葛根藥材HPLC 指紋圖譜與6 種成分含量測定研究

葉 彬，閆小巧#，雷 婷，蔡鑫坤，林敏生*

1. 廣州白云山中一藥業有限公司，廣東 廣州 510530

2. 廣州白云山奇星藥業有限公司，廣東 廣州 510530

葛根藥材為豆科植物野葛Puerarialobate(Willd.) Ohwi 的干燥根，習稱野葛，具有解肌退熱、透疹、生津止渴、升陽止瀉等功效[1]。主要化學成分為3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆素、大豆苷等異黃酮類化合物[2-3]。在臨床常用于治療表證發熱、麻疹不透、陰虛消渴、脾虛泄瀉等癥[4-5]。現代藥理藥效研究表明，葛根具有廣泛的藥理作用，如保肝、抗腫瘤、神經保護、心臟保護、改善胰島素抵抗、抗炎、抗氧化等，在治療心腦血管疾病、治療糖尿病、抗腫瘤、預防骨質疏松、發揮雌激素作用等方面發揮重要作用[6]。

葛根目前已被國家衛生部批準列入“既是食品又是藥品”名錄，隨著藥食同源概念的普及與應用，葛根的市場開發潛力和使用需求量也日益增加。作為野生資源為主的中藥材，有效保證其資源品質、控制其產品質量是葛根藥材可持續利用的重要環節。因此亟需建立其質量控制和質量評價方法。據此，本研究建立葛根藥材的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜方法，該方法同時適用于葛根中6 種主要異黃酮成分的含量測定，并對從各主產區收集的樣品進行了質量研究。以6 種葛根異黃酮總含量平均值及RSD、浸出物含量及RSD、相似度為指標，對不同產地葛根進行了質量比較研究，為制定優質葛根藥材質量標準以及穩定原料產地提供方法和依據。

1 儀器與材料

Aglient HP 1100 高效液相色譜儀聯用DAD 檢測器（美國安捷倫科技公司）。對照品葛根素（批號200912）、染料木素（批號201312）、染料木苷（批號201702）、芒柄花素（批號201504）、大豆苷（批號201603）、大豆苷元（批號200402）、鷹嘴豆芽素A（批號200501）均購自中國食品藥品檢定研究院，質量分數均大于98%；對照品3′-羥基葛根素（批號CHB170224）、3′-甲氧基葛根素（批號CHB160902）、葛根素芹菜糖苷（批號CHB160421），質量分數均大于98%，均購自成都克洛瑪生物科技有限公司。

從葛根主產區河南、陜西、四川、安徽等地收集樣品共32 批，經鑒定符合《中國藥典》2020 年版標準，為豆科植物野葛P.lobate(Willd.) Ohwi 的干燥根。經廣州白云山中一藥業有限公司陳自泓副主任中藥師鑒定。樣品信息見表1。

表1 32 批葛根藥材樣品信息Table 1 Sample information of 32 batches of Puerariae Lobatae Radix

2 方法與結果

2.1 指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Hypersil BDS C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）；梯度洗脫（0～2 min，5% B；2～3 min，5%～9% B； 3～20 min，9% B；20～21 min，9%～12% B；21～35 min，12% B；35～36 min，12%～15% B；36～50 min，15%～20% B；50～60 min，20% B；60～72 min，20%～50% B；72～80 min，50% B）；體積流量為1.0 mL/min；檢測波長為250 nm；柱溫為25 ℃；進樣量為10.0 μL。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取葛根藥材粉末0.1 g，置錐形瓶中，精密加入30%乙醇50 mL，稱定質量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質量，用30%乙醇補足減失的質量，濾過，取續濾液，用微孔濾膜（孔徑為0.45 μm）濾過，濾液作為供試品。

2.1.3 對照品儲備液的制備 分別精密稱取約3′-羥基葛根素5 mg、葛根素10 mg、3′-甲氧基葛根素5 mg、葛根素芹菜糖苷5 mg、大豆苷5 mg、大豆苷元5 mg、染料木素0.2 mg、染料木苷4 mg、芒柄花素0.2 mg 定容至10 mL 量瓶，鷹嘴豆芽素A 0.1 mg 定容至20 mL量瓶，用甲醇溶解，制得對照品儲備液。

2.1.4 對照品混合溶液的制備 精密吸取各對照品儲備液3′-羥基葛根素5 mL、葛根素12.5 mL、3′-甲氧基葛根素5 mL、葛根素芹菜糖苷4.3 mL、大豆苷4.3 mL、大豆苷元2.4 mL、染料木素1 mL、染料木苷1 mL、芒柄花素1 mL、鷹嘴豆芽素A 1 mL，至50 mL 量瓶中，用甲醇制成含3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷、芒柄花素、鷹嘴豆芽素A 分別62.65、226.17、69.52、40.71、39.49、25.35、0.55、7.458、0.63、0.51 μg/mL 的混合對照品溶液。

2.1.5 精密度試驗 取同一批葛根樣品，按供試品溶液制備方法制備，取續濾液連續進樣6 次，圖譜導入相似度評價系統計算相似度，結果顯示各圖譜相似度均大于1，提示精密度良好。

2.1.6 重復性試驗 取同一批葛根樣品，照供試品溶液制備方法制備6 份，分別進樣，記錄各自指紋圖譜色譜圖，圖譜導入相似度評價系統計算相似度，結果顯示各圖譜相似度均大于0.99。

2.1.7 穩定性試驗 取同一批葛根樣品，按供試品溶液制備方法制備，分別于0、3、6、9、12、24 h進樣測定，圖譜導入相似度評價系統計算相似度，結果顯示各圖譜相似度均大于0.99。

2.1.8 指紋圖譜的建立 取32 批葛根樣品，分別按照擬定供試品溶液制備方法制備，按擬定色譜條件進樣分析，將所得色譜圖導入相似度評價系統，以S1 為參照圖譜，對照圖譜生成方法為平均數，時間窗口1，經2、3、7、9 號色譜峰多點校正，Mark 峰匹配后，生成對照圖譜（圖1、2），并計算相似度，標記共有峰10 個，32 批樣品與對照圖譜的相似度均大于0.94。

圖1 葛根樣品HPLC 指紋圖譜重疊圖Fig. 1 HPLC fingerprint overlay of Puerariae Lobatae Radix

圖2 葛根HPLC 對照指紋圖譜Fig. 2 HPLC control fingerprint of Puerariae Lobatae Radix

2.1.9 指紋圖譜共有峰的指認 通過對照品的保留時間，對葛根藥材的指紋圖譜共有峰進行指認（圖3），初步確認了其中6 種化學成分，分別為1 號峰3′-羥基葛根素、2 號峰葛根素、3 號峰3′-甲氧基葛根素、4 號峰葛根素芹菜糖苷、5 號峰大豆苷、6 號峰大豆苷元。

圖3 葛根HPLC 指紋圖譜色譜峰指認Fig. 3 HPLC fingerprint chromatographic peak identification of Puerariae Lobatae Radix

2.2 葛根HPLC 同時測定6 種異黃酮成分

2.2.1 色譜條件 同“2.1.1”項方法。

2.2.2 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取約3′-羥基葛根素2.5 mg、葛根素12.5 mg、3′-甲氧基葛根素5 mg、葛根素芹菜糖苷2.5 mg、大豆苷2.5 mg、大豆苷元1.25 mg，加甲醇溶解并定容至50 mL量瓶，制得含3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、大豆苷元分別為55.02、254.72、101.74、53.76、53.02、27.48 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 同“2.1.2”項方法。

2.2.4 線性關系考察 精密吸取混合對照品溶液各1、2、4、6、8、10 μL，按色譜條件注入液相色譜儀，以峰面積為縱坐標（Y），以進樣量為橫坐標（X），繪制標準曲線。結果見表2。

表2 對照品線性關系Table 2 Linear relation of reference substance

2.2.5 重復性考察 取樣品（S1），平行6 份，精密稱定，按上述方法平行制備成供試品溶液，分別進樣10 μL 進行測定。結果3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、大豆苷元質量分數RSD 分別為0.14%、0.16%、0.18%、0.18%、0.41%、3.95%。

2.2.6 精密度考察 精密吸取葛根樣品（S1）的供試品溶液10 μL，連續進樣6 次，測得3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、大豆苷元峰面積的RSD 分別為0.10%、0.08%、0.17%、0.19%、0.41%、0.44%。

2.2.7 穩定性考察 取樣品（S1）的供試品溶液，在室溫下放置，分別在0、3、6、9、12、24 h 進樣10 μL，測得3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、大豆苷元峰面積的RSD 分別為0.31%、0.22%、0.28%、0.17%、0.49%、1.98%。

2.2.8 加樣回收率考察 取已測定的樣品6 份（粉碎，過40 目篩），每份0.05 g，精密稱定，分別置錐形瓶中，精密加入3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、大豆苷元的對照品儲備液適量，按“2.1.2”項下方法制備供試液，進樣測定，計算得到上述6 個成分的平均加樣回收率分別為103.9%、104.7%、104.6%、96.8%、96.4%、96.4%；RSD 分別為0.94%、0.36%、0.80%、0.51%、1.44%、1.32%。

2.2.9 樣品測定 按“2.2”項下方法制備供試品溶液，每批樣品平行制備2 份，按“2.2.1”項色譜條件進樣分析，并計算含量。結果見表3。

表3 32 批葛根多成分含量測定結果 (n＝2)Table 3 Results of multicomponent content determination in 32 batches of Puerariae Lobatae Radix (n＝2)

2.3 浸出物測定

按照《中國藥典》2020 年版葛根浸出物項下方法對樣品進行檢測，結果見表4。

表4 32 批葛根樣品浸出物測定結果Table 4 Determination of extracts from 32 batches of Puerariae Lobatae Radix samples

2.4 綜合評分

通過考察，建立葛根HPLC 同時測定6 種異黃酮成分的方法。將不同產地葛根質量采用綜合評分法對葛根藥材質量進行綜合評分（綜合評分＝黃酮總量×0.6＋浸出物×0.4），結果顯示（表5），河南產地的藥材評分最高，其次為陜西。

3 討論

3.1 供試品溶液的制備方法考察

本研究在初期考察了供試品溶液的制備方法，包括采用回流提取與超聲的提取方法考察，結果從主要峰的積分面積可知，回流提取的效率高于超聲提取，故選取回流作為提取方法。用不同體積分數（30%、50%、70%、100%）的乙醇作為提取溶劑，發現30%乙醇提取的成分色譜峰總積分面積最大，且30%乙醇提取的液相色譜圖中各峰峰數較多，各主要成分色譜峰清晰可見，峰位峰形好，分離度高，故選取30%乙醇作為提取溶媒。對提取溶劑用量（15、25、50、75 mL 30%乙醇）考察發現，隨著溶劑用量的增加，提取的樣品主要成分含量越多，到50 mL 達到峰值后，含量水平趨于平穩，故選取50 mL 作為最佳溶劑用量。

3.2 色譜條件的比較與優化

對供試品溶液進行200～400 nm 的波長掃描，發現在250 nm 處可將全譜物質均檢測出，各色譜峰的豐度、數目和分離度較好。同時還考察了不同色譜柱（Hypersil BDS C18、Hypersil ODS2、Spherisorb C18、Aglient Eelipee XDB-C18），發現Hypersil BDS C18柱分離效果較好。此外還對流動相（0.1%甲酸-乙腈、0.1%磷酸-乙腈、0.1%乙酸-乙腈、乙腈-水、甲醇-水）進行考察，結果發現采用0.1%甲酸水-乙腈流動相色譜峰分離效果好，峰數多、峰形好，且基線平穩。

3.3 分析與總結

《中國藥典》2020 年版中對葛根水分、總灰分、醇浸出物測定作了規定，含量測定項下以葛根素的含量評價其質量。有學者認為以單一成分葛根素評價葛根的質量，存在一定的不科學性和不合理性[7]。中藥指紋圖譜可以較全面地反映中藥所含化學成分的種類與數量，進而反映中藥的質量和中醫用藥所體現的整體療效[8]。目前已有研究關于采用HPLC 法建立的葛根藥材指紋圖譜研究，但所建立的指紋圖譜中的化學成分不明確或研究成分數量較少[9-10]。本研究經色譜條件及方法學考察，通過測定32 批葛根藥材，建立葛根藥材的指紋圖譜，提取出10 個共有峰，利用對照品保留時間共指認了其中6 個峰，分別為3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、大豆苷元。相似度評價顯示不同產地藥材測定的指紋圖譜與對照圖譜相似度均大于0.94，所建立的指紋圖譜穩定可靠，可用于葛根質量的評價。

采用葛根HPLC 同時測定6 種異黃酮成分，并對不同產區收集的32 份葛根樣品進行質量研究。以3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、大豆苷元6 種異黃酮成分的總和計算總黃酮含量，結合浸出物測定結果，綜合評價不同產地的葛根藥材質量。相比僅采用葛根素含量或少數成分含量作為不同產地葛根質量的評價指標[11-12]，本研究針對葛根6 種異黃酮成分，并結合浸出物測定的綜合評價方式更加全面，為制定優質葛根藥材質量標準以及穩定原料產地提供參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突