白藜蘆醇調控SDF-1/CXCR4 通路對顳下頜關節骨關節炎模型大鼠軟骨細胞凋亡的影響*

陳萌萌，邢春花

（1.哈爾濱市第四醫院口腔科，哈爾濱 150026；2.哈爾濱市第四醫院檢驗科，哈爾濱 150026）

骨關節炎是一種進行性退行性疾病，常導致軟骨和周圍組織惡化，引起關節疼痛和功能障礙，顳下頜關節是受骨關節炎影響的最常見部位之一[1]。顳下頜關節骨關節炎（TMJOA）的特征包括進行性軟骨變性，軟骨下骨重塑異常和滑膜炎，并伴隨咀嚼困難、疼痛及頜面部畸形等癥狀[2]。軟骨細胞作為軟骨的常駐細胞，是維持軟骨基質穩態的關鍵介質，其細胞凋亡和功能損傷會破壞軟骨的穩態，加速骨關節炎的進程[3]。因此，研究軟骨細胞的凋亡機制對TMJOA 的治療有重要意義。基質細胞衍生因子-1（SDF-1）屬于α 趨化因子家族，是一種小分子量的趨化因子蛋白。CXC 趨化因子受體4（CXCR4）在多種組織和器官中廣泛表達，是SDF-1 的唯一特異性受體。當SDF-1 與CXCR4 特異性結合時，可以發揮多種生物學功能[4]。最近有研究顯示，SDF-1/CXCR4 在骨關節炎的發展中發揮重要作用，阻斷SDF-1/CXCR4 信號通路能夠抑制TMJOA 的成骨分化，減輕軟骨損傷[5-6]。白藜蘆醇（RES）是天然的多酚類物質，是植物在脅迫下產生的一種植物抗毒素，具有抗癌、抗氧化、抗炎等特性。前期有研究發現RES 可以有效改善炎癥損傷防止骨關節炎發展，減輕白細胞介素-1β 誘導的軟骨細胞損傷，同時也可以通過下調TMJOA 中的環氧化物酶2（COX-2）/核因子κB（NF-κB）信號通路，抑制軟骨細胞凋亡[7-8]。但有關細胞增殖和炎癥誘導COX-2 的機制還尚未得到證實。另一項研究顯示，COX-2 是SDF-1/CXCR4 軸下游信號通路的重要成員之一，SDF-1 能夠增強COX-2 的表達[9]。因此，本研究探討了RES是否能夠通過調控SDF-1/CXCR4 信號通路來抑制TMJOA 大鼠的軟骨細胞凋亡，為RES 成為TMJOA 的治療策略提供更充分的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF 級Wistar 大鼠36 只，6 周齡，（160±20）g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，許可證號：SCXK（遼）2020-0002。實驗前將所有大鼠置于溫度 26 ℃，濕度 60%的環境中飼養。

1.1.2 主要試劑 白藜蘆醇（HPLC≥98%，四川省維克奇生物科技有限公司）；AMD3100（貨號：HY-10046，美國MedChemExpress 公司）；重組SDF-1（貨號：ab9798，英國Abcam 公司）；蘇木精-伊紅（HE）染色液、改良番紅 O-固綠軟骨染色液（貨號：SY2022、SY1418，北京伊塔生物科技有限公司）；Annexin V-FITC/PI 雙染細胞凋亡檢測試劑盒（貨號：FY600003-20T，弗元生物科技有限公司）；一氧化氮合酶（iNOS）、一氧化氮（NO）、細胞色素C（Cyt C）酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測試劑盒（貨號：XYELISA0380、XY-SJH-2984、XY-SJH-3050，上海烜雅生物科技有限公司）；caspase-9、Bcl-2、Bax、SDF-1、CXCR4 兔單抗（貨號：ab32539、ab182858、ab32503、ab155090、ab124824，英國Abcam 公司）；山羊抗兔lgG（H+L）（貨號：AP31L014，和元李記生物技術有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 TMJOA 大鼠模型建立和分組處理 將所有大鼠隨機分為對照組、模型組、CXCR4 抑制劑組（AMD3100 組）、RES 低劑量組、RES 高劑量組、RES高劑量+重組SDF-1 組（RES 高+SDF-1 組），每組6 只。除對照組，其余組均通過在大鼠顳下頜關節上腔內注射12.5 μL 膠原酶建立TMJOA 模型[8]。1 周后，AMD3100 組關節腔內注射40 μL 濃度為1 μg/μL的CXCR4 抑制劑AMD3100[6]；RES 低、高劑量組關節腔內分別注射80 μL 濃度為1.25、12.5 μg/μL 的RES[10]，RES 高+重組SDF-1 組先注射80 μL 濃度為12.5 μg/μL 的RES，再注射劑量為30 μg/kg 的重組SDF-1，對照組和模型組用相同方式注射等量的生理鹽水，每周注射3 次，持續4 周。

1.2.2 細胞分離和培養 干預結束后，每組隨機選取3 只大鼠用1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉并處死，取顳下頜關節，用手術刀片輕輕刮取髁突軟骨組織層，然后將軟骨組織用無菌生理鹽水清洗，并剪成體積小于1 mm3的碎塊兒，用0.1%Ⅱ型膠原酶在37 ℃下消化5 h，然后吹打過濾后，2 000×g 離心 10 min，離心半徑10 cm，收集細胞用含有10%胎牛血清 DEME 培養基培養，24 h 后再次收集細胞立即進行后續實驗。

1.2.3 組織學染色觀察軟骨組織病理學變化 按照1.2.2 中的方法收集每組剩余大鼠的髁突軟骨組織，放入4%多聚甲醛中固定過夜，然后進行石蠟包埋并切片。接著按照常規步驟用二甲苯和梯度乙醇脫蠟水化，然后將組織切片分別放入HE 染色液和番紅 O-固綠染液中染色20 min，再次使用梯度乙醇脫水，二甲苯透明，最后中性樹脂封片。在光學顯微鏡下觀察髁突軟骨組織結構形態和基質蛋白多糖的變化，并參考文獻[11]中 Mankin 評分標準來評估軟骨組織損傷情況。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 將1.2.2 中收集的軟骨細胞用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗后，分別加入10 μL Annexin V-FITC 和10 μL 碘化丙啶（PI），室溫避光孵育15 min。用流式細胞儀分析細胞凋亡情況并計算細胞凋亡率。

1.2.5 ELISA 檢測細胞中 iNOS、NO、Cyt C 的水平將1.2.2 中收集的軟骨細胞，加入PBS 重懸后，4℃，2 000×g 離心 10 min，離心半徑10 cm，收集上清液。然后按照ELISA 試劑盒的操作步驟檢測軟骨細胞中 iNOS、NO、Cyt C 的含量。

1.2.6 蛋白免疫印跡分析（Western Blot）檢測軟骨細胞中 caspase-9、Bcl-2、Bax、SDF-1、CXCR4 蛋白表達 將1.2.2 中收集的軟骨細胞置于玻璃勻漿器中，加入蛋白裂解液勻漿，離心收集上清液，用BCA測定蛋白濃度。然后用10%SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白并轉移至PVDF 膜上。用5%脫脂牛奶將PVDF 膜在4 ℃下封閉過夜，隨后加入一抗稀釋液（caspase-9、Bcl-2、Bax 比例1∶1 000，SDF-1 比例1∶10 000，CXCR4 比例1：100），室溫孵育2 h 后加入羊抗兔IgG 二抗稀釋液（1∶500）中，室溫孵育2 h，最后用ECL 顯影。以GAPDH 為內參蛋白，用凝膠成像儀和Image J 軟件觀察并分析蛋白條帶灰度值。

1.3 統計學分析 本研究數據均采用Graphpad prism8.0 軟件統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q 檢驗，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠軟骨組織的病理學變化 對照組髁突軟骨組織結構層次清晰，軟骨細胞排列整齊，軟骨著色均勻，主要著色部位在軟骨淺層；與對照組比較，模型組軟骨組織層次紊亂，細胞數量減少，軟骨著色明顯減退，組織損傷評分增加（P＜0.05）；與模型組比較，AMD3100 組和RES 組軟骨組織結構層次逐漸明顯，細胞數量增多，軟骨著色增加，組織損傷評分減少（P＜0．05）；與RES 高劑量組比較，RES高+SDF-1 組軟骨組織的病理變化與模型組相似，組織損傷評分增加（P＜0．05），見圖1 和表1。

圖1 HE 和番紅O-固綠染色檢測各組大鼠軟骨組織損傷情況（×100）Fig.1 HE and saffron O-fast green staining were used to detect the damage of cartilage tissue in rats in each group(×100)

表1 各組大鼠軟骨組織的損傷評分比較（±s）Tab.1 Damage score of cartilage tissue in rats in each group（±s） 分

表1 各組大鼠軟骨組織的損傷評分比較（±s）Tab.1 Damage score of cartilage tissue in rats in each group（±s） 分

注：與對照組比較，*P＜0．05；與模型組比較，#P＜0．05；與AMD3100 組比較，△P＜0．05；與RES 高劑量組比較，▲P＜0．05。

?組別動物數Mankin 評分對照組63．21±0．79模型組612．46±1．63*AMD3100 組66．48±1．08#RES 低劑量組69．14±1．37#△RES 高劑量組66．32±0．93#RES 高+SDF-1 組611．74±1．48△▲

2.2 各組大鼠軟骨細胞的凋亡情況比較 與對照組比較，模型組軟骨細胞凋亡率增加（P＜0．05）；與模型組比較，AMD3100 組和RES 組軟骨細胞凋亡率降低（P＜0．05）；與RES 高劑量組比較，RES 高+SDF-1組軟骨細胞凋亡率增加（P＜0．05），見圖2 和表2。

圖2 流式細胞術檢測各組大鼠軟骨細胞凋亡Fig.2 Detection of chondrocyte apoptosis in each group of rats by flow cytometry

表2 各組大鼠軟骨細胞的凋亡率比較（±s）Tab.2 Apoptosis rate of rat chondrocytes in each group（±s） %

表2 各組大鼠軟骨細胞的凋亡率比較（±s）Tab.2 Apoptosis rate of rat chondrocytes in each group（±s） %

注：與對照組比較，*P＜0．05；與模型組比較，#P＜0．05；與AMD3100 組比較，△P＜0．05；與RES 高劑量組比較，▲P＜0．05。

?組別動物數細胞凋亡率對照組32．57±0．12模型組378．69±2．47*AMD3100 組323．97±1．12#RES 低劑量組356．42±1．53#△RES 高劑量組322．17±1．03#RES 高+SDF-1 組375．52±2．38△▲

2.3 各組大鼠軟骨細胞中 iNOS、NO、Cyt C 的水平比較 與對照組比較，模型組軟骨細胞中 iNOS、NO、Cyt C 含量升高（P＜0．05）；與模型組比較，AMD3100組和RES 組軟骨細胞中 iNOS、NO、Cyt C 含量降低（P＜0．05）；與RES 高劑量組比較，RES 高+SDF-1 組軟骨細胞中 iNOS、NO、Cyt C 含量升高（P＜0．05），見表3。

表3 各組大鼠軟骨細胞中iNOS、NO、Cyt C 水平比較（±s）Tab.3 Levels of iNOS，NO and Cyt C in chondrocytes of rats in each group（±s） pg/mL

表3 各組大鼠軟骨細胞中iNOS、NO、Cyt C 水平比較（±s）Tab.3 Levels of iNOS，NO and Cyt C in chondrocytes of rats in each group（±s） pg/mL

注：與對照組比較，*P＜0．05；與模型組比較，#P＜0．05；與AMD3100 組比較，△P＜0．05；與RES 高劑量組比較，▲P＜0．05。

組別對照組模型組AMD3100 組RES 低劑量組RES 高劑量組RES 高+SDF-1 組動物數333333 iNOSNOCyt C 18．67±2．2529．54±2．6954．92±3．36 65．39±3．42*94．61±3．72*127．79±4．86*30．14±2．39#43．42±2．53#70．67±3．47#46．82±3．16#△ 72．18±3．25#△91．41±4．52#△28．37±2．34#41．89±2．64#69．86±3．81#62．26±3．40△▲ 90．16±3．63△▲ 123．94±4．45△▲

2.4 各組大鼠軟骨細胞中 caspase-9、Bcl-2、Bax、SDF-1、CXCR4 蛋白的表達水平比較 與對照組比較，模型組軟骨細胞中 caspase-9、Bax、SDF-1、CXCR4蛋白表達升高，Bcl-2 蛋白表達降低（P＜0．05）；與模型組比較，AMD3100 組和RES 組軟骨細胞中 caspase-9、Bax、SDF-1、CXCR4 蛋白表達降低，Bcl-2 蛋白表達升高（P＜0．05）；與RES 高劑量組比較，RES 高+SDF-1組軟骨細胞中 caspase-9、Bax、SDF-1、CXCR4 蛋白表達升高，Bcl-2 蛋白表達降低（P＜0．05），見圖3 和表4。

圖3 各組大鼠軟骨細胞中caspase-9、Bcl-2、Bax、SDF-1、CXCR4 蛋白表達條帶Fig.3 Expression bands of caspase-9，Bcl-2，Bax，SDF-1 and CXCR4 in rat chondrocytes of each group

表4 各組大鼠軟骨細胞中caspase-9、Bcl-2、Bax、SDF-1、CXCR4 蛋白相對表達量（±s）Tab.4 Relative expressions of caspase-9，Bcl-2，Bax，SDF-1 and CXCR4 proteins in rat chondrocytes in each group（±s）

表4 各組大鼠軟骨細胞中caspase-9、Bcl-2、Bax、SDF-1、CXCR4 蛋白相對表達量（±s）Tab.4 Relative expressions of caspase-9，Bcl-2，Bax，SDF-1 and CXCR4 proteins in rat chondrocytes in each group（±s）

注：與對照組比較，*P＜0．05；與模型組比較，#P＜0．05；與AMD3100 組比較，△P＜0．05；與RES 高劑量組比較，▲P＜0．05。

組別動物數caspase-9/GAPDHBcl-2/GAPDHBax/GAPDHSDF-1/GAPDHCXCR4/GAPDH對照組30．81±0．061．03±0．060．92±0．070．90±0．060．95±0．08模型組31．89±0．13*0．32±0．02*2．10±0．14*1．97±0．14*2．15±0．16*AMD3100 組31．23±0．07#0．85±0．06#1．31±0．07#1．28±0．08#1．37±0．07#RES 低劑量組31．51±0．10#△0．57±0．04#△1．68±0．12#△1．62±0．12#△1．71±0．14#△RES 高劑量組31．21±0．07#0．86±0．07#1．29±0．06#1．27±0．07#1．36±0．08#RES 高+SDF-1 組31．87±0．12△▲0．34±0．02△▲2．08±0．15△▲1．96±0．15△▲2．13±0．15△▲

3 討論

TMJOA 是一種影響顳下頜關節最常見的慢性退行性關節炎疾病，主要特征是軟骨細胞死亡、ECM 降解和軟骨下骨重塑。顳下頜關節髁突軟骨變性與TMJOA 的發展密切相關。軟骨逐漸變性是由軟骨細胞調節不當以及組織破壞與生成之間的不平衡引起的，髁突軟骨細胞作為顳下頜關節髁突軟骨中唯一的細胞類型，在軟骨變性過程中起著決定性作用[12-13]。研究顯示軟骨細胞更新的增加引發了髁突軟骨的退化，細胞凋亡和壞死性凋亡加速了關節軟骨的破壞。軟骨細胞的異常死亡不僅會減少軟骨細胞的數量，還會引發軟骨的退化和軟骨下骨的破壞[14]。因此，抑制軟骨細胞凋亡是保護軟骨組織免受損傷的重要途徑。本研究首先通過HE 和番紅 O-固綠染色檢測TMJOA 髁突軟骨組織的損傷情況，結果顯示模型組軟骨組織結構層次紊亂，細胞數量減少，軟骨著色明顯減退，損傷評分升高，揭示了TMJOA 大鼠模型建立成功。而RES 低、高劑量組軟骨組織結構層次逐漸明顯，細胞數量增多，軟骨著色增加，損傷評分降低，揭示了RES 可以緩解大鼠的軟骨組織損傷。接著分離軟骨細胞檢測細胞凋亡情況，結果顯示模型組細胞凋亡率高于對照組，RES低、高劑量組細胞凋亡率低于模型組，揭示了RES可以抑制TMJOA 大鼠髁突軟骨細胞的凋亡，減輕關節軟骨的損傷。

鈣在軟骨細胞凋亡中也存在非常重要的作用，細胞內高濃度鈣可以激活誘導型iNOS，從而誘導NO抑制線粒體呼吸，并通過釋放Cyt C 和caspase-9導致軟骨細胞凋亡[15]。已知Bcl-2 超家族成員也是細胞凋亡的關鍵調節者，該超家族可分為促凋亡和抗凋亡成員，促凋亡成員如Bax 主要位于細胞質中，抗凋亡成員如Bcl-2 本身主要定位于線粒體外膜[16]。本研究結果顯示，與對照組比較，模型組軟骨細胞中 iNOS、NO、Cyt C 含量及Bax 蛋白表達升高，Bcl-2 蛋白表達降低；而RES 低、高劑量組iNOS、NO、Cyt C 含量及Bax 蛋白表達升高，Bcl-2 蛋白表達升高。揭示了RES 可以抑制TMJOA 大鼠髁突軟骨細胞中的鈣濃度及促凋亡因子的表達，從而抑制軟骨細胞凋亡，減輕 TMJOA 的軟骨損傷。

SDF-1 是一種與炎癥相關的細胞因子，在鄰近關節軟骨的滑膜中被發現，來自滑膜的外源SDF-1可以與軟骨細胞膜上的G 蛋白偶聯受體CXCR4 結合，隨后進入軟骨細胞并調節軟骨細胞的增殖、存活、分化和成熟[17-18]。有研究證明SDF-1 與CXCR4的結合通過誘導基質金屬蛋白的分泌導致骨關節炎軟骨細胞基質的降解，且SDF-1/CXCR4 可誘導過度功能矯形引起的TMJOA 成骨分化并導致軟骨降解[6]。已知CXCR4 的抑制劑AMD3100 已有效用于治療骨關節炎，也可以減輕碘乙酸鈉誘導的TMJOA的嚴重程度[19-20]。因此，本研究將AMD3100 作為陽性對照，結果顯示，模型組軟骨細胞中 SDF-1 和CXCR4 的蛋白表達明顯高于對照組，RES 低、高劑量組細胞中 SDF-1 和CXCR4 的蛋白表達明顯低于模型組，AMD3100 組細胞凋亡率、凋亡相關因子mRNA 水平和SDF-1、CXCR4 蛋白表達與RES 高劑量組差異無統計學意義，揭示了RES 可以抑制SDF-1 與受體CXCR4 結合，其作用與AMD3100 作用一致。在RES 高劑量的基礎上進一步加入重組蛋白SDF-1，SDF-1 表達的升高逆轉了RES 對信號通路以及軟骨細胞凋亡的抑制作用。揭示了RES 可能是通過阻斷SDF-1/CXCR4 信號通路來抑制TMJOA大鼠軟骨細胞的凋亡。

綜上所述，RES 可以通過阻斷SDF-1/CXCR4信號通路抑制TMJOA 大鼠軟骨細胞的凋亡。本研究為尋找治療TMJOA 的潛在藥物提供了新思路和治療策略。但骨關節炎中軟骨細胞凋亡的機制比較復雜，因此RES 對骨關節炎軟骨細胞中的凋亡機制還有待進一步深入研究。