料大棚內，20d后溫度穩定上升后移至網室內水泥池中。晴天時每天用噴霧器噴細霧以保持土壤濕潤，陰雨天用塑料薄膜覆蓋防止雨水沖淋。托盤之間始終保持2cm以上距離，以避免花盆間線蟲交叉污染。培養50d后，拔取水稻和番茄根系洗去泥沙，調查每盆中2種植物根系有無根結形成，同一塊田3次重復有1次及1次以上水稻或番茄根系有根結產生，此土樣計為陽性，3次重復2種植物根系均未產生根結則記為陰性。檢出率一陽性土樣數／總土樣數×100%。

1.3根結線蟲分子鑒定

收集生物測定檢出根結的水稻和番茄根系，小心洗凈泥沙后用消毒剪刀剪碎根系，剪破根結，用淺盤分離法分離獲得線蟲懸浮液。線蟲懸浮液于4℃冰箱靜置過夜，收集底部線蟲于2mL離心管中，再將離心管液氮速凍30s后放在振動磨樣機中磨樣30s，按照徐幸等的方法提取線蟲DNA備用。用我國常發生的6種根結線蟲特異性引物（表2）進行種類鑒定。PCR擴增體系為25uL：2×RapidTap Master mix（諾唯贊）12.5uL，10umol/L上、下游引物各1uL，模板DNA 1uL，超純水補足至25uL。PCR擴增程序：95℃3 min;95u15s，退火溫度下退火15s（退火溫度見表2），72℃1min，35個循環；72u5min．12u保存。以滅菌ddH20作為陰性對照，實驗室收集的6種根結線蟲標準DNA樣品作為陽性對照。PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠110V電泳25min進行檢測，在凝膠成像儀上觀察并照相。能夠擴增出某線蟲特異性條帶的樣品計為該樣品對該線蟲為陽性。種類檢出率一檢出某種根結線蟲的土樣數／分子鑒定總土樣數×100%。

2結果與分析

2.1各地土樣根結線蟲檢出率

15個?。ㄖ陛犑校灾螀^）采集的土樣中均有部分土樣導致水稻或番茄根系產生根結，生物檢測結果表明，陽性土樣為312份，總檢出率為26.42%（表3）。其中來自廣西的土樣檢出率最高，達到56.67%，其次為福建土樣，檢出率為53.08%。廣東、湖南和浙江土樣檢出率分別為41.67%、42.73%和45.00%；海南、安徽、江西、湖北、重慶、貴州和云南的土樣檢出率在11.67%～23.33%;上海、江蘇和四川的土樣檢出率則均在10%以下。

在15省（直轄市／自治區）的48縣（市／區）中檢測出陽性土樣的有45個區（縣）。其中最高檢出率為73.33%，來自湖南省長沙市寧鄉市；其次福建省仙游縣和廣西陸川縣檢出率均為66.67%；福建省漳州市漳浦縣檢出率為63.33%；福建省南平市順昌縣檢出率為60.00%。來自四川、重慶、貴州、江蘇和上海等?。ㄊ校└骺h（市／區）的土樣樣品檢出率均較低，最高不超過20%。樣品未檢測出根結的有上海市的嘉定、浦東和松江3個區（表4）。

2.2根結線蟲種類鑒定

利用6種線蟲特異性引物，在171份陽性土樣DNA中成功檢測并鑒定出6種已知根結線蟲：擬禾本科根結線蟲、北方根結線蟲M．hapla、花生根結線蟲M．arenarza、爪哇根結線蟲M．jauoanzca、象耳豆根結線蟲M．enterolobii和南方根結線蟲M．in-cognita，平均檢出率分別為88. 89%、41. 52%、29.82%、10.53%、4.09%和3.51%（表5）。6種根結線蟲導致水稻或番茄出現的根結癥狀（圖1）。其中擬禾本科根結線蟲在調查的15省（直轄市／自治區）均有分布，北方根結線蟲在貴州、重慶、安徽和江西以外的調查?。ㄖ陛犑校灾螀^）均有分布，花生根結線蟲在四川和湖北外的調查省份的稻田或周邊環境中均有分布，爪哇根結線蟲分布在安徽、云南、海南、浙江、廣西和福建稻田或周邊環境土壤中，南方根結線蟲分布在云南、浙江、湖南和福建稻田或周邊環境土壤中，象耳豆根結線蟲分布在重慶、云南、湖南和福建的稻田或周邊環境土壤中。

所有調查省份均有2種及以上根結線蟲發生。其中湖北、江西、貴州和四川檢測到2種，廣東、安徽、重慶、江蘇和上海檢測到3種，廣西和海南檢測到4種，浙江和湖南檢測到5種，福建和云南檢測到6種，各省檢測出具體種類見表5。從采樣區縣看（表4），云南省西雙版納檢測出6種根結線蟲，福建省仙游縣、福建省南平市順昌縣和浙江省金華市婺城區檢測出5種根結線蟲，4種根結線蟲混合發生的區（縣）有廣西陸川縣、浙江省衢州市龍游縣、湖南省長沙寧鄉、湖南省益陽市赫山區、湖南省常德市漢壽縣、福建省漳州市漳浦縣和海南省?？谑旋埲A區等7個區（縣）。

在完成分子檢測的171塊田中，受1、2、3、4、5種和6種根結線蟲侵染的土樣比例分別為：42.11%、41.52%、12.87%、2.92%、0.58%和0，其中最常見的為擬禾本科根結線蟲單獨侵染（34.50%）、擬禾本科根結線蟲與北方根結線蟲（22.81%）和擬禾本科根結線蟲與花生根結線蟲（13.45%）2種混合侵染，這3種根結線蟲混合侵染的田塊占比為5.26%，擬禾本科根結線蟲、北方根結線蟲和爪哇根結線蟲3種線蟲混合發生的田塊比例為3.51%，其他根結線蟲單獨和混合發生田塊數均不超過2塊田，其中來自云南西雙版納勐海鎮的一塊田同時檢出了擬禾本科根結線蟲、北方根結線蟲、花生根結線蟲、爪哇根結線蟲和南方根結線蟲，但無象耳豆根結線蟲（表6）。

3結論與討論

早在20世紀20年代，海南省即發生水稻根結線蟲病，至20世紀70、80年代，該病在海南已經擴展到多個縣，并在廣西浦北等地也有發現，分別鑒定為海南根結線蟲M．hainanenszs、林氏根結線蟲M．lini，目前這2個命名種已被歸并到擬禾本科根結線蟲。劉國坤等將福建省水稻及周邊環境雜草上根結線蟲鑒定為擬禾本科根結線蟲，并為多地所證實。徐幸等研究發現稻田及周邊環境土壤中有擬禾本科根結線蟲、花生根結線蟲等多個種存在，同一田塊中有不同種根結線蟲混合發生。本研究表明，擬禾本科根結線蟲已成為我國南方稻區的主要優勢種，在同一塊田常常與北方根結線蟲或花生根結線蟲混合發生。據報道，擬禾本科根結線蟲適應不同生態環境，可以占領稻田、旱地、溝渠、綠化帶、淺灘等多種生境，這可能是擬禾本科根結線蟲成為水稻田優勢種的主要原因。而其他線蟲在淹水環境下不能長期生存，稻田土樣里分離鑒定到這些種類，可能是由于其在周邊旱地中發生后隨灌溉水流入稻田并在水稻收獲后被采集，當然也不能完全排除這些種類中產生了能適應較長時間水淹的新種群，因而值得進一步研究，

目前，水稻根結線蟲在南方水稻主產區已經普遍發生。有證據表明，中國擬禾本科根結線蟲來源比較單一。筆者根據對水稻生產地區的調查，認為隨著20世紀80年代末水稻“兩系雜交稻”育種大規模開展，我國水稻南繁育種從海南往內陸地區運輸幼苗，可能是擬禾本科根結線蟲迅速擴散傳播的一個重要途徑。由于目前該線蟲已廣泛分布，加上線蟲寄主范圍廣，生境多樣，我國南方稻區已經失去了通過檢疫阻止其擴展的機會窗口。進一步摸清華北、西北和東北稻區擬禾本科根結線蟲在品種選育、集中育秧基地的發生現狀，以及該線蟲在北方大棚和露地低溫環境的適應能力，制定必要的檢疫管理措施仍具有重要意義。

近年來，水稻（水、旱）直播、旱育秧、濕潤育秧、有氧灌溉等新栽培措施，更有利于水稻根結線蟲病發生，而集中育秧和工廠化育秧基質一旦受到根結線蟲污染，引致的損失更加嚴重。因此，各地和水稻種植大戶有必要對本地水稻根結線蟲污染情況進行摸底調查。本研究所采用的生物測定方法簡單易行，值得大力推廣。

據初步測定，目前生產上缺乏抗水稻根結線蟲病的品種。國內外研究表明，包括化學藥劑在內的防治方法，都難以根除土壤中根結線蟲，因此在水稻根結線蟲病發生地區．應采取綜合防治措施，在加緊抗性品種選育的同時，盡量避免在病田、病基質直播和育秧，苗期宜采用淡紫擬青霉Purpureocilli-um lilacinun和噻唑膦等殺線蟲劑交互使用的方法進行防治，以減輕根結線蟲的危害。防治時，也應注意稻田周邊田埂、道路、水渠和旱地等環境中根結線蟲的防治。本研究中還有一些土樣導致水稻或番茄產生了根結，但由于DNA提取數量和質量原因，未能成功進行分子鑒定；這些土樣，以及已成功檢測出已知根結線蟲的土樣中，均不能排除還有其他的根結線蟲種類發生，仍需進一步重復取樣、分離培養和鑒定。