響應(yīng)面法優(yōu)化榆黃蘑熟料袋栽菌絲體培養(yǎng)條件

張春艷 李賀 胡畔

摘要：以榆黃蘑為試驗(yàn)材料，基于最佳熟料袋栽配方進(jìn)行培養(yǎng)條件的單因素試驗(yàn)，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以菌絲生長速度為響應(yīng)值，采用Box-Behnken中心組合原理進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，對(duì)菌絲培養(yǎng)中的接種量、pH、溫度和培養(yǎng)料含水量4個(gè)不同培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化研究。結(jié)果表明，4個(gè)因素對(duì)榆黃蘑菌絲生長速度的影響大小為溫度＞接種量＞pH＞培養(yǎng)料含水量，最佳的培養(yǎng)條件為接種量7%、pH 6.5、溫度26 ℃、培養(yǎng)料含水量65%，該培養(yǎng)條件下榆黃蘑菌絲生長速度可達(dá)9.99 mm/d。

關(guān)鍵詞：榆黃蘑；熟料袋載；菌絲生長；培養(yǎng)條件；響應(yīng)面法

中圖分類號(hào)：S646.14 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2023）11-0125-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2023.11.022 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Optimization of mycelium culture conditions for bag cultivation of Pleurotus citrinopileatus

by response surface methodology

ZHANG Chun-yan，LI He，HU Pan

（College of Agriculture and Hydraulic Engineering， Suihua University， Suihua ?152061， Heilongjiang，China）

Abstract： Pleurotus citrinopileatus was used as the test material， and the single factor test of the culture conditions was performed based on the best bag culture with sterilized raw materials. On the basis of the single factor experiment， the response surface optimization experiment was carried out with the mycelium growth rate as the response value by using the Box-Behnken central combination principle， and the optimization research was carried out on four different culture conditions in mycelium culture， including inoculum volume， pH， temperature and water content of culture material. The results showed that the influence of the four factors on the mycelium growth rate of Pleurotus citrinopileatus was temperature > inoculum volume > pH > water content of culture material. The optimal culture condition was inoculum volume of 7%， pH of 6.5， temperature of 26 ℃， and water content of culture material of 65%. Under this culture condition， the mycelium growth rate of Pleurotus citrinopileatus could reach 9.99 mm/d.

Key words： Pleurotus citrinopileatus； bag culture with sterilized raw materials； mycelium growth； culture conditions； response surface methodology

榆黃蘑，又名金頂側(cè)耳，屬于側(cè)耳屬平菇，原是生于東北林區(qū)的一種野生食用菌，因其鮮艷的顏色和優(yōu)雅的外形，同時(shí)兼具較好的食用、藥用價(jià)值而備受消費(fèi)者喜愛［1，2］。榆黃蘑作為經(jīng)由野生種馴化而來的栽培種食用菌，其栽培歷史較短，且生物學(xué)特性和平菇相似［3］，因此，在榆黃蘑的栽培過程中栽培配方和栽培條件大都參照平菇進(jìn)行栽培［4］，所以農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的副產(chǎn)物如各種作物秸稈、雜木屑、農(nóng)業(yè)廢棄物等［5-7］均可栽培榆黃蘑，專家學(xué)者們利用木屑、雜木屑、茶枝木屑等栽培榆黃蘑技術(shù)已取得良好進(jìn)展［8-10］。

目前，對(duì)榆黃蘑的研究多集中在栽培配方與栽培技術(shù)［11-13］、營養(yǎng)價(jià)值［14］、生理活性與功能［15-17］等方面，采用響應(yīng)面法對(duì)榆黃蘑的研究重點(diǎn)圍繞在液體發(fā)酵培養(yǎng)［18］、培養(yǎng)基成分［19］和營養(yǎng)成分提取工藝條件［20］等方面，而對(duì)于固態(tài)培養(yǎng)料栽培榆黃蘑及其培養(yǎng)條件的響應(yīng)面法優(yōu)化研究鮮見報(bào)道。本研究以榆黃蘑為試驗(yàn)材料，以不同比例楊木屑和玉米秸稈添加量代替?zhèn)鹘y(tǒng)配方中的雜木屑設(shè)計(jì)栽培配方，篩選出栽培榆黃蘑的最優(yōu)配方，在最佳栽培配方的基礎(chǔ)上進(jìn)行單因素試驗(yàn)，依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以菌絲生長速度為響應(yīng)值，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法優(yōu)化榆黃蘑菌絲生長的培養(yǎng)條件，以期找到熟料袋栽榆黃蘑最適宜菌絲生長的培養(yǎng)條件，為黑龍江省榆黃蘑種植農(nóng)戶在栽培管理上提供更多的技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)所用榆黃蘑菌種為綏化學(xué)院食用菌研究所獲得。

試驗(yàn)原料中玉米秸稈為農(nóng)戶提供，楊木屑、麥麩、石膏、石灰等購買于綏化市農(nóng)資市場。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 配方篩選試驗(yàn) 試驗(yàn)中栽培主料選用楊木屑和玉米秸稈，輔料選用麥麩、石膏和石灰，以不同楊木屑和玉米秸稈的添加量設(shè)計(jì)栽培配方，試驗(yàn)共設(shè)7個(gè)處理，以F1栽培配方（楊木屑添加量0、玉米秸稈添加量80%）為對(duì)照，每個(gè)配方處理30袋，試驗(yàn)配方設(shè)計(jì)見表1。

1.2.2 栽培管理

1）培養(yǎng)料制備與滅菌。原料預(yù)處理后按各配方比例將培養(yǎng)料進(jìn)行混合、加水、攪拌、堆制，調(diào)整pH為7，含水量保持在60%～65%為宜。選用聚丙烯袋（14 cm×28 cm×0.005 cm）裝料，每袋裝料300 g，插入菌棒，包扎袋口，做好記錄。121 ℃條件下滅菌120 min。

2）接種與培養(yǎng)。滅菌后待培養(yǎng)袋自然冷卻至室溫時(shí)進(jìn)行接種，保證無菌操作的規(guī)范性和每袋培養(yǎng)料的接種量，各配方做好標(biāo)記。移至培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行菌絲體培養(yǎng)，溫度為20～25 ℃，空氣相對(duì)濕度保持在60%～70%為宜，保持空氣流通。

3）子實(shí)體培養(yǎng)。菌絲長滿袋后將其轉(zhuǎn)移到出菇室進(jìn)行子實(shí)體培養(yǎng)，出菇室內(nèi)相對(duì)濕度調(diào)控在80%～90%，溫度調(diào)控在15～20 ℃，適當(dāng)通風(fēng)，增加散射光照，協(xié)調(diào)好通風(fēng)、濕度、溫度之間的關(guān)系。

1.2.3 指標(biāo)測(cè)定 菌絲生長階段采用觀察法測(cè)定菌絲長勢(shì)和菌絲外觀品質(zhì)；采用劃線法測(cè)定菌絲的生長速度，即當(dāng)菌絲生長至菌袋1/3處時(shí)，沿菌絲生長邊緣劃第1條線，以后每隔2 d劃一次線，用游標(biāo)卡尺測(cè)量每兩線之間的垂直長度，直至菌絲長滿袋，計(jì)算得出菌絲平均生長速度；記錄菌絲的滿袋時(shí)間；頭潮菇采摘后稱量計(jì)算每一個(gè)配方的袋平均產(chǎn)量，各項(xiàng)指標(biāo)數(shù)據(jù)計(jì)算取平均值。

1.2.4 單因素篩選試驗(yàn)

1）接種量試驗(yàn)。在最優(yōu)配方的基礎(chǔ)上，控制pH、溫度和培養(yǎng)料含水量條件不變，設(shè)計(jì)接種量分別為4%、6%、8%、10%、12%，進(jìn)行榆黃蘑菌絲培養(yǎng)，以菌絲生長速度為測(cè)定指標(biāo)，記錄不同接種量對(duì)榆黃蘑菌絲生長的影響，試驗(yàn)3次重復(fù)。

2）pH試驗(yàn)。在最優(yōu)配方的基礎(chǔ)上，控制接種量、溫度和培養(yǎng)料含水量條件不變，設(shè)計(jì)pH分別為4、5、6、7、8，進(jìn)行榆黃蘑菌絲培養(yǎng)，以菌絲生長速度為測(cè)定指標(biāo)，記錄不同pH條件下培養(yǎng)對(duì)榆黃蘑菌絲生長的影響，試驗(yàn)3次重復(fù)。

3）溫度試驗(yàn)。在最優(yōu)配方的基礎(chǔ)上，控制接種量、pH和培養(yǎng)料含水量條件不變，設(shè)計(jì)培養(yǎng)溫度分別為21、23、25、27、29 ℃，進(jìn)行榆黃蘑菌絲培養(yǎng)，以菌絲生長速度為測(cè)定指標(biāo)，考察記錄不同培養(yǎng)溫度對(duì)榆黃蘑菌絲生長的影響，試驗(yàn)3次重復(fù)。

4）培養(yǎng)料含水量試驗(yàn)。在最優(yōu)配方的基礎(chǔ)上，控制接種量、pH和溫度條件不變，設(shè)計(jì)培養(yǎng)料含水量分別為55%、60%、65%、70%、75%，進(jìn)行榆黃蘑菌絲培養(yǎng)，以菌絲生長速度為測(cè)定指標(biāo)，考察記錄不同培養(yǎng)料含水量對(duì)榆黃蘑菌絲生長的影響，試驗(yàn)3次重復(fù)。

1.2.5 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì) 依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇接種量、pH、溫度和培養(yǎng)料含水量4個(gè)因素中的3個(gè)水平，以菌絲生長速度為響應(yīng)值，采用Box-Behnken中心組合原理設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)的因素與水平見表2。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Design Expert 8軟件進(jìn)行差異性和響應(yīng)面模型分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同比例楊木屑添加量栽培榆黃蘑配方篩選結(jié)果

由表3可知，不同比例楊木屑添加量對(duì)榆黃蘑菌絲生長和頭潮菇袋平均產(chǎn)量的影響較大，總體表現(xiàn)為隨著楊木屑添加量的增加，榆黃蘑菌絲生長速度和頭潮菇袋平均產(chǎn)量呈先上升后下降趨勢(shì)，當(dāng)配方F4栽培時(shí)榆黃蘑菌絲生長速度達(dá)最大，為8.87 mm/d，菌絲生長勢(shì)強(qiáng)，菌絲外觀品質(zhì)優(yōu)，表現(xiàn)為菌絲顏色潔白、整齊、健壯、濃密，菌絲長滿袋耗時(shí)23 d，各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于其他配方栽培，F(xiàn)5、F3、F6、F2與F4相比差異顯著，表現(xiàn)為菌絲生長的速度減慢，分別為8.53、8.02、7.99、7.24 mm/d，菌絲外觀品質(zhì)欠佳，菌絲長勢(shì)下降，菌絲滿袋時(shí)間延長，分別比F4晚1、3、4、6 d，F(xiàn)7、F1與F4相比菌絲總體表現(xiàn)較差，表現(xiàn)為菌絲長勢(shì)弱，菌絲生長緩慢，菌絲外觀品質(zhì)差，菌絲滿袋時(shí)間長。各配方頭潮菇平均產(chǎn)量表現(xiàn)為F4＞F5＞F3＞F6＞F2＞F7＞F1，配方F4栽培時(shí)頭潮菇袋平均產(chǎn)量最高，為152 g/袋。因此，配方F4栽培時(shí)榆黃蘑菌絲生長情況和頭潮菇袋平均產(chǎn)量綜合表現(xiàn)最佳，表明該配方中的楊木屑添加量最適宜栽培榆黃蘑，可作為后續(xù)試驗(yàn)的栽培配方。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 接種量對(duì)菌絲生長速度的影響 由圖1可知，隨著接種量的增大，菌絲的生長速度呈先上升后下降的變化，當(dāng)接種量為8%時(shí)，榆黃蘑菌絲的生長最快，速度為8.62 mm/d，優(yōu)于其他接種量。表明接種量過多或過少均不利于菌絲生長，接種量過低，培養(yǎng)袋內(nèi)菌量不足，易造成發(fā)菌困難和菌絲生長不良；接種量過高，培養(yǎng)袋內(nèi)營養(yǎng)和氧氣供應(yīng)不足，導(dǎo)致菌絲生長速度下降。因此，接種量為8%時(shí)榆黃蘑菌絲生長最佳。

2.2.2 pH對(duì)菌絲生長速度的影響 由圖2可知，隨著pH的增大，榆黃蘑菌絲的生長速度呈先上升后下降的變化，pH為6的條件下培養(yǎng)榆黃蘑時(shí)，菌絲的生長勢(shì)強(qiáng)，菌絲的生長速度達(dá)最高，為8.57 mm/d，優(yōu)于其他pH條件。表明培養(yǎng)料的pH偏高或偏低均對(duì)菌絲生長產(chǎn)生影響，pH低于5時(shí)會(huì)導(dǎo)致菌絲生長緩慢，特別是在菌絲的生長發(fā)育過程中還會(huì)形成酸性物質(zhì)，從而抑制菌絲生長，甚至導(dǎo)致菌絲停止生長。pH高于8時(shí)培養(yǎng)則發(fā)菌困難，影響菌絲的發(fā)育和數(shù)量。因此，利于榆黃蘑菌絲生長的最適宜酸性環(huán)境是pH為6。

2.2.3 溫度對(duì)菌絲生長速度的影響 由圖3可知，隨著培養(yǎng)溫度的升高，榆黃蘑菌絲生長速度呈先上升后下降的變化，當(dāng)培養(yǎng)溫度為25 ℃時(shí)，榆黃蘑菌絲生長速度達(dá)最高，為8.68 mm/d，高于其他培養(yǎng)溫度條件。表明菌絲生長階段不適宜的培養(yǎng)溫度不利于菌絲生長，培養(yǎng)溫度高于30 ℃時(shí)菌絲生長質(zhì)量差，溫度低于20 ℃時(shí)菌絲生長緩慢，過低甚至停止生長。因此，溫度為25 ℃時(shí)最適于榆黃蘑菌絲的生長。

2.2.4 培養(yǎng)料含水量對(duì)菌絲生長速度的影響 由圖4可知，隨著培養(yǎng)料含水量的上升，菌絲的生長速度呈先上升后下降的變化，當(dāng)含水量在65%時(shí)，菌絲生長速度最快，為8.25 mm/d，優(yōu)于其他含水量的培養(yǎng)條件。表明培養(yǎng)料的含水量過高或過低均對(duì)菌絲生長產(chǎn)生不利影響，含水量低于55%時(shí)，培養(yǎng)料失水干燥進(jìn)而抑制菌絲生長，含水量高于75%時(shí)，會(huì)加劇雜菌感染，且易造成病蟲害的發(fā)生。因此，培養(yǎng)料含水量為65%最適于榆黃蘑菌絲生長。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 建立擬合模型及方差分析 以菌絲生長速度為響應(yīng)值，依據(jù)Box-Behnken中心組合原理設(shè)計(jì)的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，結(jié)果見表4。根據(jù)結(jié)果進(jìn)行方差分析和二次多項(xiàng)回歸方程擬合，得到二元回歸方程：菌絲生長速度=9.31-0.84A+0.61B+1.22C+0.52D+0.41AB-0.22AC+0.44AD+0.57BC-0.65BD-0.34CD-1.27A2-0.85B2-1.21C2-0.95D2。

由表5可知，模型F為8.45，P為0.000 1，達(dá)極顯著水平，失擬項(xiàng)差異不顯著，綜合表明試驗(yàn)?zāi)Ｐ蛿M合良好，試驗(yàn)結(jié)果誤差小，該模型可用于榆黃蘑菌絲生長速度的優(yōu)化。據(jù)表中F值大小可知試驗(yàn)各因素對(duì)菌絲生長速度影響的強(qiáng)弱為C（溫度）>A（接種量）>B（pH）>D（培養(yǎng)料含水量），且A、B、C、A2、B2、C2、D2達(dá)極顯著差異，D為顯著差異，其余表現(xiàn)無顯著差異。

2.3.2 響應(yīng)面分析 圖5是各因素兩兩交互作用對(duì)菌絲生長速度影響的響應(yīng)面，曲面的彎曲程度反映了兩因素交互作用的影響程度。由圖5a可知，隨著pH增加，菌絲生長速度先上升后下降，隨接種量增加，菌絲生長速度下降，表明pH和接種量的交互作用對(duì)菌絲生長速度的影響不顯著；由圖5b可知，隨著溫度和pH的增加，菌絲生長速度先上升后下降，但變化幅度不大，等高線圖接近圓形，表明溫度和pH兩因素交互作用對(duì)菌絲生長速度影響不顯著；由圖5c可知，隨培養(yǎng)料含水量和pH的增大，菌絲生長速度增大，且變化幅度較大，兩因素交互作用影響不顯著，而AC、AD、CD兩兩因素之間交互作用更不明顯。

2.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果及驗(yàn)證試驗(yàn) 采用Design Expert 8軟件分析得到榆黃蘑菌絲生長最佳的培養(yǎng)條件為接種量7.36%、pH 6.55、溫度26.36 ℃、培養(yǎng)料含水量64.43%，菌絲生長速度為10.01 mm/d。為驗(yàn)證試驗(yàn)的可靠性，針對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，鑒于實(shí)際栽培生產(chǎn)的可操作性，將各培養(yǎng)條件調(diào)整為接種量7%、pH 6.5、溫度26 ℃、培養(yǎng)料含水量65%，試驗(yàn)3次重復(fù)，結(jié)果菌絲生長速度分別為10.03、9.96、9.99 mm/d，平均值為9.99 mm/d，與理論值接近，表明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的培養(yǎng)條件參數(shù)可靠，具備較好的參考價(jià)值。

3 小結(jié)與討論

試驗(yàn)通過對(duì)榆黃蘑菌絲體生長的培養(yǎng)條件進(jìn)行單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)，確定楊木屑和玉米秸稈熟料袋栽榆黃蘑最佳接種量、pH、溫度和培養(yǎng)料含水量的培養(yǎng)條件，其中培養(yǎng)條件中pH和溫度的結(jié)論與王偉等［21］液體發(fā)酵優(yōu)化和王殿振等［22］紅平菇培養(yǎng)條件優(yōu)化的研究結(jié)果較為一致，且溫度是菌絲體生長過程中最重要的影響因素，但前人研究溫度高于本研究，推測(cè)可能是由于固態(tài)熟料培養(yǎng)和液體發(fā)酵培養(yǎng)的差異。試驗(yàn)僅對(duì)榆黃蘑菌絲體生長階段進(jìn)行了研究，對(duì)于子實(shí)體生長階段的培養(yǎng)有待進(jìn)一步的試驗(yàn)探究。

試驗(yàn)通過調(diào)整培養(yǎng)主料楊木屑和玉米秸稈添加比例栽培榆黃蘑，結(jié)果表明，當(dāng)楊木屑添加量為30%，玉米秸稈添加量為50%時(shí)榆黃蘑菌絲的生長速度、菌絲長勢(shì)、菌絲外觀品質(zhì)和菌絲滿袋時(shí)間等指標(biāo)綜合表現(xiàn)最好，頭潮菇袋平均產(chǎn)量最高，優(yōu)于其他楊木屑添加比例，因此，處理F4為試驗(yàn)條件下栽培榆黃蘑最佳配方。在篩選出最佳榆黃蘑栽培配方的基礎(chǔ)上，對(duì)榆黃蘑菌絲生長過程中的接種量、pH、溫度和培養(yǎng)料含水量4個(gè)條件進(jìn)行單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，結(jié)果分析表明4個(gè)因素對(duì)榆黃蘑菌絲生長速度的影響大小為溫度＞接種量＞pH＞培養(yǎng)料含水量，最佳的培養(yǎng)條件為接種量7%、pH 6.5、溫度26 ℃、培養(yǎng)料含水量65%。通過試驗(yàn)優(yōu)化確定最佳的楊木屑和玉米秸稈熟料袋栽榆黃蘑培養(yǎng)條件，為黑龍江省榆黃蘑種植戶提供技術(shù)參考，提高食用菌種植戶的經(jīng)濟(jì)效益，對(duì)黑龍江省鄉(xiāng)村振興建設(shè)有重要意義。

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