乳酸菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的研究進(jìn)展

趙海洋，張蓉，孫浩偉，包帥，田祚寧，曹永春

（1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100096；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院水產(chǎn)科學(xué)研究所，北京 100068；3.昌邑市畜牧業(yè)發(fā)展中心，山東 濰坊 261300）

根據(jù)《2023 年中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》報(bào)道，我國(guó)2022 年水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量為6 690.29 萬(wàn)t，同比增長(zhǎng)2.16%，養(yǎng)殖方式從粗放式走向精細(xì)化。但隨著單位水域養(yǎng)殖密度的增加，養(yǎng)殖水域的環(huán)境惡化，給病原微生物的傳播創(chuàng)造了有利的條件。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，健康管理和病害防治是關(guān)鍵，益生菌制劑的應(yīng)用，已成為水產(chǎn)病害防治的重要技術(shù)手段之一。目前水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用的一些傳統(tǒng)益生菌，并非魚(yú)類(lèi)消化道原籍優(yōu)勢(shì)菌群，在魚(yú)類(lèi)應(yīng)用時(shí)，可能存在弊端和風(fēng)險(xiǎn)。而分離于動(dòng)物腸道或養(yǎng)殖水體的微生物，制備成的微生態(tài)制劑，即原籍菌群[1]，可以避免排斥現(xiàn)象產(chǎn)生，在最大程度發(fā)揮益生功能的同時(shí)，保障腸道的微生態(tài)平衡，將受到的外來(lái)干擾降到最低，防止產(chǎn)生異常增殖[2]。

乳酸菌（lactic acid bacteria, LAB）作為腸道的“原籍菌”，是一類(lèi)以碳水化合物為底物，經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌的總稱，廣泛分布在人及動(dòng)物的腸道、食品及環(huán)境中。乳酸菌屬于革蘭陽(yáng)性菌，非孢子化，厭氧或兼性需氧，球或桿狀[3]，最佳生長(zhǎng)pH 值一般在5.5～5.8，營(yíng)養(yǎng)需求復(fù)雜，分為同發(fā)酵和雜發(fā)酵，同發(fā)酵從糖中產(chǎn)生乳酸，而雜發(fā)酵產(chǎn)生乳酸、乙酸、酒精和二氧化碳[4-5]。乳酸菌進(jìn)入腸道后，可迅速定植于腸道，形成優(yōu)勢(shì)菌群，代謝產(chǎn)生益生物質(zhì)，增強(qiáng)魚(yú)類(lèi)免疫調(diào)節(jié)功能，改善魚(yú)類(lèi)腸道結(jié)構(gòu)，促進(jìn)魚(yú)類(lèi)新陳代謝與生長(zhǎng)，因而受到人們的廣泛關(guān)注[6]?，F(xiàn)簡(jiǎn)述乳酸菌作為飼料添加劑的抗氧化作用機(jī)制及其在水生動(dòng)物養(yǎng)殖中的應(yīng)用現(xiàn)狀，以期為乳酸菌制劑在高密度水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的進(jìn)一步應(yīng)用，提供理論依據(jù)。

1 乳酸菌分類(lèi)

1.1 乳桿菌屬

乳桿菌屬為長(zhǎng)桿狀或球狀，通常成短鏈。革蘭陽(yáng)性，不生孢，兼性厭氧，有時(shí)微好氧，在有氧時(shí)生長(zhǎng)差，降低氧壓時(shí)生長(zhǎng)較好。存在廣泛，嗜酸性，最適pH 值為5.5～6.0，pH 值在3.0～4.5 時(shí)仍能生存，在乳桿菌中，植物乳桿菌是被研究最多的菌株。Piccolo等[7]評(píng)估了植物乳桿菌對(duì)歐洲海鱸的生長(zhǎng)性能和血清生化參數(shù)的影響，補(bǔ)充植物乳桿菌喂養(yǎng)90 d，對(duì)生長(zhǎng)性能有明顯的影響，血清生化參數(shù)中的總膽固醇和甘油三酯也有明顯增加。Soltani 等[8]在80 d 的喂養(yǎng)試驗(yàn)中，研究了3 種不同劑量的植物乳桿菌，對(duì)鯉生長(zhǎng)和血液免疫學(xué)參數(shù)的影響，結(jié)果顯示，植物乳桿菌使鯉的生長(zhǎng)性能和血液免疫指標(biāo)有正增長(zhǎng)，具有明顯較高的溶菌酶和堿性磷酸酶，還可以提高鯉對(duì)嗜水氣單胞菌引起的動(dòng)靜脈敗血癥的抗病能力。Kane 等[9]評(píng)估了植物乳桿菌，對(duì)用鏈球菌和乳酸菌疫苗處理的虹鱒的血清生化以及免疫反應(yīng)的影響，結(jié)果顯示，給免疫后的魚(yú)喂食植物乳桿菌，引起免疫參數(shù)如溶菌酶、替代補(bǔ)體活性、白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞總數(shù)以及血清生化參數(shù)等明顯增加。

1.2 片球菌屬

片球菌屬革蘭染色為陽(yáng)性，球狀，直徑1.2～2.0 μm，菌體排列成四聯(lián)狀，也可成對(duì)排列，單個(gè)細(xì)胞罕見(jiàn)，不形成鏈狀，不運(yùn)動(dòng)，不產(chǎn)芽孢。兼性厭氧，有的菌株在有氧時(shí)會(huì)抑制生長(zhǎng)。在過(guò)去的十幾年中，人們關(guān)注水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用的片球菌屬益生菌，大多數(shù)研究都集中在乳酸片球菌方面。飼料中添加乳酸片球菌，對(duì)斑馬魚(yú)精子質(zhì)量有影響，用益生菌處理斑雄性馬魚(yú)10 d 后，發(fā)現(xiàn)與雄性和精子質(zhì)量有關(guān)的選定基因有明顯的上調(diào)[10]。Hoseinifar 等[11]研究了虹鱒中單一或聯(lián)合添加乳酸片球菌和低聚半乳糖的效果。雖然單一給藥，對(duì)其生長(zhǎng)性能沒(méi)有明顯影響，但聯(lián)合給藥，明顯改善了生長(zhǎng)性能參數(shù)。此外，也觀察到，補(bǔ)充乳酸片球菌，可以明顯提高免疫反應(yīng)和對(duì)鏈球菌的抵抗力，在對(duì)鯉的研究中，也觀察到類(lèi)似的結(jié)果[12]。

1.3 腸球菌屬

腸球菌屬呈球形或卵圓形，在液體培養(yǎng)基中為成對(duì)或短鏈，不生芽孢，為革蘭陽(yáng)性菌，有時(shí)以鞭毛運(yùn)動(dòng)，沒(méi)有明顯的莢膜，兼性厭氧。通常生長(zhǎng)溫度在10～45 ℃，在pH 值9.6、6.5%氯化鈉（NaCl）中和40%膽鹽中也能生長(zhǎng)。腸球菌屬中的糞腸球菌，是水產(chǎn)養(yǎng)殖中研究最多的益生菌之一，從2014 年開(kāi)始有一些報(bào)道。Allameh 等[13]研究了口服糞腸球菌，對(duì)爪哇鯉生理反應(yīng)的可能影響。爪哇鯉以單劑量喂養(yǎng)5 周，在飼養(yǎng)期結(jié)束時(shí)，益生菌組的消化酶活性以及腸道短鏈脂肪酸（丙酸和丁酸）都有明顯增加。Matsuura 等[14]也報(bào)道了口服糞腸球菌后，細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的提升。

1.4 乳球菌屬

乳球菌屬是Schleifer 等[15]在1985 年提議設(shè)立一個(gè)新的菌屬，這個(gè)菌屬的大多數(shù)細(xì)菌原來(lái)是鏈球菌屬和乳桿菌屬中的細(xì)菌。乳球菌屬革蘭染色為陽(yáng)性，球狀、卵圓狀，直徑0.5～1.5 μm，菌體排列成對(duì)和短鏈。Nguye 等[16]從野生海洋魚(yú)類(lèi)的腸道中分離出乳球菌WFLU12，研究發(fā)現(xiàn)，WFLU12 通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性排斥和增加先天性免疫反應(yīng)，保護(hù)魚(yú)類(lèi)免受副豬鏈球菌感染。此外，用益生菌喂養(yǎng)的魚(yú)的生長(zhǎng)性能和飼料利用率都有所提高，這些結(jié)果突顯了分離宿主相關(guān)益生菌的重要性，是一個(gè)值得進(jìn)一步研究的課題?？子觋康萚17]在烏鱧飼料中添加乳酸乳球菌，飼喂8 周后，觀察各試驗(yàn)組腸道形態(tài)，發(fā)現(xiàn)處理組烏鱧腸道中部的皺襞高度高于對(duì)照組，并且顯著提高了cld3 的相對(duì)表達(dá)水平，維護(hù)了腸道物理屏障。

2 乳酸菌抗氧化機(jī)制

氧化應(yīng)激，指細(xì)胞內(nèi)氧自由基水平升高，導(dǎo)致脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA 損傷[18]?；钚匝酰≧OS），包括超氧陰離子自由基、羥基自由基和過(guò)氧化氫，是高活性氧自由基之一。在進(jìn)化過(guò)程中，大多數(shù)生物體，具有酶防御、非酶抗氧化防御以及修復(fù)系統(tǒng)，以保護(hù)其免受氧化應(yīng)激[19]。然而，這些天然抗氧化系統(tǒng)，通常不足以防止生物體受到氧化損傷。添加能夠延遲或防止細(xì)胞基質(zhì)氧化物質(zhì)，可保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷。因此，近年來(lái)從生物資源中尋找更安全、天然的抗氧化劑，來(lái)替代合成抗氧化劑，引起了極大關(guān)注。乳酸菌在宿主腸道中表現(xiàn)出顯著的抗氧化活性，并促進(jìn)抗氧化酶的產(chǎn)生，以幫助去除宿主腸道中的ROS，從而減輕氧化損傷。乳酸菌的抗氧化特性已在體外和體內(nèi)得到證實(shí)，但是抗氧化活性的機(jī)制尚不完全清楚。目前的研究認(rèn)為，乳酸菌可能通過(guò)清除ROS、螯合金屬、增加抗氧化酶水平和調(diào)節(jié)微生物群，來(lái)發(fā)揮抗氧化作用。

2.1 清除自由基

ROS 和活性氮，主要是在暴露于干擾細(xì)菌或宿主細(xì)胞代謝的壓力條件下產(chǎn)生的。大多數(shù)LAB具有清除O2自由基的系統(tǒng)，通過(guò)這些系統(tǒng)，可以降低食品發(fā)酵過(guò)程中自由基積累的風(fēng)險(xiǎn)和這些自由基對(duì)宿主生物體的損害。許多益生菌菌株及其代謝產(chǎn)物，在體外表現(xiàn)出對(duì)1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、氧離子（O2-）和過(guò)氧化氫（H2O2）的高清除能力，這些清除活性，通常隨著細(xì)菌細(xì)胞濃度的增加而增加[20]。有研究表明，某些菌株的培養(yǎng)上清液，表現(xiàn)出明顯高于完整細(xì)胞的自由基清除活性[21]，而在另一項(xiàng)研究中，完整細(xì)胞的清除活性又高于上清液[22]。這可能是由于益生菌品種之間的差異造成的。

2.2 金屬離子螯合

據(jù)報(bào)道，螯合劑如乙二胺四乙酸（EDTA）、巴菲咯啉二磺酸（BPS）、青霉胺和去鐵胺，可以捕獲金屬離子，防止金屬離子催化氧化[23]。Lin 等[24]在1999 年測(cè)定了19 種LAB 菌株的金屬離子（亞鐵離子和銅離子）螯合能力，結(jié)果顯示，嗜熱鏈球菌821 對(duì)Fe2+（亞鐵離子）和Cu2+（銅離子）都表現(xiàn)出最好的螯合能力。其他菌株也顯示了對(duì)Fe2+或Cu2+的螯合能力。此外，干酪乳桿菌KCTC 3260，通過(guò)螯合Fe2+和Cu2+，被證明具有很高的抗氧化能力[25]。盡管益生菌中金屬離子螯合作用的機(jī)制還不是很清楚，但研究表明，過(guò)渡金屬離子可以抑制酶催化的磷酸酯置換反應(yīng)，并通過(guò)氫過(guò)氧化物的分解，產(chǎn)生過(guò)氧自由基和烷氧自由基[26]。因此這些益生菌菌株的螯合能力，可能是由于存在于益生菌細(xì)胞內(nèi)無(wú)細(xì)胞提取物中的生理性螯合劑[24]。

2.3 酶的調(diào)節(jié)

LAB 有自己的抗氧化酶系統(tǒng)，大多數(shù)LAB 可以通過(guò)產(chǎn)生抗氧化酶來(lái)清除自由基，將自由基分解為O2和H2O2[27]。據(jù)報(bào)道，屬于乳球菌和嗜熱菌菌株的無(wú)細(xì)胞提取物中，具有超氧化物歧化酶（SOD）活性，其中乳球菌的活性高于嗜熱菌[28]。此外，表達(dá)高水平SOD 或過(guò)氧化氫酶的LAB 菌株，可以作為傳統(tǒng)食品應(yīng)用和新的治療用途的一種策略來(lái)開(kāi)發(fā)。LAB 可以誘導(dǎo)宿主抗氧化酶的活性，從而調(diào)節(jié)抗氧化系統(tǒng)，減輕氧化壓力。補(bǔ)充乳酸菌后，不僅在血清中觀察到SOD、過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽（GSH）過(guò)氧化物酶等活性的增加，而且在各種動(dòng)物的不同組織（肝臟）中也被觀察到，表明乳酸菌具有強(qiáng)大的抗氧化特性[29]。

2.4 腸道微生物群的調(diào)節(jié)

在腸道病原體過(guò)度增殖的情況下，腸道上皮細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生并釋放大量的ROS，造成嚴(yán)重的氧化應(yīng)激。已經(jīng)證明，腸道微生物群，可以調(diào)節(jié)氧化還原信號(hào)，影響宿主的氧化還原平衡[30]。補(bǔ)充LAB，可以調(diào)節(jié)腸道微生物群，據(jù)推測(cè)，LAB 可能部分地通過(guò)重建宿主的腸道微生物群，組成而發(fā)揮其抗氧化作用[31]。乳酸菌對(duì)腸道微生物群的調(diào)節(jié)與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，在高脂肪飼糧喂養(yǎng)的小鼠中，用硫辛酸處理后，ROS 和MDA 減少，總抗氧化能力增加，這與乳酸菌呈強(qiáng)烈的正相關(guān)，與大腸桿菌和腸球菌呈負(fù)相關(guān)[32]。補(bǔ)充約翰氏乳桿菌BS15，減輕了高脂肪飼料引起的氧化應(yīng)激，并改變了小鼠腸道中厚壁菌和擬桿菌的比例，表明LAB 對(duì)腸道微生物群的調(diào)節(jié)，有可能改善宿主的氧化還原狀態(tài)[33]。

3 在水產(chǎn)中的應(yīng)用

在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，乳酸菌主要作為益生菌來(lái)改善水產(chǎn)動(dòng)物健康和其生產(chǎn)能力。

來(lái)自土壤和大氣的鉛，污染了水體，對(duì)水生動(dòng)物產(chǎn)生不利影響。Giri 等[34]研究了羅伊氏乳桿菌P16對(duì)鯉接觸鉛引起的毒性的保護(hù)作用，表明羅伊氏乳桿菌P16 減少了鉛暴露引起的氧化應(yīng)激，扭轉(zhuǎn)了腸道微生物群的有害變化，恢復(fù)了腸道酶的活性。在針對(duì)耶爾森病的疫苗中加入植物乳桿菌426951，可顯著提高溶菌酶和堿性磷酸酶的活性，并增強(qiáng)虹鱒的疫苗接種效果[35]。LAB 可以產(chǎn)生具有抗菌活性的物質(zhì)，如細(xì)菌素、抗真菌肽等[36]。其中，細(xì)菌素、核糖體合成的細(xì)胞外肽或蛋白質(zhì)分子，對(duì)不同類(lèi)型的微生物具有殺滅或抑制作用，占據(jù)特殊地位。最初，不同菌株產(chǎn)生的細(xì)菌素，被認(rèn)為只對(duì)其他密切相關(guān)的LAB 物種有活性，但進(jìn)一步的研究表明，它們對(duì)系統(tǒng)發(fā)育較遠(yuǎn)的革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌，也有抗菌活性。LAB 抗菌化合物的抑制譜，包括引起魚(yú)類(lèi)和貝類(lèi)疾病的微生物，如沙門(mén)氏氣單胞菌、嗜水菌、沙門(mén)氏弧菌、致病性大腸桿菌等[37-38]。副溶血性弧菌是引起急性肝胰腺壞死（AHPND）的病原體，當(dāng)蝦感染溶血性弧菌時(shí)，飼料中加入嗜酸菌和釀酒酵母作為益生菌混合物，可以減少肝胰腺病變，保護(hù)蝦免受AHPND 發(fā)病的影響[39]。

大量的體外和體內(nèi)研究顯示，LAB 對(duì)呼吸道和胃腸道病毒如輪狀病毒、諾瓦克病毒等，具有潛在的抗病毒活性[40]。Harikrishnan 等[41]的研究表明，使用乳酸菌，產(chǎn)生了對(duì)褐牙鲆（Paralichthys olivaceus）的淋巴細(xì)胞病病毒（LCDV）的抗性。Son等[42]研究證實(shí)，添加植物乳桿菌的飼料，增強(qiáng)了石斑魚(yú)（Epinephelus coioides）對(duì)虹膜病毒的先天免疫反應(yīng)和抵抗力[42]。Nakayama 等[43]將LAB 的抗病毒活性機(jī)制，歸結(jié)為與病毒的直接接觸，通過(guò)誘導(dǎo)抗病毒基因的表達(dá)，來(lái)抑制病毒的復(fù)制調(diào)節(jié)，或刺激宿主免疫系統(tǒng)功能。Jung 等[44]研究表明，給予高劑量的乳酸桿菌，能促進(jìn)快速誘導(dǎo)抗體IgG1、IgG2a、先天免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子。乳酸菌支持體液免疫和細(xì)胞免疫，刺激溶菌酶的釋放，激活吞噬作用，從而提高身體對(duì)感染的整體保護(hù)水平[45]。越來(lái)越多的試驗(yàn)表明，通過(guò)預(yù)防性使用乳酸菌，可以改善養(yǎng)殖水生動(dòng)物的健康狀況和養(yǎng)殖水體的質(zhì)量，提高生產(chǎn)性能。

4 結(jié)語(yǔ)

乳酸菌能調(diào)節(jié)腸道微生物平衡，促進(jìn)魚(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)和發(fā)育，增強(qiáng)魚(yú)類(lèi)的免疫力和抵抗力，是一種安全的微生物添加劑，廣泛應(yīng)用于飼料工業(yè)。隨著我國(guó)綠色水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，乳酸菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中發(fā)揮了重要作用，對(duì)乳酸菌的有效性、特異性和多樣性提出了更高的要求。篩選特異性功能菌株，利用現(xiàn)代生物技術(shù)，不斷增強(qiáng)乳酸菌產(chǎn)品的功能，有針對(duì)性地使用乳酸菌產(chǎn)品，建立可持續(xù)、穩(wěn)定、安全的水產(chǎn)養(yǎng)殖微生態(tài)系統(tǒng)，將是水產(chǎn)養(yǎng)殖研究領(lǐng)域開(kāi)展乳酸菌研究和應(yīng)用的重點(diǎn)任務(wù)。