基于代謝組學和網絡藥理學探討針灸治療缺血性腦卒中作用機制*

張胤弢，劉心語，王玉玉，郭濤，張芳芳，邱繼文，王玉明

（1.天津中醫藥大學研究生院，天津 301617；2.天津中醫藥大學中藥學院，天津 301617；3.天津中醫藥大學針灸推拿學院，天津 301617）

腦卒中在中醫中被稱為中風，也被稱為偏枯、偏風等，中醫學認為“血瘀內阻，血行不暢，氣機不通，故而百病叢生”。缺血性中風的病因以內因引發者居多，如情志郁怒引動內風而發卒中；或脾失健運，痰郁化熱，虛陽化風擾動。病理變化為患者陰陽失調，內生風、痰、濕、火，以致氣血運行受阻[1]。目前的一些研究表明部分中藥可以改善缺血性腦卒中的微循環，減輕缺血再灌注損傷[2]，保護神經并且可以抑制細胞凋亡[3]。缺血性腦卒中的針刺治療可能從增加腦血流量，增強腦組織抗氧化損傷能力，減輕腦組織炎癥反應，調節神經遞質的釋放，調節星形膠質細胞激活等多個方面入手，從而促進神經功能的恢復[4]。

代謝組學可以識別特定生理和病理條件下的特異性分子標記物，并可用于研究代謝性疾病的發病機制和治療藥物的作用機制[5]。網絡藥理學可以通過分析靶點、通路等之間的關系，進一步揭示藥物對于疾病的潛在治療機制，在疾病、藥物成分、潛在靶點、通路等信息之間構建出關聯網絡[6]。本文將嘗試通過網絡藥理學和代謝組學，篩選針灸治療的缺血性腦卒中相關潛在生物標志物及代謝通路，對針灸治療缺血性腦卒中的潛在機制進行探索。

1 方法

1.1 活性成分及靶點的獲取 在本次分析中，系統地在以下三個數據庫中檢索了相關術語：PubMed、CNKI 和萬方數據庫（時間：2012—2022 年）：中文檢索式為（腦缺血OR 中風OR 腦卒中）AND（針灸OR電針OR 針刺）AND（抗氧化OR 炎癥OR 神經生化OR 星形膠質細胞），英文檢索詞為（cerebral ischemia or stroke or stroke）AND （acupuncture or electroacupuncture or acupuncture）AND（antioxidant OR inflammation OR neurobiochemical OR astrocytes）。將英文活性化合物通過Swiss Target Prediction （http：//www.swisstargetprediction.ch/） 檢索，以probability＞0 為標準，篩選出靶點或通過STITCH（http：//stitch.embl.de/）檢索活性成分靶點，然后兩者進行整合。

1.2 缺血性腦卒中相關疾病靶點的獲取 以“Ischemic stroke”“cerebral ischemia”“stroke”為缺血性腦卒中的搜索詞，利用Genecards 數據庫（https：//www.genecards.org/） 得到缺血性腦卒中relevance score≥2 相關的疾病靶點。

1.3 成分-靶點網絡構建 為進一步分析可視化研究結果，即直觀展示針灸治療缺血性腦卒中的潛在作用機制，利用Cytoscape 3.9.1 軟件將得到的針灸的活性成分及聯合治療缺血性腦卒中的潛在靶點繪制成“治療方式-成分-靶點”網絡圖[7]。

1.4 針灸治療缺血性腦卒中的潛在靶點的取得及PPI 網絡構建 將聯合治療的活性成分靶點定義為Therapy，缺血性腦卒中的疾病靶點定義為CIS，通過在線工具Venny2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）繪制出二者的Venny 圖，點擊交集部分得到潛在靶點。將潛在靶點輸入String 11.5 數據庫（https：//cn.string-db.org/），將物種設置為人，選擇隱藏無互相作用關系的靶點，以minimum required interaction score＞0.4 作為篩選標準[7]，得到交集靶點的PPI 網絡[8]。為分析靶點與蛋白之間的相互作用關系，將篩選后的數據選擇TSV 格式下載并導入Cytoscape 3.9.1 軟件，對交集靶點的PPI 網絡進行可視化，根據度（degree）值大小篩選出核心靶點。

1.5 GO 功能富集和KEGG 通路富集分析 為了挖掘針刺治療對缺血性腦卒中的干預機制，將聯合治療與缺血性腦卒中交集靶點輸入數據庫David（https：//david.ncifcrf.gov/，version 2021），以P＜0.05進行基因本體（GO）注釋及京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析。GO 功能富集分為生物過程BP（biological process）、細胞組分CC（cell components）和分子功能MF（molecular function）；KEGG 富集分析得到共有靶點富集的信號通路。下載各項數據表格，根據P 值大小再選擇前10 條目通過在線分析工具微生信平臺（http：//www.bioinformatics.com.cn/）上選擇“富集氣泡圖”進行可視化。

1.6 分子對接 通過PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）和PDB（https：//www.rcsb.org/）數據庫獲取成分結構及核心蛋白質結構，運用Autodock 4.2 軟件進行分子對接，PyMol 軟件可視化顯示。

1.7 材料與方法

1.7.1 實驗動物 實驗動物選擇北京維通利華實驗動物技術有限公司提供的健康雄性SD（Sprague Dawley）大鼠。大鼠稱質量后分籠飼養1 周，飼養環境：通風良好，飼養溫度25 ℃，相對濕度60%。籠中大鼠可自由攝取飼料和飲用水，飼料為維持性飼料。為幫助大鼠適應針刺干預，實驗開始前3 d 對每只大鼠進行干預訓練，把大鼠固定在自制鼠衣內半小時。適應性喂養1 周后，體質量控制在270～280 g，供后續實驗使用。

1.7.2 試藥與儀器 Waters Acquity UPLC 液相色譜儀，Waters Xevo G2 Q-TOF/MS 質譜儀，UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）（美國Waters 公司），G6805 型電針治療儀（蘇州醫療用品廠有限公司），一次性針灸針（蘇州華佗牌，直徑0.2 mm，針身長0.5 寸），線栓（北京西濃科技有限公司2036-A4）。

1.7.3 造模及分組 將大鼠隨機分為3 組，分別是假手術組、模型組、巨刺組。采用Zea Longa 線栓法制作大鼠缺血性腦卒中模型，使用經異氟烷氣體深度麻醉，術中小心分離大鼠右側頸總動脈、頸內動脈以及頸外動脈，使拴線從大鼠頸外動脈殘端插入頸內動脈，直至距頸外動脈與頸內動脈分叉處1.8 cm處停止。線栓停留1.5 h 后拔除栓子，制備缺血再灌注損傷模型。假手術組大鼠僅分離上述血管，而不插入栓線。缺血1.5 h 后拔除線栓，將大鼠尾部提起，可見大鼠左側前肢屈曲則視為造模成功[9]。

在適應性喂養一周的大鼠中篩選出24 只體質量在270～280 g 的健康雄性Sprague Dawley 大鼠，隨機分為假手術組（Sham 組，簡稱S 組）、模型組（Model 組，簡稱M 組）、巨刺組（Model+Contralateral Acupuncture，簡稱MCA 組），每組8 只。

1.7.4 干預方法 1）針灸組：造模成功24 h 后，分別對MCA 組大鼠健側肢體相關穴位進行電針干預，本實驗中的中風選穴借鑒李忠仁先生著的《實驗針灸學》經驗，選取同側上下肢體的內關、合谷、足三里、陽陵泉作為治療穴位。在參考華興邦《大鼠穴位圖譜的研制》的取穴經驗的基礎上采用擬人比照法確定四穴位置。將穿上自制鼠衣的大鼠仰臥固定于實驗臺，針刺穴位常規消毒，針具選用中研太和牌（0.25×13 mm）規格毫針，MCA 組針刺大鼠健側肢體合谷、內關、足三里、陽陵泉四個穴位，針刺后接電針，內關接正極，合谷接負極，上肢兩穴形成一個電流環路；足三里接正極，陽陵泉接負極，下肢二穴形成一個電流環路。電針儀波形選擇疏密波，10 Hz，2 強度，電針治療過程中大鼠無痛苦叫聲且肢體有輕微抖動。每次大鼠電針治療30 min，每日1 次，持續14 d（1 d 先評分后針刺，4 d、7 d、14 d 先針刺后評分）。S 組與M 組大鼠每次僅進行30min 捆綁固定，不進行針刺。2）假手術組與模型組：抓取、固定方法同針灸組，但不進行針刺。

1.7.5 血液樣品處理 將凍存于-80 ℃冰箱的血漿樣品取出，4 ℃下解凍溶解。取100 μL 血清，加入300 μL 乙腈（1∶3 體積比），渦旋混勻1 min，冰水浴超聲10 min，以13 000 r/min 的轉速，4 ℃離心15 min，離心半徑為6 cm，移取上清液200 μL 置進樣小瓶中，待UPLC-Q-TOF/MS 液質分析[10]。

1.7.6 UPLC-Q-TOF/MS 數據分析 色譜條件Waters Acquity UPLC BEH C18 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），柱溫為4 ℃，進樣量5 μL，流速為0.3 mL/min。流動相為0.1%甲酸水（A）和0.1%甲酸乙腈（B）。梯度洗脫條件：0～0.5 min，1% B；0.5～2 min，1%～50% B；2～9 min，50%～99% B；9～10 min，99% B；10～11 min，99%～1% B；11～14 min，1% B。

質譜條件電噴霧電離源（ESI 源），在正離子模式下進行分析，設置分子量掃描范圍m/z 50～1 000；毛細管電壓3.0 kV；干燥氣溫度325 ℃；干燥氣體流速10 mL/min；離子源溫度120 ℃；去簇電壓為60 V/-60 V；碰撞能量為35/-35 eV。本實驗運用Waters Acquity UPLC（Waters 公司，米爾福德，美國）進行代謝組學研究。采用電噴霧電離源（ESI 源），在正、負離子電離模式下進行質譜檢測分析。毛細管電壓：3.0 kV。干燥器溫度：325 ℃。干燥氣體流速：10mL/min。去溶劑流速：600 L/h。電離源溫度：120 ℃。去溶劑溫度：350 ℃。錐空氣流速：50 L/h[10]。

1.7.7 數據處理 在Progenesis QI 軟件建立新的實驗對UPLC-Q-TOF/MS 采集的數據進行分組，VIP 值（VIP＞1）、t 檢驗（P＜0.05）是篩選出潛在生物標記物的兩個受限條件，導入EZinfo 2.0 進行多元統計分析[11]。隨后，使用生化數據庫，包括HMDB（http：//www.hmdb.ca/）完成生物標記物的鑒定。Metaboanalyst（https：//www.metaboanalyst.ca/）用于代謝途徑分析，進一步揭示缺血性腦卒中的發病機制。

1.7.8 統計學處理 所有統計方法均采用SPSS 24.0 軟件，檢驗水平α＝0.05，當P＜0.05 時，表示具有統計學意義。

2 結果

2.1 針灸對缺血性腦卒中的治療和疾病靶點的結果分析 對得到的文獻進行分析獲得谷氨酸（Glu）、賴氨酸（Tyr）、多巴胺（DA）3 個針灸相關的活性成分；在Swiss Target Prediction 數據庫和STITCH數據庫獲取靶點蛋白，共得到150 個靶點。

圖1 文獻篩選針灸活性成分流程圖

在Gene Card 數據庫得到1 475 個疾病靶點，對所得到靶點進行整理。

2.2 “治療方法-活性成分-作用靶點”相關網絡的構建 將針灸該種治療方法在缺血性腦卒中作用的有效成分及相關靶點的network 文件和type 文件導入Cytoscape 3.9.1 軟件，構建“治療方法-活性成分-作用靶點”相關網絡。

紅色菱形部分為治療方法，橙色矩形部分為各治療方法對應的活性成分，綠色橢圓形部分為潛在治療靶點。

2.3 針灸治療在缺血性腦卒中的潛在作用靶點 將針灸的活性成分相關靶點進行合并去重，運用在線分析工具Venny 得到聯合治療對缺血性腦卒中疾病靶點、治療靶點47 個（圖3）。

圖2 成分-靶點網絡圖

圖3 活性成分-缺血性腦卒中潛在靶點韋恩圖

2.4 聯合治療對缺血性腦卒中的治療靶點網絡分析 運用String 數據庫（https：//cn.string-db.org）對聯合治療干預缺血性腦卒中的交集靶點進行PPI 分析，得到47 個節點，310 條邊（圖4）。在交集治療靶點相互作用網絡中，運用Cytoscape 分析得到連接度排名前10 的靶點分別為SLC6A3（溶質載體家族6），SLC6A4（溶質載體家族6），GRIN2B（N-甲基-D-天氡氨酸離子能谷氨酸受體2B），GRM2（谷氨酸的G 蛋白偶聯受體），TH （酪氨酸羥化酶），GRM5（谷氨酸的G 蛋白偶聯受體），DRD2 （多巴胺受體D2），COMT（兒茶酚-O-甲基轉移酶），GRIN2A（N-甲基-D-天氡氨酸離子能谷氨酸受體2A），SLC6A2（溶質載體家族6）。

圖4 活性成分-缺血性腦卒中潛在靶點互作網絡

2.5 交集治療基因靶點的GO 和KEGG 富集分析 為了挖掘聯合治療對缺血性腦卒中的干預機制，通過David 數據庫進行GO 富集與KEGG 通路富集分析。GO 功能分析共富集到204 個生物過程（BP）、51 個細胞組分（CC）、60 個分子功能（MF）；KEGG 富集分析得到33 條通路。為了更直觀地了解其基因功能和相關通路，以P 值作為參考進行排序，每一部分選取前10 位的條目，生成氣泡圖。橫坐標為富集程度，縱坐標為前10 位條目。GO 富集分析得到針灸治療干預缺血性腦卒中交集基因BP顯著富集在化學突觸傳遞，腺苷酸環化酶激活腎上腺素能受體信號通路，異種刺激響應，離子型谷氨酸受體信號通路，多巴胺代謝過程等生物過程（圖5）。CC 主要富集在質膜的組成部分，突觸后膜的重要組成部分，突觸前膜的完整組成部分，谷氨酸能突觸，突觸后膜等部位（圖5）；MF 主要在谷氨酸受體活性，離子型谷氨酸受體活性，多巴胺結合，腎上腺素結合等功能處富集（圖5）。KEGG 中得到信號傳導通路谷氨酸能突觸、cAMP 信號通路、神經活性配體-受體相互作用等（圖6）。

圖5 針灸治療缺血性腦卒中GO 功能分析

圖6 針灸治療缺血性腦卒中潛在靶點KEGG 通路富集分析

2.6 分子對接驗證 分子對接構象的結合能越低，則結合構象越穩定，反映受體分子與配體之間結合的可能性越大。對接結果顯示結合能均遠小于-4 kcal/mol，結果顯示靶點與活性成分之間可以穩定結合，分子對接結果結合能見表1。最后選取結合能＜-7 kcal/mol 的成分及靶點對接結果，示意圖見圖7。

圖7 分子對接模式圖

表1 分子對接結果

2.7 實驗結果

2.7.1 模式識別分析 對各組大鼠血清代謝組學正離子模式下代謝物峰強度數據進行PCA 分析，顯示巨刺組、模型組和假手術組大鼠之間在圖中存在明顯的分離趨勢，證明各組間存在良好的組間差異[12]。分析結果表明，假手術組和模型組在正離子模式上具有顯著差異，巨刺組與假手術組樣本的空間距離比模型組更近，如圖8。因此，推測巨刺組對缺血性腦卒中有一定的治療作用，使缺血性腦卒中大鼠的代謝變化與正常大鼠相似。

圖8 正離子模式下PCA 圖

為了篩選可能導致假手術組和模型組、巨刺組和模型組之間具有顯著差異的潛在生物標記物，分別建立了正離子模式下模型組和假手術組以及模型組和巨刺組的OPLS-DA 圖和S-plot 圖[13]。在OPLS-DA 中，對假手術和模型組的比較，對于正離子模式，R2Y（cum）=97%，Q2（cum）=79%；對于巨刺組和模型組的比較，對于正離子模式，R2Y（cum）=93%，Q2（cum）=83%；說明該統計模型具有良好的擬合性和預測能力，如圖9。

圖9 假手術組/巨刺組和模型組樣本在正離子模式下的OPLS-DA 圖和S-plot 圖

2.7.2 血清差異代謝物篩選 采用VIP 值、FC 值和P 值等多項標準篩選出對假手術組和模型組分類貢獻最大的內源性代謝物。通過多變量統計分析，將篩選出的潛在生物標記物重新引入到Progenesis QI 軟件中進行進一步鑒定[14]。生物標記物是利用HMDB 數據庫，通過化合物的實際和理論碎片離子來進行化合物鑒定。根據質量誤差（ppm）、同位素豐度和碎片離子匹配度等，對化合物進行篩選，如表2。與假手術組相比，模型組大鼠大部分溶血磷脂酰膽堿（lysoPCs）的表達強度降低，脂肪酸水平呈上升趨勢，而巨刺組組大鼠上述變化的代謝產物的含量部分恢復并接近假手術組水平[15]。

表2 潛在生物標志物匯總表

2.7.3 代謝通路分析 通過Metabo Analyst 5.0（https：//www.metaboanalyst.ca/）對49 個差異代謝物進行通路分析，結果顯示：上述代謝物參與甘油磷脂代謝、亞油酸代謝、α-亞麻酸代謝、乙醚脂質代謝、賴氨酸降解、花生四烯酸代謝等代謝通路。將這些潛在生物標志物的名稱導入Metabo Analyst 中，以進行途徑富集分析[16]。代謝途徑分析表明，如圖10 和圖11。這些代謝產物主要參與甘油磷脂代謝、亞油酸代謝等，結合網絡藥理學分析，突出了針灸影響作用的潛在治療靶點。

圖10 通路富集分析

圖11 通路分析

3 討論

谷氨酸不僅在人腦中擔任著主要興奮性神經遞質的角色，更為關鍵的是其興奮性毒性機制在缺血中可引起神經毒性，對腦缺血后的神經元會造成損害。星形膠質細胞是大腦中谷氨酸攝取的主要部位，對神經保護至關重要[17]。相關研究證實，在急性腦缺血超早期針刺可有效降低由于過度釋放谷氨酸而導致的缺血缺氧，減少了對腦缺血的損害[18]。除此以外，在缺血再灌注損傷中，針刺還能提高GLT-1（大鼠谷氨酸轉運體1）的表達，誘導早期腦缺血耐受性的建立[19]。酪氨酸會在體內產生的多種與神經傳導調節控制關系密切的生理物質。在腦部，多巴胺主要參與精神情緒活動，保持神經興奮性[20]。有實驗研究證實針刺可以有效抑制多巴胺的釋放，從而減輕對細胞和神經興奮性產生的毒性反應影響[21]，進而可以保護缺血性腦卒中的受損腦組織。

PPI 網絡構建，交集靶點中度中心性值排名靠前核心靶點有SLC6A3，SLC6A4，GRIN2B，GRM2，TH，GRM5，DRD2 等。SLC6A4 可以終止血清素的作用并以鈉依賴性方式回收DAT（多巴胺轉運蛋白）。GRIN2B 是NMDA 受體復合物的成分，具有高鈣滲透性和對鎂的電壓依賴性、敏感性。作為中風損傷的中樞介質，它與突觸外部位的DAPK1 配合，在Ser-1303 處發生DAPK1 磷酸化，增強了突觸NMDA 受體通道活性，誘導有害的Ca2+內流，導致不可逆的神經元死亡。GRM5、GRM2，谷氨酸的G 蛋白偶聯受體，在突觸可塑性和神經網絡活動的調節中起重要作用[22]。其配體結合會引起構象變化，通過鳥嘌呤核苷酸結合蛋白觸發信號傳導并調節下游效應子的活性。TH（酪氨酸羥化酶）參與酪氨酸向多巴胺的轉化，是兒茶酚胺合成中的限速酶。

GO 富集分析發現，交集靶點主要富集在化學突觸傳遞、腺苷酸環化酶激活腎上腺素能受體信號通路等生物過程。KEGG 通路分析篩選得到相關信號通路有33 條，在前10 條通路中，涉及的信號傳導通路有谷氨酸能突觸、cAMP 信號通路、神經活性配體-受體相互作用等。cAMP 在中樞神經系統中是負責參與突觸的傳遞的主力軍，并且在軸突生長以及神經元的存活方面起到十分重要的調節作用。PKA 也可以積極調節神經元的存活、生長以及重塑突觸，在這些方面也是起著舉足輕重的作用[22]。且有研究證實cAMP/PKA-CREB 信號通路在調節神經元存活和軸突生長這兩個方面起重要的作用，有可能是通過抑制RhoA 信號通路從而促進損傷軸突的再生[23]。此外，cAMP/PKA 通路會參與介導抗炎，以促進未分化的海馬神經元軸突再生，且激活PKA 可以進一步激活p CREB 的構象變化，減弱髓鞘相關抑制因子在軸突再生方面產生的影響，從而滿足促進軸突再生的目標[24]。因此，cAMP-PKA-p CREB 信號通路的激活促進損傷軸突的再生是恢復缺血性腦卒中的可能機制之一[25]。代謝組學KEGG 通路分析結果顯示，主要代謝途徑為甘油磷脂代謝、亞油酸代謝等，其中包含的代謝產物主要是磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰膽堿等。其中，胞二磷膽堿為磷脂酰膽堿合成的前體物質，而胞二磷膽堿可促進脂肪酸在細胞內的釋放，抑制自由基的生成，從而改善腦缺血后的功能[26]。溶血磷脂酰膽堿在缺血性卒中的病理生理學中起著關鍵和樞紐作用，它與血小板活化、內皮細胞功能障礙、炎癥E 細胞的活化和浸潤、炎癥細胞因子和黏附分子的表達、氧化應激、細胞的增殖和凋亡調節等事件緊密相關[27]。

4 結論

本文采用液質聯用技術，基于血清代謝組學和網絡藥理學策略探究了針灸治療缺血性腦卒中的作用機制[28-29]。結果表明大鼠缺血性腦卒中的形成主要與甘油磷脂代謝、亞油酸代謝、α-亞麻酸代謝乙醚脂質代謝、賴氨酸降解、花生四烯酸代謝的紊亂密切相關，針灸對缺血性腦卒中模型大鼠的治療作用機制可能是通過影響SLC6A3，SLC6A4，GRIN2B，GRM2，TH，GRM5 等靶點對溶血磷脂酰膽堿（lysoPCs）和脂肪酸差異內源性代謝物的調節，使紊亂的代謝向正常狀態轉歸，為深入的機制探討提供一定的依據。