紫杉醇還原敏感型聚合物膠束的制備及其逆轉腫瘤多藥耐藥的研究

張夢欣，于英杰，董 優，宋 煜

福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122

目前，化療仍是臨床治療乳腺癌的主要方式之一[1-4]。臨床研究表明，多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）的存在是造成化療失敗和腫瘤復發的主要原因[5-10]。MDR[11]是指癌細胞因接觸一種化療藥物產生耐藥性的同時，對其他多種不同結構、不同作用機制的化療藥物同樣存在耐藥性。研究表明，乳腺癌MDR 是多種細胞機制共同作用的結果，主要作用機制包括跨膜蛋白過度表達[12]、谷胱甘肽及其酶系統[13]、凋亡基因表達異常[14]、藥物作用靶點改變[15]等，致使癌細胞對化療藥攝取量減少、外排量增加以及增加了對化療藥凋亡作用的抗性等。基于乳腺癌MDR 的病理特征，只考慮一種因素無法解決化療過程中出現的耐藥性問題，因此只有從多途徑、多因素、多靶點、多角度上進行逆轉才可以更好地尋求合理的解決方案。

本研究所合成聚合物膠束載體還原敏感型透明質酸-熊果酸聚合物（hyaluronic acid-cystamineursolic acid，HSU）中的熊果酸除自身具有明顯的抗腫瘤活性外，還具有多靶點逆轉MDR 的功能[16]；透明質酸作為CD44 配體，可通過乳腺癌細胞表面過度表達CD44 受體進而介導促進藥物細胞內吞[17]；與正常生理環境相比，腫瘤環境下的谷胱甘肽（glutathione，GSH）濃度高至100～1000 倍，而二硫鍵連接臂所構建的還原敏感型膠束能夠在腫瘤微環境高還原響應下快速釋放化療藥物進而減少藥泵外排[18]。因此，本研究聯合以上3 種策略所構建的還原敏感型載體用于遞送化療藥紫杉醇，考察PTXHSU 的體外釋放行為，并對該載藥膠束的細胞毒性、細胞攝取和胞內GSH 進行研究，以期實現逆轉乳腺癌多藥耐藥性的目標。

1 儀器與材料

1.1 儀器

JY92-2D 型超聲波細胞破碎儀，寧波新芝生物科技公司；Alpha1-2 LD plus 型冷凍干燥機，德國Christ 公司；Nicolet iS5 型傅里葉變換紅外光譜儀，賽默飛世爾科技公司；NicompTM380ZLS 型激光粒徑測定儀（DLS），美國Santa Barbara 公司；Avance III 500 型核磁共振波譜儀，瑞士Bruker 公司；H7650型透射電子顯微鏡（TEM），日本日立公司；DKZ 型系列電熱恒溫振蕩水槽，上海一恒科技公司；Infinite M200 PRO 型酶標儀，瑞士Tecan 公司；LC 2030 型高效液相色譜儀，島津公司；DMIi8-M 型倒置熒光顯微鏡，德國Christ 公司。

1.2 材料

熊果酸（批號F1928106，質量分數≥98%）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS，質量分數≥98%）、碳二亞胺鹽酸鹽（EDC，質量分數≥98%）、己二酸二酰肼（ADH，質量分數≥98%）、甲酰胺（分析純）、二甲基亞砜（DMSO，分析純）、二甲基甲酰胺（DMF，分析純），阿拉丁生化科技公司；紫杉醇，批號902-1812401，質量分數≥98%，福建南方制藥股份有限公司；胱胺二鹽酸鹽（CYS），質量分數≥97%，梯希愛化成工業發展公司；透明質酸，相對分子質量9850，江蘇海華生物科技有限公司；透析袋，截留相對分子質量（MWCO）3500，上海源葉生物科技有限公司；RMPI 1640 基礎培養基、胎牛血清，Gibco公司；MTT、香豆素-6（coumarin-6，C6，質量分數98%），Sigma 公司。

1.3 細胞

人乳腺癌紫杉醇敏感細胞株MCF-7 細胞、人乳腺癌紫杉醇耐藥細胞株MCF-7/ADR 細胞，上海艾研生物科技有限公司。

2 方法與結果

2.1 HSU 與HU 的合成

合成路徑如圖1 所示。本實驗將熊果酸和透明質酸中的-COOH 通過酰胺化反應分別連接在CYS或ADH 兩端的-NH2上，得到具有還原敏感型的HSU 和非還原敏感型的HU。

圖1 HSU/HU 的合成路徑圖Fig. 1 Synthesis path diagram of HSU/HU

2.1.1 HSU 的合成 稱取透明質酸（0.8 mmoL）置燒瓶中，甲酰胺溶解，加入EDC（1.6 mmoL）和NHS（1.6 mmoL），冰浴0.5 h，加入CYS（8 mmoL），攪拌反應24 h 后，冰丙酮沉淀、抽濾，適量水復溶，0.8 μm 微孔濾膜濾過，超純水透析（MWCO3500）48 h 后，冷凍干燥，即得HA-CYS 純品。

稱取熊果酸（0.1 mmoL），置燒瓶中，30 mL DMF-甲酰胺（1∶1）混合溶劑溶解，加入EDC（0.7 mmoL）和NHS（0.7 mmoL），冰浴4 h，加入HACYS（0.2 mmoL），室溫反應24 h 后，冰丙酮沉淀，抽濾，適量水復溶后，離心，上清液0.8 μm 膜濾過，超純水透析（MWCO3500）48 h 后，冷凍干燥，即得HSU 純品。

2.1.2 HU 的合成 稱取透明質酸（0.8 mmoL）置燒瓶中，超純水溶解，加入EDC（1.6 mmoL）和ADH（7.5 mmoL），冰浴1 h，室溫下保持pH 4.75 反應2 h，調節反應溶液至pH 7.0，0.8 μm 微孔濾膜濾過，超純水透析（MWCO3500）48 h 后，冷凍干燥，即得HA-ADH 純品。

稱取熊果酸（0.5 mmoL），置燒瓶中，40 mL DMF-甲酰胺混合溶劑溶解，加入EDC（4.6 mmoL）和NHS（4.6 mmoL），冰浴4 h，加入0.1 g HA-ADH，室溫反應24 h 后，冰丙酮沉淀，抽濾，適量水復溶后，離心，上清液0.8 μm 膜濾過，超純水透析（MWCO3500）48 h 后，冷凍干燥，即得HU 純品。

2.2 結構表征

2.2.1 FT-IR 分析 分別稱取透明質酸、HA-CYS、HA-ADH、HU 和HSU 適量，KBr 壓片法，FT-IR 表征結構。HSU、HU 及反應原料的FT-IR 圖譜如圖2所示。1618 cm?1和1715 cm?1兩處吸收峰分別是透明質酸和熊果酸結構中-COOH 的對稱伸縮振動峰（νC=O）；而在HSU 與HU 圖譜中，并未出現熊果酸的特征峰，推測其已被掩蓋，熊果酸經反應已生成新鍵；HA-CYS 圖譜中1653、1558 cm?1處吸收峰和HA-ADH 圖譜中1644、1559 cm?1處吸收峰分別對應酰胺鍵對稱伸縮振動峰（νC=O，酰胺I 帶）和面內彎曲振動峰（βC=O，酰胺II 帶），證明HA-CYS 和HA-ADH 的成功合成；根據HSU 圖譜中1653 cm?1（νC=O，酰胺I 帶）、1558 cm?1（βC=O，酰胺II 帶）和HU 圖譜中1646 cm?1（νC=O，酰胺I 帶）、1541 cm?1（βC=O，酰胺II 帶）處出現酰胺鍵特征峰，推測HSU 圖譜和HU 圖譜中出現的酰胺鍵可能為熊果酸與2 中間體反應生成的新酰胺鍵吸收峰，但與原來中間體酰胺鍵吸收峰重疊。為證實HSU 和HU合成成功，HSU 和HU 的結構需要通過H1-NMR 進一步表征。

圖2 合成原料及聚合物FT-IR 圖Fig. 2 FT-IR diagram of synthetic materials and polymers

2.2.2 H1-NMR 分別將適量透明質酸、HA-CYS、HA-ADH、HSU 和HU 溶于D2O，熊果酸溶于DMSO-d6，H1-NMR 表征結構，并計算CYS、ADH以及熊果酸的取代度（degree of substitution，DS，定義為每100 個透明質酸單體上CYS 和ADH 的嫁接個數）。HSU（D2O）、HU（D2O）及反應原料透明質酸（D2O）、HA-CYS（D2O）、HA-ADH（D2O）、熊果酸（DMSO-d6）的H1-NMR 圖如圖3 所示。透明質酸特征峰出現在δ2.03（3H，-NH-CO-CH3）處和δ3.25～4.78（2H-CH2-、H、-OH）；與透明質酸相比，合成中間體HA-CYS 和HA-ADH 分別在δ2.84（2H，-CH2CH2NH2-，CYS 特征峰）和δ1.69（2H，-NHNHCOCH2CH2-CH2-，ADH 特征峰）、δ2.18～2.33（2H，-NHNHCOCH2CH2-，ADH 特征峰）處出現的吸收峰，證明中間體合成成功，與FT-IR結果一致。按照透明質酸（δ2.0）、CYS（δ2.9）和ADH（δ2.6）的特征峰面積，計算出中間體CYS 和ADH 的DS，分別為（31.13±1.13）%和（50.75±2.63）%；在此基礎上，HSU H1-NMR 圖在δ0.97～1.10、1.28～1.29 和HU H1-NMR 圖在δ1.28～1.29（HU H1-NMR 圖中δ0.97～1.10 處吸收峰由于磁各向異性的緣故，向低場移動，被HA-ADH 中δ1.14覆蓋，因此消失）處出現的吸收峰歸屬于熊果酸角甲基的特征吸收峰，結合FT-IR 推測的結果，判斷熊果酸已成功接枝，HSU 和HU 合成成功。通過熊果酸角甲基氫（δ1.28）與透明質酸中N-乙酰基中甲基氫（δ2.0）的吸收峰面積比值，計算出HSU 和HU 中熊果酸的取代度分別為（3.12±0.17）%和（3.33±0.47）%，除了中間化學連接臂結構不同，二者取代度相差不大，因此，HU 可以做HSU 的對比參照。

圖3 合成原料及聚合物的H1-NMR 圖Fig. 3 H1-NMR diagram of synthetic materials and polymers

2.3 PTX-HSU 的制備

固定HSU 載體投料量為18 mg，紫杉醇與HSU質量比為 1 ∶1.8，以粒徑、 多分散指數（polydispersity index，PDI）、包封率、載藥量為考察指標。精密稱取HSU 載體18 mg，加水3 mL，室溫溶解30 min，逐滴滴加25 mg/mL 的紫杉醇乙醇溶液400 μL 于載體水溶液中，劇烈攪拌15 min，冰浴探頭超聲30 min，重蒸水透析過夜，0.8 μm 濾膜濾過，即得載藥膠束溶液。PTX-HU 同法可制得。

取500 μL 膠束溶液稀釋至5 mL，通過激光粒度測定儀分別測定PTX-HSU 及PTX-HU 的平均粒徑、PDI 和ζ 電位。結果見表1。PTX-HSU 和PTXHU 膠束ζ 電位穩定在?18～?20 mV，這是因為透明質酸結構中的-COOH 在水中解離為帶負電荷COO?，較大的ζ 電位表明粒子間存在較大的斥力，說明該膠束制劑物理穩定性良好。

表1 粒徑及分布、ζ 電位 (±s, n = 3)Table 1 Particle size and distribution, ζ potential (±s, n = 3)

表1 粒徑及分布、ζ 電位 (±s, n = 3)Table 1 Particle size and distribution, ζ potential (±s, n = 3)

樣品 粒徑/nm PDI ζ 電位/mV 載藥量% 包封率%PTX-HSU 152.8±8.5 0.105±0.010 ?20.98±3.44 33.11±2.36 89.27±9.52 PTX-HU 183.4±3.7 0.176±0.009 ?18.69±2.79 30.40±1.90 85.00±10.10

2.4 載藥量與包封率的測定

精密量取100 μL PTX-HSU 和PTX-HU 膠束溶液，甲醇稀釋定容至10 mL，參照本研究前期所建立的方法學，采用HPLC 法進行測定[19]。

紫杉醇含量測定色譜條件：色譜柱為Agilent 5 TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-水（75∶25）；體積流量為1 mL/min；進樣量為20 μL；柱溫為30 ℃；檢測波長為227 nm。分別按照以下公式計算紫杉醇的載藥量和包封率。

所制備的PTX-HSU 和PTX-HU 均具有較高的紫杉醇包封率（表1），分別為（89.27±9.52）%和（85.00±10.10）%；同時具有良好的負載效果，其載藥量分別為（33.11±2.36）%和（30.40±1.90）%。

2.5 PTX-HSU 的物相鑒定

稱取紫杉醇、HSU、紫杉醇與HSU 的物理混合物（含量比與PTX-HSU 相同）及PTX-HSU 適量，分別進行DSC 分析和XRD 測試。

2.5.1 DSC 紫杉醇、HSU、紫杉醇與HSU 物理混合物、PTX-HSU 凍干粉針的DSC 圖譜如圖4 所示。219.9 ℃（吸熱峰）和240.8 ℃（放熱峰）分別為紫杉醇的熔融峰和降解峰，說明紫杉醇是以結晶態存在；241.3 ℃放熱峰為HSU 中修飾的熊果酸降解峰；紫杉醇的2 個特征峰（222.75、242.5 ℃）出現在紫杉醇和HSU 的物理混合物中，而未在PTXHSU 載藥膠束圖譜中出現；PTX-HSU 載藥膠束圖譜中僅出現了HSU 中熊果酸的降解峰（241.4 ℃）；說明紫杉醇可能以分子狀態或無定形形式存在于HSU 膠束骨架中。

圖4 DSC 圖譜Fig. 4 DSC patterns

2.5.2 XRD 紫杉醇、HSU、紫杉醇與HSU 物理混合物、PTX-HSU 載藥膠束的XRD 圖譜如圖5 所示。XRD 圖譜中5°、9°和12°處3 個強吸收峰以及15°～30°若干弱雜峰為紫杉醇特征峰；HSU 的XRD圖譜在5°～30°無任何吸收峰；紫杉醇與HSU 物理混合物則在XRD 圖譜中出現了紫杉醇的特征峰，而PTX-HSU 載藥膠束圖譜與HSU 圖譜相似，在5°～30°無任何吸收峰。綜合以上圖譜數據，說明紫杉醇以分子狀態或無定形存在于納米膠束骨架中。

圖5 XRD 圖譜Fig. 5 XRD patterns

2.6 PTX-HSU 體外釋藥動力學考察

配制紫杉醇質量濃度為0.5 mg/mL的PTX-HSU和PTX-HU 溶液，分別取1 mL 置于透析袋（MWCO14 000）內，放入50 mL 含有不同GSH 濃度（0、10 mmol/L）的水楊酸鈉（1 mol/L）的PBS（pH 7.4）緩沖液中，100 r/min 恒定振速和37 ℃溫度下，考察紫杉醇制劑的體外釋放特性。分別在0、1、3、6、8、10、12 h 用相同體積的新鮮釋放介質更新釋放介質，HPLC 測定釋放介質中的紫杉醇質量濃度，計算各取樣時間點紫杉醇的累積釋放量。

體外釋藥結果如圖6 所示。當GSH 濃度為0 mmol/L 時，PTX-HSU 和PTX-HU 在12 h 時累積釋藥量分別為76.31%和67.24%，二者釋藥趨勢一致，均無快速釋藥的趨勢；而在GSH 濃度為10 mmol/L時，PTX-HU 累積釋放量僅為61.17%，而PTX-HSU累積釋放量則已經達到89.18%；PTX-HU 載藥膠束無論是0 μmol/L 或是10 mmol/L 的GSH 釋放介質中，累積釋放量相差不大；相對來說，PTX-HSU 在0 μmol/L 的GSH 釋放介質中的12 h 累積釋放量與PTX-HU 釋放趨勢一致，但是在10 mmol/L 的GSH釋放介質中在3 h 內釋放量急劇增加，呈現出快速釋放現象，推測原因可能是因為HSU 分子結構中的二硫鍵被釋放介質中的GSH 切斷，促使處于PTXHSU 載藥膠束核心的紫杉醇快速釋放，證明HSU具有還原響應快速釋藥的能力。

2.7 體外逆轉耐藥

MCF-7 和MCF-7/ADR 細胞分別以1×104個/孔接種于96 孔板，細胞貼壁24 h 后，棄去培養基，不同紫杉醇質量濃度（0.001、0.01、0.1、1、10、100 μg/mL）的不同組（對照、紫杉醇、PTX-HSU、PTXHU）含藥培養基培養48 h 后，棄去含藥培養基，100 μL/孔加入MTT 溶液（1 mg/mL），37 ℃培養4 h 后，棄去培養液，加入150 μL DMSO，570 nm 波長測定吸光度。計算紫杉醇各制劑的半抑制濃度（50% inhibiting concentration，IC50），按照公式和分別計算耐藥倍數和逆轉倍數[20]。結果表明（表2），紫杉醇各制劑組對2 種乳腺癌細胞均呈現出濃度相關性的細胞毒性，且PTX-HSU 制劑組的IC50明顯低于PTX-HU 和紫杉醇組，說明HSU 膠束作為載體可增強紫杉醇對腫瘤細胞的殺傷作用。

表2 體外逆轉MDR 細胞毒性結果 (±s, n = 3)Table 2 Results of in vitro reversal of MDR cytotoxicity (±s, n = 3)

表2 體外逆轉MDR 細胞毒性結果 (±s, n = 3)Table 2 Results of in vitro reversal of MDR cytotoxicity (±s, n = 3)

與紫杉醇組比較：*P＜0.05**P＜0.01***P＜0.001；與PTX-HU 組比較：#P＜0.05##P＜0.01###P＜0.001*P＜0.05**P＜0.01***P＜0.001 vs paclitaxel group;#P＜0.05##P＜0.01###P＜0.001 vs PTX-HU group

質量濃度/(μg?mL?1)MCF-7 細胞存活率/% MCF-7/ADR 細胞存活率/%紫杉醇 PTX-HU PTX-HSU 紫杉醇 PTX-HU PTX-HSU 0.001 85.59±1.46 80.34±1.36 76.34±0.63* 99.11±1.68 97.63±1.49 96.37±3.20 0.01 72.81±3.59 52.94±0.97* 41.11±1.20**# 98.16±1.22 97.55±3.64 94.62±1.11 0.1 30.20±1.90 25.46±0.29 24.23±1.04* 94.00±1.00 93.15±2.18 93.33±0.78 1 24.39±0.17 21.41±0.15* 20.62±0.96* 87.03±2.19 84.74±0.39 66.32±3.63**##10 19.72±0.14 13.48±0.41*** 11.93±0.07***# 72.93±3.01 70.97±1.09 41.88±4.50***##100 12.98±0.20 9.64±0.36* 9.30±0.18** 42.18±0.27 41.46±0.95 30.14±0.94***###

在MCF-7 的細胞毒性結果中，紫杉醇、PTXHU 以及PTX-HSU 組的IC50分別為0.028、0.013、0.006 μg/mL，其中PTX-HU 制劑組IC50是紫杉醇組的2.15 倍，推測這可能是MCF-7 細胞表面過度表達CD44 受體（透明質酸靶向受體），MCF-7 細胞通過受體介導的內吞作用增加對PTX-HU 的攝取，使得更多的紫杉醇進入細胞內；而PTX-HSU 組IC50分別是PTX-HU 組和紫杉醇組的2.17 倍和4.67 倍，推測一方面可能是由于在受體介導的主動靶向攝取載藥膠束后腫瘤細胞內強還原敏感環境切斷了HSU 膠束中還原感二硫鍵，使得PTX-HSU 中紫杉醇相對紫杉醇組更多進入細胞的基礎上，快速從膠束內釋放出來，顯著提高了抗腫瘤活性；另一方面，熊果酸自身就具有殺傷腫瘤細胞的能力，可能是HSU 膠束斷裂后的疏水端熊果酸起到了殺傷MCF-7 細胞的作用。

在MCF-7/ADR 的細胞毒性結果中，紫杉醇、PTX-HU 以及PTX-HSU 組的IC50分別為15.01、13.09、1.39 μg/mL。為考察MCF-7/ADR 細胞對紫杉醇的耐藥強度以及是否可以作為體外逆轉MDR的細胞模型，通過計算得到MCF-7/ADR 細胞對紫杉醇的耐藥倍數為533，表明此細胞對紫杉醇呈現出較強的耐藥性，可以作為逆轉MDR 的細胞模型。MTT 結果表明，紫杉醇各制劑組均顯示出濃度依賴性的細胞毒性，通過各組制劑的IC50值計算MDR逆轉倍數發現，PTX-HSU 組和PTX-HU 組相對紫杉醇組逆轉倍數分別為10.79 倍和1.15 倍，且PTXHSU 組是PTX-HU 組的9.41 倍，表明HSU 載藥系統在逆轉乳腺癌MDR 方面呈現出明顯的優勢。原因推測一方面可能是由于HSU 通過透明質酸受體介導的內吞和連接臂CYS 還原敏感快速釋藥增效紫杉醇；另一方面可能與HSU 中疏水端熊果酸具有多靶點殺傷腫瘤耐藥細胞的活性有關。

2.8 體外逆轉耐藥的細胞機制研究

2.8.1 HSU/HU 對細胞定性攝取的影響 MCF-7/ADR 細胞以1×105個/孔接種于24 孔板，按照0.5 mL/孔接種于24 孔板，37 ℃培養24 h 后，棄去培養基，分別加入含有C6-HSU 和C6-HU（膠束質量濃度為80 μg/mL）的培養基，37 ℃孵育0.5 h 后，棄去培養基，PBS 洗5 次，于倒置熒光顯微鏡下成像。結果如圖7 所示，在相同條件下，給以C6-HSU干預的細胞內熒光強度顯著強于給以C6-HU 干預的細胞。據文獻報道[17]，透明質酸的結構中羧基是透明質酸靶向受體（CD44 受體）的識別位點，其羧基的修飾程度與其靶向性有關；因此，推測可能是由于HU 結構中透明質酸骨架上的羧基修飾程度大于HSU，影響了其靶向效率，導致用C6-HU 干預的細胞內綠色熒光強度較弱；進一步推測，HSU 很可能可以通過增加乳腺癌耐藥細胞對其的攝取量，以增加進入細胞內化療藥物的量，相對于單純的化療藥，在耐藥細胞同步外排的作用下，HSU 干預的細胞內化療藥有望具有更多的有效積累藥量，來發揮部分逆轉MDR 的作用。

圖7 定性考察細胞對HSU 與HU 的攝取情況 (×400)Fig. 7 Qualitative examination of cellular uptake of HSU and HU (× 400)

2.8.2 HSU/HU 對細胞定量攝取的影響 細胞以5×105個/孔的細胞量接種于6 孔板中，按照2 mL/孔接種于6 孔板，37 ℃培養24 h 后，棄去培養基，分別加入含有C6-HSU 和C6-HU（膠束質量濃度為100 μg/mL）的培養基，37 ℃孵化4 h 后，移去上層供試液，加入預冷PBS 洗3 遍終止攝取。往6 孔板中加入消化液，收集細胞，2000 r/min 離心3 min，棄去上清液，用預冷PBS 洗3 遍后加入0.7 mL PBS重懸，在流式細胞儀的FL2 通道（Ex488 nm）檢測C6 含量，分析結果。在競爭性抑制實驗中，預先用質量濃度為10 mg/mL 的透明質酸溶液孵育2 h，再重復上述實驗步驟。結果如表3 所示，在相同質量濃度下，HSU-C6 和HU-C6 組的熒光強度均大于游離C6（P＜0.001），說明C6 探針經膠束包載后，在透明質酸的主動靶向作用下促進了細胞對C6 的攝取。HSU-C6 和HU-C6 相比，還原敏感型HSU 膠束組的熒光強度更強，推測是因為HSU 含有二硫鍵，可以使C6 快速釋放從而促進C6 在細胞內的累積。同時，實驗結果也表明，隨著膠束濃度的增加，熒光強度也隨之增加，說明細胞對膠束攝取呈現一定的質量濃度相關性。

表3 定量考察細胞對HSU 與HU 的攝取情況 (±s, n = 3)Table 3 Quantitative examination of cellular uptake of HSU and HU (±s, n = 3)

表3 定量考察細胞對HSU 與HU 的攝取情況 (±s, n = 3)Table 3 Quantitative examination of cellular uptake of HSU and HU (±s, n = 3)

與C6 組比較：***P＜0.001；與HU-C6 組比較：###P＜0.001；與透明質酸＋HSU-C6 組比較：ΔΔP＜0.01***P＜0.001 vs C6 group;###P＜0.001 vs HU-C6;ΔΔP＜0.01 vs HA +HSU-C6 group

組別 劑量/(μg?mL?1) 熒光強度C6 ? 265.06±6.54 HU-C6 80 677.61±30.84***透明質酸＋HSU-C6 80 727.17±22.23***HSU-C6 80 824.15±13.24***###ΔΔ

為進一步闡明膠束攝取機制，采用10 mg/mL 的透明質酸溶液先與細胞孵育，再加入HSU 膠束孵育。結果發現，HSU 膠束的攝取被顯著抑制，熒光強度均顯著低于不加透明質酸孵育的HSU 組（P＜0.01），此結果表明HSU 膠束是通過透明質酸受體介導的內吞而被攝取的。

2.8.3 HSU 對胞內GSH 濃度的影響 MCF-7/ADR細胞以1×106個/孔接種于6 孔板，37 ℃培養24 h后，棄去培養基，用含有HA-CYS、HSU、HU 的培養基干預48 h 后，還原型谷胱甘肽測定試劑盒檢測細胞內GSH 水平。結果表明（表4），相對于對照組，HA-CYS 均可顯著（P＜0.05）降低細胞內的GSH表達水平，推測可能是由于HA-CYS 中的二硫鍵與細胞內GSH 相互作用，胞內GSH 在此過程中得到消耗；HSU 在HA-CYS 的基礎上，進一步降低了細胞內的GSH 表達水平（P＜0.001），也可能與HSU釋放的熊果酸有關，此結果與文獻中報道熊果酸可以在一定程度上抑制細胞內GSH 表達結果一致[21]。

表4 胞內GSH 的測定結果 (±s, n = 3)Table 4 Determination results of intracellular GSH (±s,n = 3)

表4 胞內GSH 的測定結果 (±s, n = 3)Table 4 Determination results of intracellular GSH (±s,n = 3)

與對照組比較：*P＜0.05**P＜0.01***P＜0.001；與HA-CYS 組比較：###P＜0.001；與HU 組比較：ΔP＜0.05*P < 0.05**P < 0.01***P < 0.001 vs control group;###P < 0.001 vs HA-CYS group;ΔP < 0.05 vs HU group

組別 GSH/(mmol?L?1) 組別 GSH/(mmol?L?1)對照 43.3±4.7 HU 19.2±1.7**HA-CYS 30.0±8.2* HSU 7.5±0.7***###Δ

HU 干預細胞48 h 后，相對對照組也顯著性降低了細胞內GSH 表達水平（P＜0.01），推測也可能是HU 釋放了熊果酸有關；但是經HU 干預后的胞內GSH 表達水平顯著性地高于HSU（P＜0.05），可能是由于HU 結構中沒有二硫鍵，既不能像HACYS 一樣消耗細胞內GSH，也不能像HSU 一樣快速釋放熊果酸所致；文獻報道[22]，與GSH 相關的耐藥機制主要包括：（1）GST-π 可以催化GSH 與化療藥物結合，使化療藥物易于從尿液中排出或代謝為無毒性的醇類物質；（2）GSH 的結構可以作為細胞外排MRP 泵的底物，GST-π 可以通過調節GSH 而控制MRP 的耐藥程度。以上機制均表明胞內GSH濃度下降后均能減少化療藥外排。因此，推測HSU中的還原敏感二硫鍵與熊果酸共同作用，通過降低癌細胞內GSH 的水平，進一步降低了腫瘤細胞對紫杉醇的外排和代謝，來發揮逆轉乳腺癌MDR 的作用。

3 討論

本研究成功合成了還原敏感型和非還原敏感型透明質酸-熊果酸聚合物HSU 和HU。其中熊果酸以藥載兩用的形式，成功改善了其腫瘤靶向特異性低、水溶性差的缺點，提高了其生物利用度和臨床應用。以HSU/HU 為載體成功制備了可高效負載紫杉醇的載藥膠束PTX-HSU 和PTX-HU，在體外還原性環境中，PTX-HSU 制劑顯示出還原響應快速釋放藥物的能力。PTX-HSU 和PTX-HU 均呈現出濃度依賴性的細胞毒性，其中HSU 不僅可以增強紫杉醇對MCF-7 細胞的抗腫瘤活性，而且可以增強紫杉醇對MCF-7/ADR 細胞的殺傷作用，在逆轉乳腺癌MDR 方面呈現出一定的優勢，實現了HSU 對乳腺癌MDR 的逆轉目標。

通過對體外逆轉耐藥的細胞研究推測出，HSU是通過：（1）受體介導的胞吞作用進入MCF-7/ADR細胞內，增加MCF-7/ADR 細胞對HSU 的攝取量，以增加細胞內藥物的有效積累來逆轉MDR；（2）顯著性地降低MCF-7/ADR 細胞中的GSH 表達水平，從而減少GSH 相關的藥物外排以逆轉MDR。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突