天竺桂葉精油抑菌活性研究

中國樟科植物資源豐富，主要分布于長江流域南部，四川、廣東、廣西、江西等分布較多[1]，是集醫藥用、材用、城市綠化為一體的植物資源[2]。天竺桂（Cinnamomum japonicum Sieb.）屬于樟科樟屬植物，其枝、干、葉都可提取精油，用來制作各種香料、調料、藥物[3]。由于天竺桂枝繁葉茂，生長較快，用作城市綠化樹種時，修剪的枝葉常作廢物處理，造成大量浪費[4]。大腸桿菌（Escherichia coli）是條件致病菌，可引起各種局部組織器官感染。肺炎克雷伯氏菌（Klebsiel‐la Pneumoniae）能造成肺部感染，最終惡化為肺炎。鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii）是醫院感染常見的一種細菌，通常會引起各類炎癥。植物精油來源于自然環境，使用后不會產生藥物殘留造成污染[5]。目前，樟屬植物精油在殺菌、抑菌方面的研究較為豐富，具有良好的抑菌活性。新木姜子精油對大腸桿菌有著較強的抑制效果[6]。肉桂精油對肺炎克雷伯氏菌有良好的抑制效果[7]，能快速滅殺銅綠假單胞菌[8]。天竺桂精油的抑菌范圍廣，對金黃色葡萄球菌、黑曲霉、大腸桿菌、甘藍黑腐菌、普通變形桿菌、藤黃八疊球菌、白菜軟腐菌等都有著良好的抑菌效果[9-10]，但抑菌活性強弱差異較大。本研究通過分析天竺桂葉精油的抑菌活性，確定它對大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和鮑曼不動桿菌抑菌活性的強弱，為其植物資源化開發提供基礎理論支撐。

1材料和方法

1.1實驗材料

1.1.1植物材料

天竺桂新鮮樹葉采集于四川農業大學成都校區內，用水洗凈后裝入尼龍網袋，自然晾干待用。

1.1.2供試菌種與培養基

大腸桿菌（Escherichia coli）、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella Pneumoniae）、鮑曼不動桿菌（Aci‐netobacter baumannii）菌種均由四川農業大學動物醫院提供。細菌的擴大培養和最小抑菌濃度的測定采用肉湯液體培養基進行分析。

1.1.3實驗儀器

高溫高壓滅菌鍋MLS-3780、恒溫搖床ZWY-2102C、超凈工作臺VD-850，恒溫培養箱等。

1.2實驗方法

1.2.1精油提取

將天竺桂樹葉粉碎，采用水蒸氣蒸餾法提取精油。將天竺桂樹葉與蒸餾水按1：4比例裝入燒瓶中，蒸餾3 h，再用無水Na2SO4對精油進行干燥，密封避光待用，并計算提取率。

1.2.2精油溶液配置

以三氯甲烷為溶劑，按100%、75%、50%、25%、0%精油體積分數進行精油溶液的配置，五種體積分數的精油溶液每次配置200 L，現配現用。

1.2.3細菌擴大培養

采用恒溫搖床對三種細菌擴大培養，轉速160 r/min，培養溫度37℃，培養時間24 h。對3種菌液濃度采用麥氏比濁法進行測定，測定3種菌液濃度均為3×108/mL。

1.2.4抑菌活性測定

采用打孔法測定精油的抑菌活性。具體步驟為：用移液槍將100 L細菌加入已備好的無菌培養基中，涂布均勻后靜置，待培養基完全吸收菌液后，用6 mm直徑的無菌打孔器將其打孔，再將50 L精油溶液加入孔中，放入37℃恒溫培養箱中。24 h后采用十字交叉法測量抑菌圈直徑。

1.2.5最小抑菌濃度測定

采用96孔板法測定精油的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度。吐溫80作為溶劑（按吐溫80：精油= 1：5）配置精油乳濁液，用二倍稀釋法設置精油乳濁液濃度，取6個無菌離心管，依次編號，將300 L精油、60 L吐溫80、840 L培養液加入第1個無菌離心管中，搖晃均勻后，將600 L培養液各自加入其余離心管中，再按順序從前1個離心管中取600 L溶液加入并搖晃均勻。從不同的離心管中，各取20 L乳濁液加入微孔板中，并將160 L培養液和20 L菌懸液加入每個試樣中，使每個微孔板中試樣的精油濃度分別為10.0000、5.0000、2.5000、1.2500、0.6250、0.3125 L/mL，將僅加入20μL菌懸液和180 uL培養液的微孔試樣作為陽性對照，再將96孔板放入37℃恒溫培養箱中進行培養，24 h后試樣清澈未發現明顯細菌生長的濃度為最小抑菌濃度，從清澈透明的試樣中取100 L涂布于固體培養基上，24 h后平板上完全無細菌生長的濃度為最小殺菌濃度。

2結果與分析

2.1精油抑菌活性

本研究中，天竺桂葉精油提取率為0.82%。由表1可知，天竺桂葉精油對大腸桿菌抑菌效果最好，100%體積分數的天竺桂葉精油抑菌圈直徑可達17.45 mm，25%體積分數的天竺桂葉精油抑菌圈直徑也有10.23 mm；對鮑曼不動桿菌抑菌效果較大腸桿菌略差，最大抑菌圈直徑13.46 mm，最小抑菌圈直徑8.34 mm；對肺炎克雷伯氏菌的抑菌效果最差，最大抑菌圈直徑10.12 mm，50%體積分數以下的天竺桂葉精油抑菌效果不明顯。

2.2最小抑菌濃度（MIC）

用天竺桂葉精油分別對大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、鮑曼不動桿菌最小抑菌濃度進行測定，其結果詳見表2，由表2可知，天竺桂葉精油對大腸桿菌和鮑曼不動桿菌的最小抑菌濃度均為2.5L·mL-1，天竺桂葉精油對肺炎克雷伯氏菌的最小抑菌濃度為5.0L·mL-1，直徑達17.45 mm，25%體積分數的天竺桂葉精油抑菌圈直徑也有10.23 mm；對鮑曼不動桿菌抑菌效果較大腸桿菌略差，最大抑菌圈直徑13.46 mm，最小抑菌圈直徑8.34 mm；對肺炎克雷伯氏菌的抑菌效果最差，最大抑菌圈直徑10.12mm，50%體積分數以下的天竺桂葉精油抑菌效果不明顯。

2.3最小殺菌濃度（MBC）

將最小抑菌濃度實驗中的清澈溶液再培養24 h后的結果詳見表3，天竺桂葉精油對大腸桿菌和鮑曼不動桿菌的最小殺菌濃度為5.0 L·mL-1，對肺炎克雷伯氏菌的最小殺菌濃度為10.0 L·mL-1。

3結論與討論

天竺桂葉精油對肺炎克雷伯氏菌有抑菌效果但相對較差，但對大腸桿菌和鮑曼不動桿菌都有著良好的抑菌效果。天竺桂葉精油對大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和鮑曼不動桿菌的最小抑菌濃度分別為2.5 L·mL-1、5.0 L·mL-1和2.5 L·mL-1，天竺桂葉精油對大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和鮑曼不動桿菌的最小殺菌濃度分別為5.0 L·mL-1、10.0 L·mL-1和5.0 L·mL-1。與馬英姿等人[9]的研究結果相比較，本實驗中天竺桂葉精油對大腸桿菌的抑菌圈直徑較小，推測原因是抑菌實驗方法的不同和精油溶液含量不同，打孔法精油溶液用量為50 L，馬英姿等人采用牛津杯法精油溶液用量為200 L。另外，本研究中對大腸桿菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度與馬英姿等人的實驗結果相比濃度更高，推測原因是所選溶劑不同，在抑菌圈試驗中對肺炎克雷伯氏菌的抑菌效果稍差，而在最小抑菌濃度和最小殺菌濃度實驗中表現尚可，推測原因是兩個研究所選溶劑不同。如在黃曉東[10]等人研究中，天竺桂葉精油與青霉素鈉等量合用時能夠一定程度上的增加青霉素鈉的抑菌效果，與硫酸慶大霉素聯合用藥時卻降低了硫酸慶大霉素抑菌效果。申鴿[11]研究表明，當香樟葉與天竺桂葉精油按一定比例進行混合后，對蚊蟲的毒殺效果增強，若將這種方法運用在精油抑菌方面，推測會有較好的效果，這對精油抑菌方面具有參考意義，為后續研究提供了新的方向。

參考文獻

[1]楊永，劉冰.中國樟科物種編目：問題和展望[J].生物多樣性，2015，23（2）：232-236.

[2]劉春生，盧彪，張鵬鵬.重慶地區樟科植物資源調查與應用研究[J].綠色科技，2016（19）：6-8.

[3]陶思興，王佳玉，羅水平，等.野生天竺桂葉揮發油的抗氧化活性研究[J].北京聯合大學學報，2014，28（2）：22-25.

[4]舒康云，陶永元，徐成東，等.天竺桂葉精油的提取及成分分析[J].中南林業科技大學學報，2014，34（1）：107-111.

[5]申鴿，彭映輝，秦巧慧，等.天竺桂葉精油成分分析及其對蚊蟲的毒殺作用[J].中南林業科技大學學報，2010，30（9）：132-136.

[6]李娜，李鑫，祝子坪，等.舟山新木姜子揮發性成分的季節性變化及抑菌、抗氧化效果研究[J].林業科技，2018，43（5）：12-15.

[7]Yang SK， Yusoff K， Ajat M， et al. Disruption of KPCproducing Klebsiella pneumoniae membrane via induc‐tion of oxidative stress by cinnamon bark （Cinnamomum verum J. Presl） essential oil[J]. PloS one， 2019， 14（4）： e0214326.

[8]Elcocks ER， SpencerccHillips PTN， Adukwu EC. Rapid bactericidal effect of cinnamon bark essential oil against Pseudomonas aeruginosa[J]. Journal of applied microbiology， 2020， 128（4）： 1025-1037.

[9]馬英姿，譚琴，李恒熠，等.樟樹葉及天竺桂葉的精油抑菌活性研究[J].中南林業科技大學學報，2009，29（1）：36-40.

[10]黃曉東，黃曉昆，張嫻，等.天竺桂葉精油的含量動態、化學成分及體外抗菌活性[J].中國農學通報，2010，26（4）：182-188.

[11]申鴿.十一種植物精油及其混劑對致倦庫蚊的熏蒸活性研究[D].中南林業科技大學，2012.

基金項目：彩葉樹種資源開發及在龍泉山的應用研究（21LQ03）；楨楠根腐病原菌與生防細菌鑒定以及對植株的抗性生理指標分析（23ZR201）

【1成都農業科技職業學院特色花木研究所李鳳，唐敏（通訊作者）；2四川農業大學林學院張優】