基于轉錄組學探討酸棗仁皂苷A 改善阿爾茨海默病小鼠認知功能障礙的機制

王 翠，肖洪賀，聞彩名，趙宇萌，田 雨，劉 月，楊靜嫻

1. 大連市中心醫院 神經內科，遼寧 大連 116089

2. 遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧 大連 116620

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一種與衰老相關的漸進性中樞神經系統退行性疾病，主要臨床表現為進行性認知功能障礙、學習記憶能力減退、日常生活能力逐漸喪失等。其典型病理特征為神經元之間β 淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）沉積形成老年斑、神經元內Tau 蛋白過度磷酸化形成神經原纖維纏結（neurofibrillary tangle，NFT），以及由此引發的彌漫性炎性壞死病灶和神經元大量死亡。目前關于AD 的發病機制尚未清楚，但Aβ 聚集被公認為是其核心機制，具有神經毒性的Aβ42聚集形成不溶性淀粉樣斑塊，激活膠質細胞產生神經毒性介質和炎癥因子，進而促使神經細胞內斑塊形成，最終損害局部神經元[1-5]。此外，慢性炎癥性疾病如動脈粥樣硬化、肥胖/代謝綜合征、2 型糖尿病和重度抑郁等都是AD 發生發展的危險因素[6]。AD的發病機制非常復雜，目前對其理解還很局限，因此從不同角度開展對AD 發病機制和治療的研究已成為本領域的熱點。

中醫學認為心藏神、肝藏魂、脾藏意、腎藏精，AD 與五臟中心、肝、脾、腎的功能失調密切相關，因此中醫臨床上常以養心安神、補腎填精、益氣健脾、平肝開竅來治療AD[7-8]。酸棗仁有養肝寧心、安神生津的功效，是《中國藥典》收載的治療失眠最常用的單味中藥。研究表明，AD 患者中有25%～40%伴有睡眠結構改變[9]，睡眠障礙可加速Aβ 沉積，影響腦內微環境，干擾海馬神經干細胞活性而抑制神經再生，從而加重AD 的病理進程[10-12]。酸棗仁皂苷A（jujuboside A，JuA）是酸棗仁Ziziphi SpinosaeSemen中含量最高的一種皂苷成分，除具有鎮靜催眠、抗焦慮、抗抑郁等作用外，還有抗氧化、抗炎、抗凋亡和神經保護等多種生物活性[13]。本課題組前期研究及他人研究均已發現，JuA 可抑制AD 小鼠腦內炎癥反應與氧化應激損傷，促進Aβ清除，減輕腦組織損傷[14-15]，并激活內源神經干細胞促進海馬神經再生[16]。以上研究表明JuA 具備治療AD 的潛力，但其相關作用機制尚不十分清楚。本研究以淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）/早老蛋白1（pesenilin 1，PS1）雙轉基因小鼠作為 AD 模型，采用轉錄組學測序（transcriptome sequencing，RNA-Seq）技術結合生物信息學方法，分析JuA 治療AD 的潛在靶基因及相關信號通路，并予以實驗驗證，以闡明JuA 治療AD的分子機制。

1 材料

1.1 動物

野生型C57BL/6 小鼠10 只，7 月齡SPF 級APP/PS1 雙轉基因小鼠50 只，購自江蘇華創信諾醫藥科技有限公司，合格證號SCXK（蘇）2020-0009，動物使用許可證號SYXK（遼）2019-0004，動物實驗倫理批準號YN2022-039-56。動物適應性喂養1周，自由進食進水，室溫20～25 ℃，相對濕度40%～60%，每日12 h 光照維持，晝夜循環。

1.2 藥品與試劑

JuA（質量分數為99.78%，批號22032904）購自成都普菲德生物科技有限公司；鹽酸多奈哌齊片（安理申，國藥準字H20050978，批號2203026）由衛材（中國）藥業有限公司生產；尼氏（Nissl）染色液（批號C0117）購自碧云天生物技術研究所；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（批號D006-1-2）購自南京建成生物工程研究所；組織冰凍切片OCT 包埋劑（批號4583）購自美國Sakura 公司；TRIzol 試劑（批號T101100）購自上海美吉生物醫藥科技有限公司公司；三氯甲烷（批號0706106）購自上海申博化工有限公司；異丙醇（批號20170901）購自天津市風船化學試劑科技有限公司；RNA 逆轉錄試劑盒（批號G592）購自英國Abcam 公司；qRT-PCR檢測試劑盒（批號31598800）購自瑞士Roche 公司；RNA 6000 Nano kit 檢測試劑盒（批號5067-1511）購自美國Agilent 公司；葡萄糖激酶（glucokinase，Gck）抗體（批號sc-17819）購自圣克魯斯生物技術有限公司；HRP 標記的山羊抗兔IgG 二抗（批號bs-40295G-HRP）購自北京博奧森生物技術有限公司；GAPDH 抗體（批號WL01114）購自萬類生物科技有限公司。

1.3 儀器

Ti-s 型倒置熒光顯微鏡及成像系統（日本尼康公司）；HM 525NX 型冰凍切片（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；MS-1 型水迷宮分析系統（成都儀器廠）；Illumina HiSeq 6000 型測序儀（美國Illumina公司）；DW-86L386 型超低溫冰箱（青島海爾集團）；5424R 型低溫離心機（德國Eppendorf 公司）；CFXconnect qRT-PCR 儀、Power Pac Universal Power Supply 型通用電泳儀、Trans-Blot SD 半干式蛋白轉膜儀（美國Bio-Rad 公司）；5200Multi 型凝膠成像儀（上海天能公司）。

2 方法

2.1 動物分組與給藥

APP/PS1 雙轉基因小鼠50 只，按體質量隨機分為模型組及JuA 低、中、高劑量組和鹽酸多奈哌齊組，每組10 只；另取野生型C57BL/6 小鼠10 只作為對照組。依據文獻報道[13,17]和本課題組前期研究結果，將JuA 的給藥劑量確定為5、10、20 mg/kg（ip 給藥），1 次/d，連續21 d；模型組和對照組ip等體積生理鹽水；多奈哌齊組按人與小鼠等效劑量換算為0.65 mg/kg（ig 給藥），1 次/d，連續21 d。

2.2 Morris 水迷宮實驗

連續給藥21 d 后，采用Morris 水迷宮實驗檢測各組小鼠的學習記憶能力。前5 d 為定位航行實驗，第6 天為空間探索實驗。①定向航行實驗：將小鼠隨機面朝池壁放入水中，其游泳軌跡圖由拍攝系統自動采集、分析，將游泳路程和找到平臺并在其上停留15 s 所需時間定義為逃避潛伏期，每天以4 次訓練中潛伏期的平均值作為當日成績，評估小鼠的學習能力；②空間探索實驗：第6 天撤去平臺，選擇原平臺的對側作為入水點，記錄小鼠在60 s 內穿越原平臺的次數、在原平臺所在象限停留時間百分比及第1 次穿越平臺前的游泳距離，評估小鼠的記憶能力。

2.3 腦組織樣本處理與Nissl 染色

水迷宮實驗結束后，小鼠ip 4%水合氯醛麻醉，心臟灌流后取腦，冰凍包埋、?80 ℃速凍，用冰凍切片進行連續冠狀切片（10 μm）。將腦切片用4%多聚甲醛固定10 min 后，放入Nissl 染液中，待尼氏體清晰后終止反應；再依次經70%、100%乙醇脫水30 s，二甲苯透化5 min，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察皮層、海馬尼氏體的數量。

2.4 HE 染色

將腦片用4%多聚甲醛固定10 min 后，置于50 ℃的蘇木素中5 min，流水洗去殘余液體后置于分化液中10～20 s，用潤洗2 次；放入0.5%氨水中反藍10 s，ddH2O 再次潤洗；放入伊紅染液中3～5 s，ddH2O潤洗2 次；用不同濃度乙醇進行梯度脫水后，二甲苯透化5 min，中性樹脂膠封片，在顯微鏡下觀察皮層和海馬組織形態變化。

2.5 總RNA 提取與RNA-Seq 分析

取對照組、模型組與JuA 高劑量組小鼠各3 只，切取腦內海馬組織，委托上海派森諾生物科技有限公司進行RNA 提取與RNA-Seq 測序。將腦組織切成小塊，用TRIzol 裂解液低溫提取總RNA，質檢合格后通過帶有Oligo（dT）的磁珠富集具有polyA的mRNA，以片段化的mRNA 為模板合成雙鏈cDNA，隨后對cDNA 進行末端修復、加A 尾并連接測序接頭；通過AMPure XP beads 篩選cDNA，PCR 擴增后，再對PCR 產物進行純化處理，最終獲得cDNA 文庫。采用Illumina HiSeq 6000 型測序儀進行測序分析[18-19]。

2.6 基因本體（gene ontology，GO）功能和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

對轉錄組測序的原始數據（raw data）進行過濾，篩選得到高質量數據信息；用DESeq v1.20.0 軟件研究各組之間的差異表達基因，將條件設置為差異倍數|log2FC|＞1，顯著性P＜0.05，對9 個樣品的mRNA 進行差異表達基因的篩選。為了掌握差異基因所參與的生物學過程、分子功能和細胞組分，使用GO 數據庫對所獲得基因進行富集分析；再用KEGG 進行代謝通路的富集分析，從而獲取關鍵通路信息，并通過R 語言將相關信息進行可視化分析[18-19]。

2.7 qRT-PCR 檢測基因表達

用TRIzol 提取海馬組織總RNA，檢測其濃度和完整性后按試劑盒說明逆轉錄成 cDNA，以GAPDH 為內參基因，定量檢測目的基因表達水平。引物序列見表1。PCR 反應條件：95 ℃、3 min，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，40 個循環；反應完畢使用2?ΔΔCt法計算基因的相對表達量，以對篩選出的關鍵基因表達情況進行驗證。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2.8 Western blotting 檢測蛋白表達

提取各組小鼠海馬組織總蛋白，采用BCA 法測定蛋白濃度；將待測蛋白液上樣到10% SDSPAGE 凝膠電泳上進行分離，然后轉移至PVDF 膜上，用5%脫脂牛奶封閉2 h 后，加入Gck 一抗，4 ℃孵育過夜；次日，用TBST 洗膜3 次，每次15 min，孵育二抗，TBST 洗膜3 次，每次15 min，ECL化學發光試劑盒顯色，凝膠成像儀拍照，用Image J軟件分析圖像灰度值，以GAPDH 作為內參，計算相應蛋白表達量。

2.9 統計學分析

用GraphPad Prism 5.0 軟件進行數據分析，水迷宮實驗中的逃避潛伏期數據采用重復測量雙因素方差分析（Two-way ANOVA）；多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩組間比較采用雙尾學生檢驗（Two-tailed Students’ test）。細胞計數采用Image J 軟件定量分析。

3 結果

3.1 JuA 提高AD 小鼠的學習和記憶能力

定位航行實驗結果表明（圖1-A、B），通過訓練后各組小鼠的逃避潛伏期呈逐日下降趨勢。與對照組比較，模型組小鼠從第2 天起逃避潛伏期明顯延長（P＜0.01）；經低、中、高3 個劑量組的JuA治療后，逃避潛伏期均有不同程度縮短（P＜0.05、0.01），且隨給藥劑量的增大作用逐漸增強，其中高劑量組的作用與陽性對照藥多奈哌齊組相近。空間探索實驗結果顯示（圖1-C～F），各組小鼠游泳速度無明顯差異；與對照組比較，模型組小鼠到達原有平臺的游泳距離明顯增加（P＜0.01），穿越平臺次數和在目標象限停留時間百分比均顯著降低（P＜0.01），說明模型組小鼠記憶能力明顯下降；與模型組比較，JuA 各劑量組小鼠到達原平臺的游泳距離均明顯縮短（P＜0.05、0.01），穿越平臺次數和停留在目標象限時間百分比明顯增多（P＜0.01），其中JuA 高劑量組效果最佳。以上結果表明，JuA 能顯著改善AD 小鼠的學習和記憶能力，其高劑量組作用最佳。

圖1 JuA 對AD 小鼠學習和記憶能力的影響 (±s, n = 10)Fig. 1 Effect of JuA on learning and memory abilities of AD mice (±s, n = 10)

3.2 JuA 減輕AD 小鼠海馬與皮層的病理損傷

將小鼠腦切片進行HE 染色后，置于顯微鏡下觀察分析。如圖2 所示，對照組皮層、海馬CA3 和DG 區的神經細胞層次清晰、排列整齊、數量多；模型組神經細胞排列松散、數量減少、形態不規則，細胞核皺縮明顯，提示模型組神經細胞明顯受損；而與模型組比較，JuA 高劑量組神經細胞層次較為清晰，數量增多，胞質豐富，胞核均勻，細胞核固縮明顯減輕，說明JuA 治療后明顯減輕了AD 小鼠腦組織的病理損傷。

圖2 JuA 對AD 小鼠皮層和海馬病理損傷和尼氏體數量的影響 (×10)Fig. 2 Effect of JuA on pathological injury and number of Nissl bodies in cortex and hippocampus of mice (× 10)

Nissl 染色結果顯示，模型組小鼠皮層、海馬區的尼氏體數量均較對照組明顯減少（P＜0.01）；而JuA 高劑量組小鼠的上述區域尼氏體數量顯著多于模型組（P＜0.01），說明JuA 對AD 小鼠的腦組織具有明顯保護作用，顯著減輕了AD 病變對腦內神經元的損傷。

3.3 RNA-Seq 分析

3.3.1 測序數據質量評估 在所建立的測序文庫中，9 組樣本堿基質量超過Q20的比例在98.13%以上，超過Q30的比例在94.64%以上（表2），表明測序結果較好。

表2 各組樣本cDNA 文庫測序數據質量評估Table 2 Quality evaluation of cDNA library sequencing data for each group of samples

3.3.2 差異表達基因分析 用DESeq v1.20.0 軟件對RNA-Seq 得到的基因數據進行差異表達分析，以|log2FC|＞1、P＜0.05 為條件進行篩選。結果顯示，與對照組比較，模型組中共有341 個差異表達基因，其中上調218 個，下調123 個；與模型組比較，JuA高劑量組中差異表達基因共有94 個，其中上調66個，下調28 個（圖3）。進一步分析發現，模型組的5 個差異基因在JuA 干預后表達趨勢被逆轉（表3），包括Gck、白細胞介素-1 受體關聯激酶3（interleukin-1 receptor associated kinase 3，Irak3）、間皮素（mesothelin，Msln）、人角蛋白（human keratin，krt80）等基因，說明JuA 治療AD 的機制與調控這些基因表達有關。其中Gck 是葡萄糖代謝的關鍵限速酶，其基因突變可引起2 型糖尿病，從而增加AD 的患病風險或加重AD 病理進展。本結果顯示JuA 可逆轉AD 小鼠Gck 的降低趨勢，使其表達明顯升高（P＜0.05），提示干預葡萄糖代謝可能是JuA 治療AD 的重要機制之一。

圖3 差異表達基因分析Fig. 3 Analysis of differentially expressed genes

表3 JuA 對AD 小鼠差異基因表達的影響Table 3 Effect of JuA on differential gene expressions in AD mice

3.4 GO 功能富集分析

為進一步明確AD 病變及JuA 治療AD 所涉及基因的生物學功能變化，本研究對模型組相較于對照組選出的341 個差異基因、JuA 高劑量組相較于模型組的94 個差異基因進行GO 功能富集分析，主要包括生物學過程（biological process，BP）、細胞組分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）富集分析，并設置P＜0.05 為篩選標準。結果顯示，模型組vs對照組的差異基因功能主要集中在細胞分泌調節、離子通道、分泌顆粒、肽激素結合與受體活性等（圖4）；而JuA 高劑量組vs模型組的差異基因功能主要富集在離子轉運、細胞骨架與胞質膜、核受體活性等方面（圖5）。

圖4 模型組與對照組比較差異基因GO 功能富集分析Fig. 4 GO function analysis of differential genes between model group and control group

圖5 JuA 高劑量組與模型組比較差異基因GO 功能富集分析Fig. 5 GO function analysis of differential genes between JuA high-dose group and model group

3.5 KEGG 通路富集分析

利用KEGG 數據庫對模型組vs對照組、JuA 高劑量組vs模型組的差異表達基因進行功能注釋分類、通路富集分析，設置P＜0.05 為篩選標準，以基因比率（gene ratio）進行排序。如圖6 所示，模型組vs對照組的341 個差異表達基因主要富集的途徑有鈣離子信號通路、環磷酸腺苷（cyclic adenosine 3′,5′-monophosphate，cAMP）信號通路、2 型糖尿病等，說明以上通路與AD 發病密切相關；對JuA 高劑量組vs模型組的94 個差異基因進行富集分析，發現主要涉及2 型糖尿病、細胞黏附因子、白細胞介素-17（interleukin-17，IL-17）信號通路和轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGFβ）信號通路上，說明JuA 的抗AD 作用可能與調控糖尿病和炎癥相關通路有關。

圖6 差異基因的KEGG 富集分析氣泡圖Fig. 6 Diagram of KEGG enrichment analysis of differential genes

再以模型組vs對照組、JuA 高劑量組vs模型組共同調節的信號通路進行比對分析，共篩選出88條通路，以基因比率（gene Ratio）進行排序，對排名前10 的通路進行核心富集基因分析。結果顯示，與JuA 治療AD 相關性最高的通路是催乳素信號通路、青少年成熟期糖尿病、脂肪消化吸收、2 型糖尿病、細胞黏附因子、IL-17 信號通路、TGF-β 信號通路等。脂肪與糖代謝的紊亂、炎癥免疫反應等正是AD 發生發展的危險因素[6]，JuA 可通過干預這些危險因素防治AD。在這些信號通路中Gck 基因高頻出現（表4），JuA 逆轉了模型組Gck 的降低，使其表達明顯升高（表3），提示上調Gck 活性維持葡萄糖穩態，可能是JuA 發揮抗AD 作用的重要機制之一。

表4 共同調節的通路與核心富集基因Table 4 Co-regulated pathways and core enrichment genes

3.6 JuA 上調APP/PS1 小鼠腦內Gck 基因與蛋白的表達

為進一步驗證上述篩選結果，采用qRT-PCR 與Western blotting 對小鼠腦內Gck基因與蛋白表達水平進行實驗驗證。如圖7 所示，與對照組比較，模型組小鼠腦內GckmRNA 和蛋白表達水平均明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，JuA 高劑量組GckmRNA 和蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05），與RNA-Seq 分析結果一致，說明JuA 治療AD 的機制與上調Gck基因與蛋白的表達有關。

圖7 JuA 對AD 小鼠腦組織Gck mRNA 和蛋白表達的影響 (±s, n = 3)Fig. 7 Effect of JuA on Gck mRNA and protein expressions in brain tissue of AD mice (±s, n = 3)

4 討論

本實驗采用的APP/PS-1 雙轉基因小鼠，表達嵌合的APP 和PS-1，能很好地模擬人類AD 腦內的病理變化，已被廣泛應用于AD、淀粉樣斑塊形成等相關疾病的研究[20-21]。水迷宮實驗檢測結果表明，7 月齡APP/PS1 雙轉基因小鼠的學習與記憶能力已明顯低于對照組，而JuA 能劑量相關性提高小鼠的學習記憶能力，其高劑量組作用最佳，與陽性對照藥多奈哌齊相當。HE、Nissl 染色結果顯示，模型小鼠海馬與皮層神經細胞數量減少、形態不規則，核皺縮明顯，尼氏體數量減少，說明神經元已明顯受損；而經JuA 治療后神經元與尼氏體數量明顯增加，細胞層次較為清晰，胞質豐富，核固縮減輕，說明JuA 明顯減輕了AD 小鼠腦組織的病理損傷。以上結果說明JuA能有效保護腦組織，顯著改善AD小鼠認知功能的障礙。

為了進一步探討JuA 干預AD 的分子機制，治療結束后分別取對照組、模型組和JuA 高劑量組小鼠的海馬組織進行RNA-Seq 分析。RNA-Seq 是近年發展起來的新一代高通量基因測序技術，能全面快速地獲得目標組織或器官所有轉錄本序列信息，從整體水平研究基因功能及結構，揭示特定的生物學過程以及疾病發生過程中的分子機制[18-19]。本研究測序分析結果顯示，與對照組比較，模型組中共有341 個差異表達基因；與模型組比較，JuA 高劑量組有94 個差異基因，模型組的部分差異基因在JuA 干預后表達趨勢被逆轉，說明JuA 可通過調控這些基因的表達治療AD。為明確AD 病變及JuA治療后所涉及基因的生物學功能變化，對模型組篩選出的341 個差異基因和JuA 高劑量組的94 個差異基因進行GO 富集分析，結果顯示，模型組差異基因的功能主要集中在細胞分泌調節、離子通道、肽激素結合與受體活性等；而JuA 治療組的差異基因功能主要富集在離子轉運、細胞骨架與胞質膜、核受體活性等方面。對上述差異基因進行KEGG 信號通路富集分析，結果顯示，模型組涉及到鈣離子信號通路、cAMP 信號通路、2 型糖尿病等；而JuA組涉及2 型糖尿病、脂肪消化吸收、細胞黏附因子、IL-17 和TGF-β 信號通路等，說明JuA 抗AD 的作用可能與調控代謝紊亂和炎癥反應有關。

AD 的發病機制十分復雜，其發生發展通常與慢性炎癥相關疾病如動脈粥樣硬化、肥胖/代謝綜合征和2 型糖尿病等有關，這些疾病的產生是建立在衰老過程中促炎細胞被激活引起的全身慢性炎癥基礎之上[6]。炎癥反應的激活可導致血腦屏障通透性增加，小膠質細胞和星形膠質細胞活化，觸發淀粉樣蛋白斑塊和神經原纖維纏結的形成，從而導致突觸喪失和神經退行性病變[6,22-23]。目前關于血清各炎癥因子與AD 發病之間的關系尚未十分明確，但已有研究報道，多種促炎因子如IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-17、腫瘤壞死因子-α 等與抗炎因子IL-4、IL-10、IL-37 和TGF-β1 等的表達失衡導致的慢性炎癥，是引起AD 的重要因素[6]。細胞黏附分子L1 是表達于神經細胞質膜上的跨膜蛋白，參與神經元之間的相互識別和連接，在AD 海馬組織中能有效促進Aβ 斑塊的清除[24]。TGF-β 超家族具有神經保護功能，可從多方面拮抗AD 病理改變，如TGF-β1 能促進Aβ 的清除、改善Tau 病理、調節海馬神經發生和突觸可塑性等，從而改善AD 認知功能[25]。

本研究以模型組vs對照組、JuA 高劑量組vs模型組共同調節的信號通路進行比對分析，共篩選出88 條通路，對排名前10 的通路進行核心富集基因分析，結果顯示，與JuA 治療AD 相關性最高的通路是青少年成熟期糖尿病、脂肪消化吸收、2 型糖尿病、細胞黏附因子、IL-17 信號通路和TGF-β 信號通路，說明JuA 可通過調控代謝紊亂和炎癥反應減輕AD 病理損傷，抑制AD 的發生發展。

糖尿病是促進AD 發生發展的危險因素之一。糖尿病患者腦葡萄糖代謝異常、胰島素抵抗、晚期糖基化終末產物和炎性小體等加劇了腦內免疫炎癥反應和氧化應激損傷，促進了淀粉樣斑塊和神經原纖維纏結的形成，從而加重了AD 的病理損傷[26-27]；鑒于糖尿病與AD 之間的聯系和目前缺乏有效治療AD 的藥物，越來越多的研究集中于用抗糖尿病藥物控制或逆轉AD[28]，其中新型降糖藥Gck 激動劑的研發起了廣泛注意。Gck 是葡萄糖代謝過程中第1 個限速酶，能靈敏識別葡萄糖水平改變，適時調控胰島素及胰高血糖素分泌并促進葡萄糖磷酸化，從而保持葡萄糖的穩態，故Gck 激動劑有望成為全新抗2 型糖尿病藥物，并對AD 的防治帶來新的希望[29-30]。本研究差異基因分析結果顯示，JuA 干預了AD 小鼠腦內Gck、Irak3和Msln等基因，其中Gck在模型組小鼠腦內顯著降低，而JuA治療后Gck表達明顯升高，說明Gck 可能是JuA 治療AD 的重要靶點之一；在與JuA 治療AD 相關性最高的前10條通路中，Gck 基因高頻出現，說明上調葡萄糖激酶活性維持葡萄糖穩態可能是JuA 發揮抗AD 作用的機制之一；經qRT-PCR 與Western blotting 實驗驗證，表明JuA 組GckmRNA 與蛋白表達均顯著高于模型組，結果與RNA-Seq 分析一致。其他差異基因未在這些通路中高頻出現，且與AD 的相關性目前尚不十分清楚，故有待于下一步進行驗證。

綜上，JuA 能明顯減輕AD 小鼠腦組織病理損傷，提高小鼠學習和記憶能力，其作用機制可能與調控炎癥反應與代謝紊亂有關，其中上調GckmRNA 與蛋白表達，維持血糖平衡可能是JuA 治療AD 的重要機制之一。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突