基于雷公藤和雷公藤多苷片提取物肝毒性檢測的微流控肝器官芯片技術研究

林嘉偉，楊依霏，夏 冰，李 春，盧晨娜，張 亞，劉 婷

中國中醫科學院 中藥研究所，北京 100029

隨著藥品種類的不斷增加，藥源性肝損傷（druginduced liver injury，DILI）發生率呈逐年增加趨勢，針對DILI 的發病機制、預測、預防和診斷的研究亟待加強。中草藥是亞太地區（韓國、新加坡）引起DILI最為主要的藥物，已逐漸成為DILI 的主要病因[1]。文獻研究顯示，中藥藥源性肝損傷（herb-induced liver injury，HILI）占臨床全部藥物損傷的2.6%～4.8%，在全部DILI 中的構成比約為20%[2]；在韓國，有27.5%的DILI 患者是由于攝取“草藥”導致的[3]。在臨床前和臨床試驗階段，肝毒性問題也已成為藥物研發失敗及藥物上市后召回的最主要原因之一。而中藥由于成分及代謝產物復雜多樣，作用機制多元化，藥材、產地、炮制、加工、提取等諸多影響因素導致結果的不確定性，導致研究風險的進一步增加。由于中藥具有成分復雜、多靶點、多效應等特點，在對其進行臨床評價上，有一定的局限性。因此，構建敏感可靠的肝毒性評價模型，進行充分的臨床前藥物毒性研究，是減少DILI 發生的最有效途徑[1]。

以2D 細胞或動物為標準進行臨床前藥物毒性預測和評價仍是目前的主流技術。基于中藥有效物質濃度低、多靶點、網絡式整體調控的特點，使用傳統的體外研究方法（如細胞2D 培養體系）無法完全滿足現代生命科學體系下中藥毒性機制研究的需求，而體內實驗又存在著種屬的巨大差異和靈敏度較差的問題。故亟需找到一種更為靈敏、準確、快速、接近體內代謝過程，可實時動態監測細胞功能和結構變化，全面評估藥物作用特點的新模型用于中藥的肝毒性評價。基于微流控芯片技術研制的器官芯片（organ-on-chip，OOC），可在體外模擬多種活體細胞、組織器官微環境，反映人體組織器官的主要結構和功能特征，不僅滿足了中藥長期多次給藥的研究需求，還可實現實時動態監測細胞內各項藥物毒性相關指標，因此受到廣泛關注。相較體外2D 細胞或體內動物實驗，3D 體外器官模型的使用，不僅會減少動物的使用，減少倫理問題的發生，同時還具有穩定性和可重復性的優點[4]。美國食品藥品監督管理局，首次允許新藥申報資料中以器官芯片模型代替動物模型對藥物進行藥效學評價，并在此之后批準該治療“慢性自身免疫性脫髓鞘行神經病”的新藥上市[5-6]。

1985 年Smith 等[7]首次使用3D 體外肝臟模型構建了藥物毒性實驗，但受到不能及時供應大量營養物質、肝臟受損后48 h 內激活纖維化進程等局限性，該模型僅維持了72 h。隨著科技的發展，在2008年Vickerman 等[8]把微流控芯片技術和細胞相結合，在體外成功的模擬了血管生成過程中的微環境。2023 年Vega 等[9]證明將肝切片和微流控芯片技術相結合，使精密肝切片可以在體外存活31 d。大大提高了3D 體外肝臟模型存活的時間。本研究構建的肝器官芯片是通過震蕩切片機從肝臟中分離出來的組織薄片，精密肝切片保留了肝臟的實質細胞、非實質細胞（星狀細胞、枯否細胞等）、小膽管、肝小葉中央靜脈、肝竇周狄氏腔（Disse 腔）等，所有細胞類型及完整結構，使得其失去代謝能力的速度比一般原代細胞體外培養要慢，更有利于體外培養和藥物毒性檢測。

雷公藤是衛矛科植物雷公藤Tripterygium wilfordiiHook. f.的干燥根，始載于《神農本草經》，具有祛風除濕、活血通絡、消腫止痛、殺蟲解毒的功效。現代研究發現，雷公藤具有抗腫瘤、抗炎、免疫抑制等作用，同時也可引起多器官的損害，其中肝毒性是雷公藤報道較多的毒性反應之一[10-13]。雷公藤多苷片是從雷公藤有效部位中提取的中藥制劑，是我國首先研究利用的抗炎免疫調節天然藥物制劑，有“中草藥激素”之稱，被列為國家基礎藥物中的免疫抑制劑，被世界衛生組織認定為治療關節炎的“中國首創植物新藥”，良好的療效使其在臨床中應用廣泛[14-16]。雷公藤及其制劑均可引起DILI，2012 年國家食品藥品監督管理總局在第46期藥品不良反應信息通報中，特別提出要關注雷公藤及其制劑的用藥安全[17]。雷公藤及其制劑引發的肝損傷在臨床上表現相似，患者表現出食欲不振、乏力、惡心、嘔吐、尿黃、皮膚和鞏膜黃染等癥狀，并存在肝臟腫大、有壓痛及血清丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）、總膽紅素（total bilirubin，TBil）升高等臨床表征[18]。

本研究通過使用可明確造成肝損傷的雷公藤醇提物（Tripterygiumwilfordiiextract，TWE）和其制劑雷公藤多苷片提取物（Tripterygium Glycosides Tablet extract，TGE）為工具藥，基于微流控器官芯片系統，通過肝毒性敏感生物標志物檢測和病理組織學觀察，比較了2 種培養載體（精密肝切片、HepaRG 細胞）在3 種培養體系中（微流控-HepaRG細胞、靜態-精密肝切片、微流控-精密肝切片）的差異性，以期為中藥肝毒性評價提供更為靈敏和可靠的新型技術模型。

1 材料

1.1 動物與細胞

SPF 級雌性SD 大鼠，體質量120 g～180 g，6周齡，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK（京）2021-0011。動物飼養于中國中醫科學院中藥研究所中藥安全評價中心屏障環境動物實驗室，實驗設施許可證號SYXK（京）2020-0042，溫度20～26 ℃，相對濕度40%～70%，人工光照12 h 明暗周期，動物自由飲水進食。本實驗中，對動物實驗的必要性、動物數量、實驗過程中動物預期受到的傷害、動物福利等內容經中國中醫科學院中藥研究所實驗動物福利倫理委員會審查批準，批件編號為2022A012、2022A015。

人肝原代細胞系的終末分化肝細胞（HepaRG細胞）、人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs），均購自商城北納創聯生物科技有限公司。

1.2 藥品與試劑

雷公藤（批號2105001）購自安國市昌達中藥飲片有限公司，經中國中醫科學院中藥研究所李春研究員鑒定為衛矛科植物雷公藤T.wilfordiiHook. f.的干燥根；雷公藤多苷片（批號20230202）購自湖南千金協力藥業有限公司；DMEM 培養基（批號8122548）、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，批號16140089）、胰蛋白酶（含EDTA，批號25200072）、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS，pH 7.4，批號8122302）購自美國Gibco 公司；青霉素-鏈霉素雙抗（批號15070063）購自索萊寶生物科技有限公司；瓊脂糖（批號192235）購自上海百濟神州生物科技有限公司；纖連蛋白（批號MQC2521071）購自美國R&D Systems 公司；ALT試劑盒、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒、谷氨酰轉移酶（gamma glutamyl transferase，GGT）試劑盒、總膽汁酸（total biliary acid，TBA）試劑盒、TBil 試劑盒均購自北京安圖生物工程股份有限公司，批號分別為10713D11、01023C11、10202E11、110810C11、10128A11；CCK-8 試劑盒（批號VE575）購自東仁化學科技（上海）有限公司；對照品雷公藤內酯甲、雷公藤甲素（質量分數＞98%，批號分別為 RDD-L06002009017、RDDL00402111018）均購自成都瑞芬思德丹生物科技有限公司。

1.3 儀器

Vibratome1000 Plus 型震蕩切片機（美國Vibratome 公司）；BCM-1000A 型單人超凈臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；HERA Cell CO2培養箱（德國BINDER 公司）；TBA-120FR 型全自動生化檢測儀（日本佳能公司）；SYNERQY Ⅲ型多功能酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）；Histo-Tek VP1型全封閉組織脫水機（河南中寶醫療器械銷售有限公司）；Tissue-Tek TEC5 型石蠟包埋機（日本櫻花公司）；HistoCore BIOCUT 型輪轉式切片機（德國Leica 公司）；Shandon Varistain Gemini 型全自動染色機（賽默飛世爾科技有限公司）；Olympus BX51型顯微鏡及圖像分析系統（日本奧林巴斯公司）；Mimicup 灌流系統（上海新微科技有限公司）；Waters e2695 型高效液相色譜儀（包括在線脫氣機、四元梯度洗脫泵、自動進樣器、柱溫箱、2695 型溶劑管理系統、2998 型二極管陣列檢測器和Empower 色譜工作站（美國 Waters 公司）；XS105DU 型十萬分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

2 方法

2.1 TWE 的制備

精密稱取雷公藤飲片粉末100.00 g，放置到燒杯，加入1000 mL 95%乙醇，蓋上保鮮膜，放置過夜（約16 h），超聲處理45 min，放冷至室溫，濾過，濾渣用500 mL 95%乙醇潤洗2 遍，合并濾液，用旋轉蒸發儀減壓回收至無醇味，放置在冰箱中冷藏，用冷凍干燥機凍干成粉。得TWE 粉末5.01 g，藥物得率為5.01%。經高效液相色譜檢測分析，TWE（5.01 g）中雷公藤內酯甲的質量為268.79 mg，質量分數為5.365%。

2.2 TGE 的制備

20 片雷公藤多苷片稱定質量，為1.415 2 g，研細，置于具塞三角瓶中，加入30 mL 無水乙醇，超聲提取（功率400 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，濾過，濾液回收至干，稱定質量，得TGE 121.90 mg，提取率為8.60%。經高效液相色譜檢測分析，TGE（121.90 mg）中雷公藤內酯甲的質量為0.487 8 mg，質量分數為0.400%；雷公藤甲素的質量為0.119 4 mg，質量分數為0.097 9%。

2.3 CCK-8 細胞毒性檢測

HepaRG 細胞以含10% FBS、1%雙抗的DMEM培養液常規培養，取對數生長期的細胞，胰酶消化后進行細胞計數，以1×105個/mL 接種于96 孔板，在37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養24 h 后給藥。TWE 和TGE 用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）助溶，DMSO 終體積分數為0.5%，以含有0.5% DMSO 的DMEM 培養液為對照組，TWE 組的藥物質量濃度梯度設為0.20、0.39、0.78、1.56、3.12、6.25、12.50 mg/mL（以生藥量計），TGE 組的藥物質量濃度梯度設置為7.81、15.62、31.25、62.50、125.00、250.00、500.00 μg/mL。藥物孵育24 h 后，吸棄上清液，每孔加入CCK-8 溶液110 μL，37 ℃培養箱孵育30 min 后，450 nm 處測定吸光度（A）值，計算藥物對細胞的抑制率和半數抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50），并選擇對HepaRG 細胞無明顯抑制濃度、IC30～40、＞IC50的劑量進行后續實驗。

2.4 精密肝切片的制備

將SD 大鼠脫頸椎處死，在無菌條件下取出肝臟，用預冷的DMEM 培養基漂洗3 次后，置于預先以氧飽和并不斷通入氧氣（95% O2、5% CO2）的DMEM 培養基中。按照文獻方法[19]制備厚度300 μm、直徑6 mm 的精密肝切片。

2.5 靜態培養體系的構建

將上述制備的精密肝切片置于96 孔板中，設0.5% DMSO 對照組，TWE（0.30、0.60、1.20 mg/mL，以生藥量計）組和TGE（31.25、62.50、125.00 μg/mL）組，分別與精密肝切片共培養，37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h 后，用于檢測。

2.6 微流控培養體系的構建

芯片為5 層4 通道結構。第1 層為聚碳酸酯（polycarbonate，PC）材質的芯片培養小室，第2 層為細胞培養室底部聚對苯二甲酸乙二醇酯膜（polyethylene terephthalate，PET）的上面，上述2層構成整個芯片的上層，用于HepaRG 細胞/大鼠精密肝切片的培養；第3 層為細胞培養室PET 膜的底面，用于HUVECs 的培養，第4 層為PC 材質的芯片流道板，該流道板上層為芯片培養小室的基座，下層包含豆莢狀流道，為培養液的流動層，上述3、4 層構成整個芯片的中層；第5 層為聚甲基丙烯酸甲酯（polymethylmethacrylate，PMMA）材質薄膜，構成了整個芯片的下層。將芯片流道板與PMMA 薄膜進行緊密封接，上、中層之間不進行封接直接進行各個部件的組裝后，通過灌流管路系統連接微量蠕動泵及控制器，從而構成1 個芯片結構（圖1-A）。在無菌條件下將PET 膜底面用100 μL 的10 μg/mL 纖連蛋白預處理3 h，PBS 沖洗底面，以5×105個/mL 的密度接種HUVECs，接種體積100 μL/孔。12 h 后，翻轉扣入已預先封裝有PMMA 底膜的芯片流道板凹槽中，PET 膜上面以5×105個/mL 的密度，100 μL/孔的接種體積，接種HepaRG 細胞作為微流控-HepaRG 細胞培養體系的培養物（圖1-B）或按“2.4”項下方法制備的精密肝切片（圖1-C），連接灌流管路系統，打開微流體控制器調整微量蠕動泵體積流量為251 μL/min[20]。置于37 ℃、5% CO2的培養箱培養12 h 后，TWE 組和TGE 組分別以含0.30、0.60、1.20 mg/mL（以生藥量計）和31.25、62.50、125.00 μg/mL 受試物的DMEM 培養液（含0.5% DMSO）為循環液進行灌流，同時芯片培養小室內加入上述含藥培養液150L；對照組的循環液和皿內液均為含0.5% DMSO的DMEM 培養液。37 ℃、5% CO2培養箱中繼續培養24 h 后，用于后續檢測。

2.7 肝損傷標志物的檢測

取培養上清，使用全自動生化分析儀對肝細胞損傷相關的生物標志物ALT、LDH，膽管損傷的生物標志物GGT，肝膽排泄功能相關的生物標志物TBil、TBA 進行檢測。

2.8 精密肝切片組織病理學檢查

將培養后的精密肝切片置于4%中性多聚甲醛中固定7 d，常規蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色后，利用光學顯微鏡進行組織病理學檢查。

2.9 細胞形態學觀察

取鋪有HUVECs 或HepaRG 細胞的PET 膜，將有細胞附著的一側朝上，浸入4%中性多聚甲醛中固定30 min，隨后吸去固定液，行常規HE 染色，利用光學顯微鏡進行細胞形態學觀察

2.10 統計學分析

3 結果

3.1 CCK-8 細胞毒性檢測的結果

如圖2 所示，隨著TWE 和TGE 的濃度升高，對HepaRG 細胞增殖的抑制作用加強，呈劑量相關性。TWE 0.39 mg/mL 及以下質量濃度對HepaRG 細胞生長無明顯抑制作用，0.78 mg/mL 及以上質量濃度則明顯抑制HepaRG 細胞的生長（P＜0.01），IC50為0.99 mg/mL；TGE 31.25 μg/mL 及以下質量濃度對HepaRG 細胞生長無明顯抑制作用，62.50 μg/mL及以上質量濃度則明顯抑制HepaRG 細胞的生長（P＜0.001），IC50為109.57 μg/mL。根據以上實驗結果，后續實驗中TWE 的質量濃度設定為0.30、0.60、1.20 mg/mL，TGE 的質量濃度設定為31.25、62.50、125.00 μg/mL，均為對細胞無影響的抑制濃度、IC30～40、＞IC50的濃度。

圖2 HepaRG 細胞毒性檢測結果Fig. 2 Results of HepaRG cell cytotoxicity

3.2 TWE 和TGE 對3 種培養體系中培養載體肝損傷標志物的影響

3.2.1 2 種培養載體在正常培養條件下的比較 確定在正常培養情況下（不含藥），2 種培養載體之間肝損傷標志物的表達差異性。將2 種精密肝切片培養體系的對照組與微流控-HepaRG 細胞培養體系的對照組進行比較（表1、2），結果表明2 種精密肝切片培養體系的ALT、LDH 和TBA 的表達均明顯高于微流控-HepaRG 細胞培養體系（P＜0.05、0.01、0.001）；微流控-精密肝切片培養體系GGT 的表達有高于微流控-HepaRG 細胞的情況（P＜0.05），靜態-精密肝切片培養體系GGT 的表達有低于微流控-HepaRG 細胞培養體系的情況（P＜0.05）；2 種培養載體TBil 的表達均未見顯著性差異。

表1 TWE 對不同培養體系肝損傷生物標志物的影響Table 1 Effect of TWE on biomarkers of liver injury in different culture systems

表2 TGE 對不同培養體系肝損傷生物標志物的影響Table 2 Effect of TGE on biomarkers of liver injury in different culture systems

3.2.2 TWE 和TGE 對3 種培養體系肝損傷標志物的影響 根據雷公藤在臨床造成肝損傷特點，從肝損傷生物標志物角度，比較微流控-精密肝切片培養體系、靜態-精密肝切片培養體系、微流控-HepaRG細胞培養體系的差異性。

在ALT 的分泌方面，與各自體系中對照組比較，微流控-精密肝切片培養體系中TWE、TGE 的培養上清中ALT 活性呈劑量相關性升高。其中，TWE 和TGE 高劑量組的升高具有統計學意義（P＜0.05）。在靜態-精密肝切片培養體系中，中劑量的TGE 雖可導致ALT 的顯著升高（P＜0.05），但未見劑量相關性。微流控-HepaRG 細胞培養體系與對照組比較未見統計學意義。

在LDH 的分泌方面，微流控-精密肝切片培養體系中，TWE 的中、高劑量組、TGE 的高劑量組培養上清中LDH 的升高與各自的對照組比較有統計學意義（P＜0.01），且呈現出一定的劑量相關性；微流控-HepaRG 細胞培養體系中TGE 高劑量組和靜態-精密肝切片中TGE 中劑量組培養上清的LDH有顯著升高（P＜0.05），但僅在微流控-精密肝切片培養體系中，TWE 和TGE 導致的LDH 的升高表現出一致性且具有一定的量-毒關系，顯示出微流控-精密肝切片培養體系具有良好的敏感性和準確性。

在GGT 的分泌方面，微流控-精密肝切片培養體系和微流控-HepaRG 細胞培養體系表現一致，均呈現劑量相關性。其中，微流控-精密肝切片培養體系中TWE 和TGE 的高劑量組，微流控-HepaRG 細胞培養體系中TWE 的高劑量組和TGE 中、高劑量組的GGT 活性與對照組比較均有顯著升高（P＜0.05、0.01、0.001）。而靜態-精密肝切片培養體系各組與對照組比較未見統計學差異。

在TBil 和TBA 的分泌方面，與對照組比較，微流控-精密肝切片培養體系中，TWE 和TGE 3 個劑量組TBil 和TBA 均有一定程度的升高。其中TWE 高劑量組的TBil 表達量顯著升高（P＜0.05），TWE 和TGE 的低、中、高劑量組與各自對照組比TBA 的分泌雖有升高，但沒有顯著差異。靜態-精密肝切片培養體系和微流控-HepaRG 細胞培養體系中TBA 和TBil 未見升高趨勢。

3.3 TWE 和TGE 對3 種培養體系中培養載體形態學的影響

3.3.1 TWE 和TGE 對HepaRG 細胞形態學的影響如圖3 所示，在微流控-HepaRG 細胞培養體系中，對照組及TWE 低、中劑量組和TGE 低、中劑量組的HepaRG 細胞形態均未見顯著異常，TWE 高劑量組及TGE 高劑量組HepaRG 細胞排列稀疏，數量減少，部分細胞形態不規則，可見染色質邊移或細胞核碎裂現象。

3.3.2 TWE 和TGE 對大鼠精密肝切片組織形態學的影響 如圖4 所示，微流控-精密肝切片培養體系中，對照組肝組織結構未見顯著異常，TWE 低劑量組肝組織局灶性肝細胞輕微腫脹，中、高劑量組可見局灶性至片狀肝細胞腫脹，核質分界不清晰，部分細胞核消失。在靜態-精密肝切片培養體系中，對照組肝組織結構未見顯著異常，TWE 低、中、高劑量組均出現局灶性肝細胞腫脹，局灶性細胞核溶解、消失。

如圖5 所示，微流控-精密肝切片培養體系中，對照組肝組織結構未見顯著異常，TGE 低劑量組肝竇輕微擴張，中劑量組肝竇輕微擴張，個別肝細胞核固縮，高劑量組可見局灶性肝細胞腫脹、肝竇擴張，局灶性肝細胞核溶解。在靜態-精密肝切片培養體系中，對照組肝細胞局灶性腫脹、變性，低劑量組出現片狀肝細胞壞死、肝細胞索紊亂、部分肝細胞腫大，TGE 中、高劑量組均出現片狀肝細胞核溶解消失、肝細胞壞死、肝索紊亂、肝竇輕度至中度擴張。綜上，微流控-精密肝切片培養體系中，肝損傷程度與劑量呈現一定的相關性，而在靜態-精密肝切片培養體系中未見明顯的量-毒關系。靜態-精密肝切片培養體系中TWE 和TGE 對照組的肝組織形態較微流控-精密肝切片培養體系TWE 和TGE 的對照組有輕微損傷。

圖5 TGE 對大鼠精密肝切片的影響 (HE, ×400)Fig. 5 Effect of TGE on precision-cut liver slice of rats (HE, × 400)

3.4 TWE 和TGE 對微流控培養體系中HUVECs的形態學觀察

如圖6 所示，TWE 和TGE 對微流控培養體系中HUVECs 形態未見明顯影響，細胞生長呈梭形，排列緊密，細胞邊緣整齊，分界清楚，核質比正常，說明整個仿生培養體系狀態良好。

4 討論

中藥藥物毒性檢測目前基本仍以傳統2D 體外細胞模型和動物整體模型為主，新技術、新方法在中藥毒性評價上的應用有很大的提升空間。傳統體外細胞模型生理結構和細胞行為與原代細胞差異較大，且單一細胞不能完全模仿肝細胞在體內的天然功能[21]。動物整體模型可以很好地模擬藥物在體內的代謝過程，研究表明，在使用動物進行藥物肝毒性評價時，其準確率可達71%[22]。雖然精確度已經很高，但其存在實驗周期長、個體差異性大以及靈敏度不夠等問題，可能耗時耗力的一項研究結果最終仍會與臨床實際結果產生偏差。所以在臨床使用時，仍會出現DILI 的情況，而且中藥成分的復雜性可能會使這種不確定性進一步增加。因此，中藥毒性評價迫切需要更為靈敏、準確、高效、快速的檢測模型用于中藥毒性評價。

雷公藤及其制劑引發肝毒性在臨床上多有報道，且在動物實驗中亦經多位學者證實，課題組前期研究發現連續給予大鼠189.00、472.50 mg/kg 的雷公藤多苷3 周，可引起不同程度的肝損傷，其中雷公藤多苷472.50 mg/kg 組肝損傷更為嚴重，給藥3 周較給藥1 周時肝毒性更顯著，具有一定的劑量-時間-效應關系[23-24]。雷公藤在臨床上引發的肝損傷，患者多以發熱乏力、口干口苦、食欲減退、黃疸等癥狀為主，并伴有ALT、天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、GGT、TBil、TBA 等肝功能損傷生物標志物表達量的增高[25-26]。在羅瓊等[27]對635 例由雷公藤引起的肝損傷患者進行調查研究發現，67.05%的肝損傷患者被診斷為是膽汁淤積型肝損傷。基于雷公藤在臨床引發的肝損傷特點，在本研究中，選擇對肝細胞損傷相關的生物標志物ALT、LDH，膽管損傷的生物標志物GGT，肝膽排泄功能相關的生物標志物TBil、TBA 進行檢測，以比較TWE 和TGE 誘導的肝損傷在3 種不同培養體系下的表現。

ALT 主要存在于肝細胞中，ALT 由于具有高敏感度的特點，相較AST 更適合作為DILI 的參考指標；LDH 則廣泛存在于多種組織和器官中，是靈敏的非特異性肝損傷指標[28-29]。在肝細胞受到損傷后，2 種酶都會被排出到細胞外，使得在血液/組織液中的含量增加。3 種培養體系中，TWE 和TGE 與精密肝切片共孵育后，微流控-精密肝切片培養體系的肝損傷標記物ALT 和LDH，明顯高于微流控-HepaRG 細胞培養體系中的表達量，且在微流控-精密肝切片培養體系中可觀察到呈劑量相關性升高，在其他2 種培養體系中均未見，說明其更靈敏和準確。GGT 主要存在于膽管上皮細胞（也稱為膽細胞）中，當膽管上皮細胞受損時，血液/組織液中的GGT含量會升高，而HepaRG 細胞自身對GGT 亦具有高表達、高分泌的特性[30]。研究顯示，GGT 的增加與ALT 的增加呈正相關[26]。本實驗證實，基于微流控的2 種培養載體，HepaRG 細胞和精密肝切片在細胞受損后，GGT 的表達量均能表現出劑量相關性升高，但只在精密肝切片培養體系中表現出與ALT指標的一致性；靜態-精密肝切片培養體系相較微流控體系，GGT 表達量較低且未見量-毒關系。說明GGT 是檢測受試物造成的膽管損傷中較為靈敏的指標，在實驗中也對膽管損傷的另一生物標志物ALP 進行了檢測，但該生物酶在3 種培養體系中的含量均較低，有學者研究認為，在大鼠的膽汁淤積相關的膽管損傷的判定中，GGT 是比ALP 更具有特異性的指標[31-32]。

肝臟是TBil 的主要代謝場所，檢測TBil 水平有助于對肝臟整體功能的評估[33]。TBil 是直接膽紅素和間接膽紅素的總和，衰老的紅細胞在吞噬細胞的作用下，分解血紅蛋白產生間接膽紅素，并在肝臟通過葡萄糖醛酸化代謝產生直接膽紅素。除了精密肝切片中肝血竇內保留了一定數量的血細胞之外，由培養基模擬的血流無法為培養物提供TBil 合成原料，這可能是3 種培養體系中TBil 的含量均較低的原因，這也是體外實驗的局限所在，但3 種體外培養體系中，僅在微流控-精密肝切片培養體系中發現TBil 隨著TWE 和TGE 濃度的升高而顯示出一定的增加趨勢，而其余2 種培養體系中未見。

膽汁酸是一類膽固醇的代謝物，肝臟是合成膽汁酸的主要場所。任何能引起肝細胞和膽管細胞損害的因素均可導致膽汁酸的積累。HepaRG 細胞不具有膽汁酸合成能力，在培養體系中含量極低，幾乎不能檢出。2 種精密肝切片培養體系中，TBA 的含量明顯較微流控-HepaRG 細胞培養體系的含量高出數倍之多。與微流控-HepaRG 細胞培養體系對照組的TBA 相比，微流控-精密肝切片培養體系對照組和靜態-精密肝切片培養體系對照組的TBA 均有顯著性差異。說明膽汁酸合成能力能在2 種精密肝切片培養體系中均有良好體現，其中在微流控-精密肝切片培養體系的TWE 和TGE 高劑量組相較微流控-精密肝切片TWE 和TGE 的對照組，分別升高104.30%和46.00%，但可能較大的數據離散度導致統計學差異的不顯著性。

肝竇內皮細胞在調節肝竇血流與周圍肝組織物質交換中具有重要作用[34]。在本研究中用到的微流控-精密肝切片、靜態精密肝切片、微流控-HepaRG細胞體系中，HUVECs 被鋪于培養小室的一側仿生肝竇內皮屏障。在本研究體系中，仿生肝竇內皮屏障的完整性是后續科學、準確地利用微流控肝器官芯片培養體系進行藥物毒性評價的保障。本實驗中經TWE 和TGE 的低、中、高劑量灌流培養24 h后，通過HUVECs 細胞形態學觀察可知，附著在PET 膜上的HUVECs 細胞層均保持了較好的細胞形態，細胞排列緊密，細胞輪廓清晰，胞質豐滿，質、核分界清晰，證明仿生培養體系中肝竇內皮屏障完好，可用于微流控肝器官芯片培養體系對TWE和TGE 的肝毒性評價。在此仿生培養條件下，微流控-精密肝切片培養體系的對照組肝組織結構未見顯著異常，中央靜脈、肝竇、肝索結構清晰，未見明顯變性、壞死及炎癥細胞浸潤，隨著受試物濃度的增加，呈現出損傷程度的逐漸加重，表現出良好的量-毒關系，而該劑量相關性關系在靜態-精密肝切片培養體系中未見，且靜態-精密肝切片培養體系的對照組肝組織部分局灶性腫脹、變性。

自1980 年克魯姆迪克首次利用震蕩切片機制備組織薄片以來，精密器官切片由于其保留與體內相近的細胞種類、細胞3D 組織結構、細胞與細胞之間相互作用機制而被認為具有替代傳統肝細胞2D 培養模型的潛力的新模型之一，日漸廣泛的應用于生物醫學研究當中[35]。上述相關生物標志物檢測結果證實，3 種培養載體相比較，單一肝細胞存在表達量較低，肝臟的部分功能無法復制等問題，精密肝切片由于保留了肝臟所有類型的細胞，且具有完整的組織結構，可能更適合從肝臟的生理功能到組織結構損傷的全方位評估。但精密肝切片培養技術的主要缺點之一是新鮮的肝切片存活時間相對較短，一般在6 h 左右，本研究發現靜態培養的肝切片隨著時間的延長，肝細胞質內糖原含量減少，細胞處于明顯的缺氧狀態，作用緩慢的中藥較難以在該培養體系中表現出毒性；并且相對于2D 細胞培養，組織切片存在一定厚度，營養液不易均勻到達細胞內，非藥物成分的物質如黏液質、植物蛋白等的堆積也很難真實的反映出藥物成分本身的毒性。這種伴隨著廢物不斷堆積、代謝產物不斷產生和營養物質不斷消耗的培養體系，勢必影響肝切片的生物學功能和存活狀態。微流體控制技術利用微型泵操控微流體，以多孔膜結構仿生具有高滲透性的血管內皮間隙，同時從物理空間上將肝組織、外部血竇樣區域分離并保留物質交換的能力，為培養物提供與體內相近的微環境，包括不斷更新的新鮮培養液，帶走積累的代謝產物，通過調節流速提供類似于體內血流微環境的剪切力等，很好地解決了上述組織切片培養中的問題，維持了精密肝切片在體外的活性和靈敏度。

綜合3 種培養體系中TWE 和TGE 的相關肝損傷生物標志物的檢測和組織形態學觀察結果認為，雷公藤及其制劑所造成的膽汁淤積型肝損傷在微流控-精密肝切片培養體系中有較好的呈現，表現為肝細胞損傷標志物ALT 和LDH、膽管損傷生物標志物GGT 的劑量相關性升高，與膽汁酸合成、排泄相關的生物標志物TBA 的高表達，組織形態學觀察到的具有明確量-毒關系的肝損傷，以及TWE 和TGE 所造成的肝損傷特點的一致性，相較微流控-HepaRG 細胞培養體系和靜態-精密肝切片培養體系具有更高的敏感度和可信度。

本研究所用的肝器官芯片，以HUVECs 和具有黏附蛋白的PET 膜共同形成肝血竇模型，仿生血管與細胞間隙，利用微流體生物芯片灌注技術，對大鼠精密肝切片進行動態培養，能準確還原藥物對肝臟的損傷特點，從而建立更加接近人體形態學的肝模型并能夠在較長時間內保持肝臟的特異性功能。但由于倫理等約束，無法直接以正常人的肝臟作為研究材料，但相信在不久的將來，通過微流控精密切片技術與特定器官人源化的動物相結合（如人源化小鼠），將克服種屬差異，制備與人體器官相近的檢測體系，相信將成為適合藥物研究的快速、靈敏、準確的新工具、新方法[36-37]。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突