鹽炙小茴香醋酸乙酯部位化學成分及抗酪氨酸酶活性研究

董維茂，朱奎霖，楊 興，尹 蕊，鄧徐麗，陳章賢，張洪川，王一謀，何紅平，董發武

云南中醫藥大學中藥學院 云南省南藥可持續利用研究重點實驗室，云南 昆明 650500

小茴香為傘形科植物茴香FoeniculumvulgareMill.的干燥成熟果實[1]，其原名蘹香。其藥用歷史悠久，始載于《唐本草》，有1 千多年藥用歷史[2]。除藥用外，小茴香還是常用的食品香料，故為藥食兩用之佳品。小茴香分布廣泛，主要分布于地中海地區[3]，我國主要分布于西北地區的山西、甘肅、內蒙古，以及東北地區的遼寧等地區[4]，其資源豐富，以栽培為主，栽培面積廣泛，其中以山西產量最大、內蒙古河套附近產品質優。

小茴香味辛、性溫，具有散寒止痛、理氣和胃之功效[5-6]。小茴香化學成分主要為苯丙素，以及糖苷、脂肪油、黃酮、酚酸等多種類型的化合物[7]以及部分含量較少的無機元素。現代研究表明，小茴香具有改善腸道微生物平衡、促進胃腸運動、抗菌、抗腫瘤、鎮痛抗炎等的作用[8-15]。其中主要成分苯丙素類化合物還具有抑制酪氨酸酶活性的作用[16]。包括雀斑在內的皮膚病都與黑色素的合成有關，其中酪氨酸酶作為黑色素形成的關鍵性調節酶[17-20]。因此，從天然產物中尋找抑制酪氨酸酶活性的化合物成為該領域中研究的熱點。目前，對小茴香生品的研究主要注重于揮發油成分，然而關于小茴香鹽炙品化學成分及藥理活性研究報道不多，因此本實驗對小茴香鹽炙品進行成分分離純化，從其醋酸乙酯部位分離得到 20 個化合物，分別鑒定為bombasinol A（1）、齊墩果酸（oleanolic acid，2）、山柰素（kaempferide，3）、槲皮素（quercetin，4）、(1R,2R)-1-(4-methoxypheny)propane-1,2-diol（5）、(1S,2R)-1-(4-methoxyphenyl)propane-1,2-diol（6）、(3S,5R,6S,7E)-3,5,6-trihydroxy-7-megastigmen-9-one（7）、齊墩果酮酸（oleanonic acid，8）、刺五加酮（acanthone，9）、phenylpropanoid（10）、(Z)-4-[30-(β-D-glucopyranosyloxy)butylidene]-3,5,5-trimethyl-2-cyclohexen-l-one （ 11 ）、 3-oxo-α-ionol-β-Dglucopyranoside（12）、(+)-松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷 [(+)-pinoresinol-β-D-glucopyranoside，13]、trans-4-(1-propenyl)-phenol-β-D-glucopyranoside（14）、1-O-β-D-glucopyranosyl-4-allybenzene （ 15 ）、 3-hydroxyestragole β-D-glucopyranoside（16）、黃花夾竹桃黃酮（thevetiaflavone，17）、3,5-dihydroxyestragole 3-O-β-D-glucopyranoside（18）、水楊酸（salicylic acid，19）和benzyl β-D-glucopyranoside（20）。并對分離的單體成分進行了體外抗酪氨酸酶的活性研究。此外，通過分子對接推測其可能的相互作用機制。

1 材料與儀器

1.1 材料

酪氨酸酶（Sigma-Aldrich 公司）；L-酪氨酸（上海麥克林生化科技有限公司）、β-熊果苷（上海源葉生物科技有限公司，質量分數98%）；色譜硅膠（200～300、300～400 目，青島海洋化工廠）；GF254薄層色譜硅膠（青島海洋化工廠）；LH-20 羥丙基葡聚糖凝膠（Sephadex LH-20，美國Pharmacia 公司）；MCI 樹脂（日本三菱化學公司）；反相C18柱色譜材料（ODS，德國Merck 公司）；D101 大孔吸附樹脂（天津市大鈞科技有限公司）；薄層色譜顯色劑（10%硫酸乙醇溶液）；甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇、醋酸乙酯、二氯甲烷、石油醚等試劑為重蒸的工業或化學純溶劑；色譜乙腈（上海星可高純溶劑有限公司）。

小茴香藥材于2022年9月購自新螺螄灣藥材市場，由云南中醫藥大學李宏哲副教授鑒定為傘形科植物茴香F.vulgareMill.的干燥成熟果實，標本（D2022-001）保存于云南省高校民族藥質量標準研究重點實驗室。

1.2 儀器

Synergy2 多功能酶標儀（美國BIOTEK 公司）；Bruker Avance III 400 MHz 及Bruker DRX 500 MHz超導核磁共振儀，TMS 為內標（德國Bruker 公司）；Agilent 1200 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；離子井飛行時間質譜儀Esquire HCT 型（德國Bruker 公司）；萬分之一分析天平FA2004（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；循環水式多用真空泵SHB-Ⅲ（鞏義市予華儀器有限公司）；海道夫旋轉蒸發儀Hei-VAP Core HL/G（德國heidolph 公司）。

2 提取與分離

2.1 小茴香的鹽炙

取小茴香20 kg，加入2000 mL 配制好的0.2 g/mL 鹽水，密封，燜透30 min，而后置炒制容器內，以文火加熱，不間斷翻炒，并炒至微黃且至規定程度時，取出，放涼備用。

2.2 提取

鹽炙小茴香樣品20 kg 粉碎過篩（10 目），在10 L 的75%乙醇中（10 L×2 h×5）回流提取。合并得提取液，通過減壓濃縮得到2.387 kg 粗提物，粗提物加水混懸并使用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇依次分別萃取5 次，合并萃取液，減壓濃縮得到石油醚相（203.6 g）、醋酸乙酯相（73.9 g）、正丁醇相（316.7 g）和水相（759.3 g）。

2.3 分離及純化

醋酸乙酯部位經正向硅膠色譜（200～300 目），以二氯甲烷-甲醇（100∶1～1∶1）梯度洗脫，得到7 個組分（Fr. 1～7）。Fr. 2（13.9 g）經MCI 柱色譜以甲醇-水（30∶70～100∶0）梯度洗脫，得到6 個流分（Fr. 2.1～2.6），Fr. 2.3 經Sephadex LH-20 色譜（甲醇）進行分離，再通過二次凝膠得到Fr. 2-3-1-1，Fr.2-3-1-1 經半制備液相（乙腈-水24∶76；體積流量3 mL/min；檢測波長365 nm）純化得化合物1（3.0 mg）。Fr. 2.4 經反相ODS 柱色譜，以甲醇-水（30∶70～100∶0）洗脫，經Sephadex LH-20 色譜（甲醇）純化得化合物2（52.4 mg）。Fr. 2.5 經Sephadex LH-20 色譜（甲醇）分離再經半制備液相（乙腈-水20∶80；體積流量3 mL/min；檢測波長365 nm）純化得化合物19（13.4 mg）。Fr.2.6 經Sephadex LH-20 色譜（甲醇）分離純化得化合物3（2.4 mg）。Fr. 2.6.5 經MCI 柱色譜以甲醇-水（30∶70～100∶0）梯度洗脫，再經Sephadex LH-20色譜（甲醇）分離純化得化合物4（8.8 mg）。Fr.4（9.1 g）經正向硅膠色譜（200～300 目），以石油醚-醋酸乙酯（6∶1～1∶1）梯度洗脫，再經Sephadex LH-20 色譜（甲醇）分離得化合物7（1.9 mg）和8（4.0 mg），再通過半制備液相（乙腈-水15∶85；體積流量3 mL/min；檢測波長：365 nm）純化得化合物5（17.6 mg）和6（12.9 mg）。Fr.5（8.2 g）經正向硅膠色譜（200～300 目），以石油醚-醋酸乙酯（2∶1～1∶1）梯度洗脫，反相ODS 柱色譜，以甲醇-水（20∶80～100∶0）洗脫，再通過半制備液相（乙腈-水21∶79；體積流量3 mL/min；檢測波長254 nm）純化得化合物9（3.0 mg）。Fr. 26（11.0 g）經正向硅膠色譜（100～200 目），以二氯甲烷-甲醇（50∶1-1∶1）梯度洗脫，再經Sephadex LH-20 色譜（甲醇）分離半制備液相（乙腈-水26∶74；體積流量3 mL/min；檢測波長254 nm）純化得化合物10（3.0 mg）。Fr. 7（12.1 g）經正向硅膠色譜（100-200目），以二氯甲烷-甲醇（50∶1～1∶1）梯度洗脫得到9 個流分（Fr. 7.1～7.9），Fr. 7.5 以反相ODS 柱色譜，以甲醇-水（20∶80～100∶0）梯度洗脫得到6 個流分，Fr. 7.5.3 以Sephadex LH-20 色譜（甲醇）分離得到化合物13（5.0 mg），再以半制備液相色譜（乙腈-水33∶67；體積流量3 mL/min；檢測波長365 nm）純化得化合物11（6.0 mg）和12（6.0 mg），Fr.7.5.6 經Sephadex LH-20 色譜（甲醇）分離得再以半制備液相（乙腈-水 46∶54；體積流量 3 mL/min；檢測波長365 nm）純化得化合物20（18.8 mg），Fr. 7.6 以反相ODS 柱色譜，以甲醇-水（20∶80～100∶0）梯度洗脫得到6 個流分，Fr.7.6.4經正向硅膠二氯甲烷-甲醇（50∶1）等度洗脫再以半制備液相（乙腈-水12∶88；體積流量3 mL/min；檢測波長365 nm）純化得化合物16（17.0 mg），Fr.7.6.2 經Sephadex LH-20 色譜（甲醇）分離得再以半制備液相（乙腈-水15∶85；體積流量3 mL/min；檢測波長365 nm）純化得化合物14（9.9 mg）和15（24.3 mg），Fr. 7.9 以正向硅膠色譜（100～200目），以二氯甲烷-甲醇（30∶1～1∶1）梯度洗脫得Fr. 7.9.2，Fr. 7.9.2 經 MCI 柱色譜以甲醇-水（20∶80～100∶0）梯度洗脫，再經Sephadex LH-20色譜（甲醇）分離最后以半制備液相（乙腈-水23∶77；體積流量3 mL/min；檢測波長254 nm）純化得化合物17（4.2 mg）和18（32.6 mg）。

3 酪氨酸酶抑制活性測試

3.1 溶液的配制

3.1.1 磷酸鹽緩沖液的配制 精密量取20 mL 10×PBS 緩沖液，用超純水稀釋至200 mL，最后使用0.2 mol/L 氫氧化鈉調節pH 6.5～7.5（規定范圍）即得PBS 緩沖液。

3.1.2 酪氨酸酶試液的配制 精密移取提前分裝好的1000 units/mL 的酪氨酸酶9 mL，加入PBS 緩沖液稀釋至30 mL 即得300 units/mL 的酪氨酸酶試液，將試液放入?20 ℃冰箱待用。

3.1.3L-酪氨酸溶液的配制 精密稱取5 mgL-酪氨酸粉末于100 mL EP 管中加入50 mL PBS 緩沖液，搖勻，即得0.1 mg/mLL-酪氨酸溶液，放置，待用。

3.1.4 樣品溶液的配制

（1）陽性藥溶液的配制：精密稱取β-熊果苷4 mg，加入30 μL DMSO 使其完全溶解，再使用移液槍精密加入970 μL PBS 即得4 mg/mL 陽性藥試液，再將陽性藥依次梯度稀釋濃度為2、1、0.5、0.25 mg/mL，待用。

（2）待測樣品溶液的配制：精密稱取樣品適量，加入30 μL DMSO 使其完全溶解，再精密加入PBS使其質量濃度依次為1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg/mL；其中化合物15 稀釋質量濃度依次為0.25、0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625 mg/mL，待用。

3.2 酪氨酸酶活性抑制率的測定

用移液槍按表的體積向96 孔板依次加入PBS緩沖液、不同濃度梯度的化合物受試液、不同濃度梯度的熊果苷對照液和酪氨酸酶液，37 ℃下孵育10 min 后，加入L-酪氨酸試液，同等條件下孵育30 min，孵育完成后立即放入多功能酶標儀在492 nm測定其吸光度（A），并記錄數據，每個濃度實驗做3 個平行組，使用3 組數據的平均值，按照公式計算測定化合物對酪氨酸酶的抑制率。

T 為加樣品且加酪氨酸的反應液組別；B 為加樣品且未加酪氨酸的反應液組別；C 為未加樣品且加酪氨酸的反應液組別；N 為未加樣品且未加酪氨酸的反應液組別；AT為T 組反應液在492 nm 處測得的A值；AB為B 組反應液在492 nm 處測得的A值；AC為C 組反應液在492 nm 處測得的A值；AN為N 組反應液在492 nm 處測得的A值

3.3 數據處理與分析

運用IBM SPSS Statistics 26 進行計算IC50，并采用GraphPad Prism 9 軟件進行做圖。

4 分子對接

4.1 化合物結構的獲取與處理

在Chemdraw 2D 中畫出所需化合物的2D 平面結構，再通過Chemdraw 3D 將其轉化為PDB 格式的3D 結構文件。

4.2 靶蛋白的獲取與處理

從PDB 數據庫（https://www.rcsb.org/）獲得酪氨酸酶蛋白的PDB 格式的三維晶體結構文件，運用OpenBabel 2.4.1、AutoDockTools 1.5.7 軟件進行前期處理，得到相對應的PDB 文件，備用。

4.3 化合物與靶蛋白的對接

將上述處理好的化合物與靶蛋白文件導入Autodock vina，并通過Autodock vina 進行分子對接，最后將Autodock vina 對接并對對接結果打分，將得到的PDB 格式文件，使用PyMol 軟件對分子對接結果進行可視化。

5 結果與分析

5.1 結構鑒定

化合物1：黃色油狀物，分子式為C21H24O6，HR-ESI-MSm/z: 395.146 0 [M＋Na]+（計算值395.146 5）。1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ: 6.95(1H, d,J= 1.9 Hz, H-2′), 6.82 (1H, dd,J= 8.1, 1.9 Hz, H-6′), 6.77 (1H, d,J= 8.1 Hz, H-5′), 6.66 (2H, d,J= 1.5 Hz, H-2, 6), 4.72 (2H, d,J= 4.2 Hz, H-7, 7′),4.25 (2H, dd,J= 9.1, 6.7 Hz, H-9α, 9′α), 3.88 (3H, s,3′-OMe), 3.86 (6H, s, 3, 5-OMe), 3.85 (2H, dd,J=8.5, 3.5 Hz, H-9β, 9′β), 3.15 (2H, m, H-8, 8′)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ: 149.4 (C-3, 5), 149.2(C-3′), 147.4 (C-4′), 134.3 (C-1), 133.8 (C-1′), 120.1(C-6′), 116.1 (C-5′), 111.0 (C-2′), 106.2 (C-4), 104.5(C-2, 6), 87.7 (C-7), 87.5 (C-7′), 72.7 (C-9′), 72.6(C-9), 56.8 (3, 5-OMe), 56.4 (3′-OMe), 55.6 (C-8),55.3 (C-8′)。以上數據與文獻報道一致[21]，故鑒定化合物1 為bombasinol A。

化合物2：白色固體，分子式為C30H48O3，HR-ESI-MSm/z: 479.348 8 [M＋Na]+（計算值479.349 6）。1H-NMR (400 MHz, Pyridine-d5)δ: 5.52(1H, s, H-12), 3.47 (1H, m, H-3α), 3.33 (1H, dd,J=14.1, 4.6 Hz, H-18), 1.31 (3H, s, H-27), 1.27 (3H, s,H-23), 1.05 (9H, s, H-24, 25, 30), 0.97 (3H, s, H-29),0.92 (3H, s, H-26)；13C-NMR (100 MHz, Pyridine-d5)δ: 180.7 (C-28), 145.3 (C-13), 123.0 (C-12), 78.6(C-3), 56.3 (C-5), 48.6 (C-4), 47.2 (C-9), 46.9 (C-17),42.7 (C-19), 42.5 (C-14), 40.2 (C-18), 39.9 (C-1), 39.4(C-8), 37.9 (C-10), 37.7 (C-2), 33.8 (C-21), 33.8(C-29), 33.7 (C-22), 31.4 (C-7), 29.3 (C-20), 28.8(C-15), 28.6 (C-23), 26.6 (C-27), 24.3 (C-30), 24.2(C-1), 24.2 (C-16), 19.3 (C-24), 17.9 (C-6), 17.0(C-26), 16.0 (C-25)。以上數據與文獻報道一致[22]，故鑒定化合物2 為齊墩果酸。

化合物3：黃色粉末，分子式為C16H12O6，HR-ESI-MSm/z: 323.052 4 [M＋Na]+（計算值323.052 6）。1H-NMR (600 MHz, CD3OD)δ: 8.08(2H, d,J= 8.5 Hz, H-2′, 6′), 6.90 (2H, d,J= 8.5 Hz,H-3′, 5′), 3.34 (3H, s, 4′-OMe)；13C-NMR (150 MHz,CD3OD)δ: 177.4 (C-4), 165.6 (C-7), 162.5 (C-9),160.6 (C-4′), 158.3 (C-5), 148.1 (C-2), 137.2 (C-3),130.7 (C-2′, 6′), 123.8 (C-1′), 116.3 (C-3′, 5′), 104.5(C-10), 99.3 (C-6), 94.4 (C-8), 56.5 (4′-OMe)。以上數據與文獻報道一致[23]，故鑒定化合物3 為山奈素。

化合物4：黃色粉末，分子式為C15H10O7，HRESI-MSm/z: 303.049 2 [M＋H]+（計算值303.049 9）。1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ: 7.75 (1H, d,J= 2.2 Hz, H-2′), 7.65 (1H, dd,J= 8.4, 2.2 Hz, H-6′), 6.90(1H, d,J= 8.4 Hz, H-5′), 6.40 (1H, d,J= 2.0 Hz,H-8), 6.19 (1H, d,J= 2.0 Hz, H-6)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ: 177.4 (C-4), 165.6 (C-7), 162.5(C-5), 158.2 (C-9), 148.8 (C-2), 148.0 (C-4′), 146.2(C-3′), 137.3 (C-3), 124.2 (C-1′), 121.7 (C-6′), 116.2(C-5′), 115.9 (C-2′), 104.5 (C-10), 99.2 (C-6), 94.4(C-8)。以上數據與文獻報道一致[24]，故鑒定化合物4 為槲皮素。

化合物5：無色針狀結晶（甲醇），分子式為C10H14O3，HR-ESI-MSm/z: 205.082 6 [M＋Na]+（計算值205.083 5）。1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ:7.26 (2H, d,J= 8.7 Hz, H-2, 6), 6.86 (2H, d,J= 8.7 Hz, H-3, 5), 5.08 (1H, d,J= 5.0 Hz, H-1′), 4.40 (1H,dq,J= 5.0, 6.0 Hz, H-2′), 3.75 (3H, s, 4-OMe), 1.09(1H, d,J= 6.0 Hz, H-3′)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ: 160.5 (C-4), 135.4 (C-1), 129.2 (C-2, 6),114.4 (C-3, 5), 78.7 (C-1′), 72.4 (C-2′), 55.6 (4-OMe),18.4 (C-3′)。以上數據與文獻報道一致[25]，故鑒定化合物 5 為 (1R,2R)-1-(4-methoxyphenyl)propane-1,2-diol。

化合物6：無色針狀結晶（甲醇），分子式為C10H14O3，HR-ESI-MSm/z: 205.082 5 [M＋Na]+（計算值205.083 5）。1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ:7.23 (2H, d,J= 8.7 Hz, H-2, 6), 6.86 (2H, d,J= 8.7 Hz, H-3, 5), 4.26 (1H, d,J= 7.0 Hz, H-1′), 3.82 (1H,dq,J= 6.0, 7.0 Hz, H-2′), 3.75 (3H, s, 4-OMe), 0.91(1H, d,J= 6.0 Hz, H-3′)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ: 160.7 (C-4), 135.3 (C-1), 129.3 (C-2, 6),114.6 (C-3, 5), 79.9 (C-1′), 72.9 (C-2′), 55.6 (4-OMe),19.2 (C-3′)。以上數據與文獻報道一致[25]，故鑒定化合物6 為 (1S,2R)-1-(4-methoxyphenyl) propane-1,2-diol。

化合物7：白色針狀結晶（甲醇），分子式為C13H22O4，HR-ESI-MSm/z: 265.142 5 [M＋Na]+（計算值265.141 0）。1H-NMR (600 MHz, CD3OD)δ:7.15 (1H, d,J= 15.7 Hz, H-7), 6.16 (1H, d,J= 15.7 Hz, H-8), 3.74 (1H, m, H-3), 2.29 (1H, ddd,J= 14.3,5.0, 1.7 Hz, H-4a), 2.28 (3H, s, H-10), 1.64 (1H, dd,J= 14.3, 9.2 Hz, H-4b), 1.56 (1H, ddd,J= 12.9, 3.4,1.7 Hz, H-2a), 1.25 (1H, m, H-2b), 1.18 (3H, s, H-12),1.16 (3H, s, H-13), 0.94 (3H,s, H-11)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ: 200.3 (C-9), 145.4 (C-7), 133.8(C-8), 70.8 (C-6), 68.8 (C-5), 64.4 (C-3), 47.7 (C-2),41.3 (C-4), 36.1 (C-1), 29.8 (C-12), 27.4 (C-10), 25.1(C-11), 20.0 (C-13)。以上數據與文獻報道一致[26]，故鑒定化合物 7 為 (3S,5R,6S,7E)-3,5,6-trihydroxy-7-megastigmen-9-one。

化合物 8：白色無定形粉末，分子式為C30H46O3，HR-ESI-MSm/z: 455.351 4 [M＋H]+（計算值455.352 0）。1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 5.30(1H, s, H-12), 2.84 (1H, m, H-18), 2.54 (1H, m, H-2),2.36 (1H, m, H-2), 1.14 (3H, s, H-27), 1.08 (3H, s,H-23), 1.05 (3H, s, H-25), 1.03 (3H, s, H-24), 0.93(3H, s, H-30), 0.91 (3H, s, H-29), 0.81 (3H, s, H-26)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3)δ: 217.9 (C-3), 183.7(C-28), 143.8 (C-13), 122.6 (C-12), 55.5 (C-5), 47.6(C-4), 47.0 (C-9), 46.7 (C-17), 45.9 (C-19), 41.9(C-14), 41.2 (C-18), 39.4 (C-1), 39.3 (C-8), 36.9(C-10), 34.3 (C-2), 33.9 (C-21), 33.2 (C-29), 32.6(C-22), 32.3 (C-7), 30.8 (C-20), 27.8 (C-15), 26.6(C-23), 25.9 (C-27), 23.7 (C-30), 23.6 (C-1), 23.1(C-16), 21.6 (C-24), 19.7 (C-6), 17.2 (C-26), 15.2(C-25)。以上數據與文獻報道一致[27]，故鑒定化合物8 為齊墩果酮酸。

化合物9：無色針狀結晶（甲醇），分子式為C22H26O9，HR- ESI-MSm/z: 435.165 3 [M＋H]+（計算值435.165 0）。1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ:7.35 (2H, s, H-2, 6), 6.69 (2H, s, H-2′, 6′), 4.61 (1H, s,H-7′), 4.26 (1H, m, H-8), 4.19 (2H, m, H-9a, 9b), 3.88(6H, s, 3, 5-OMe), 3.82 (6H, s, 3′, 5′-OMe), 3.64 (2H,m, H-9′a, 9′b), 2.61 (1H, m, H-8′)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ: 200.3 (C-7), 149.2 (C-3′, 5′), 148.1(C-3, 5), 136.2 (C-4), 132.9 (C-1′), 128.0 (C-1), 107.7(C-2, 6), 105.1 (C-2′, 6′), 85.4 (C-7′), 71.6 (C-9), 61.3(C-9′), 56.9 (3, 5-OMe), 56.8 (3′, 5′-OMe), 55.2(C-8′), 49.9 (C-8)。以上數據與文獻報道一致[28]，故鑒定化合物9 為刺五加酮。

化合物10：無色油狀物，分子式為C10H14O4，HR-ESI-MSm/z: 221.077 5 [M＋Na]+（計算值221.078 4）。1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ: 7.30(2H, d,J= 8.6 Hz, H-2′, 6′), 6.89 (2H, d,J= 8.6 Hz,H-3′, 5′), 4.55 (1H, d,J= 6.2 Hz, H-1), 3.78 (3H, s,4′-OMe), 3.66 (1H, m, H-2), 3.47 (1H, m, H-3b), 3.34(1H, m, H-3a)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ: 160.7(C-4′), 135.3 (C-1′), 129.1 (C-2′, 6′), 114.6 (C-3′, 5′),77.6 (C-2), 75.2 (C-1), 64.2 (C-3), 55.7 (4′-OMe)。以上數據與文獻報道一致[29]，故鑒定化合物10 為phenylpropanoid。

化合物11：無色針狀結晶（甲醇），分子式為C19H30O7，HR-ESI-MSm/z: 393.188 0 [M＋Na]+（計算值393.188 4）。1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ:5.97 (1H, t,J= 7.8 Hz, H-1′), 5.91 (1H, s, H-2), 4.43(1H, d,J= 7.8 Hz, H-1′′), 4.04 (1H, m, H-3′), 2.62 (2H,m, H-2′), 2.37 (2H, d,J= 6.0 Hz, H-6), 2.30 (3H, s, H-9),1.34 (3H, d,J= 5.3 Hz, H-4′), 1.22 (6H, s, H-7, 8)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ: 202.1 (C-1), 159.1(C-3), 143.7 (C-4), 134.4 (C-1′), 125.6 (C-2), 103.9(C-1′′), 78.2 (C-3′′), 77.9 (C-3′), 77.2 (C-5′′), 75.3(C-2′′), 71.7 (C-4′′), 62.8(C-6′′), 54.7 (C-6), 39.3(C-5), 37.7 (C-2′), 29.3 (C-8), 29.2 (C-7), 22.7 (C-9),22.2 (C-4′)。以上數據與文獻報道一致[30]，故鑒定化合物 11 為 (Z)-4-[30-(β-D-glucopyranosyloxy)butylidene]-3,5,5-trimethyl-2-cyclohexen-l-one。

化合物12：無色固體，分子式為C19H30O7，HR-ESI-MSm/z: 393.188 2 [M＋Na]+（計算值393.188 4）。1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ: 5.88(1H, s, H-4), 5.74 (1H, dd,J= 15.4, 9.3 Hz, H-7), 5.58(1H, dd,J= 15.4, 7.8 Hz, H-8), 4.49 (1H, m, H-9),4.34 (1H, d,J= 7.8 Hz, H-1′), 3.87 (1H, dd,J= 11.9,2.1 Hz, H-6′a), 3.64 (1H, dd,J= 11.9, 5.9 Hz, H-6′b),3.23 (4H, m, H-2′), 2.71 (1H, d,J= 9.3 Hz, H-6), 2.44(1H, d,J= 16.7 Hz, H-2b), 2.07 (1H, d,J= 16.7 Hz,H-2a), 1.94 (3H, d,J= 1.4 Hz, H-13), 1.28 (3H, d,J=5.9 Hz, H-10), 1.05 (3H, s, H-11), 1.03 (3H, s, H-12)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ: 201.9 (C-3), 165.5(C-5), 137.1 (C-8), 131.4 (C-7), 126.2 (C-4), 101.0(C-1′), 78.3 (C-3′), 78.2 (C-5′), 75.0 (C-2′), 74.8 (C-9),71.8 (C-4′), 62.9 (C-6′), 56.9 (C-6), 48.4 (C-2), 37.1(C-1), 28.1 (C-12), 27.7 (C-11), 23.7 (C-13), 22.2(C-10)。以上數據與文獻報道一致[31]，故鑒定化合物12 為3-oxo-α-ionol-β-D-glucopyranoside。

化合物13：無色針狀結晶（甲醇），分子式為C26H32O11，HR-ESI-MSm/z: 519.187 3 [M-H]?（計算值519.187 2）。1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ:6.86 (6H, m, H-2, 5, 6, 2′, 5′, 6′), 4.85 (1H, d,J= 7.0 Hz, H-1′′), 4.74 (1H, d,J= 4.0 Hz, H-7), 4.69 (1H, d,J= 4.0 Hz, H-7′), 4.22 (2H, m, H-9, 9′), 3.85 (6H, s, 3,3′-OMe), 3.11 (2H, m, H-8, 8′)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ: 150.9 (C-3′), 149.1 (C-3), 147.5 (C-4),147.3 (C-4′), 137.5 (C-1′), 133.7 (C-1), 120.1 (C-6),119.8 (C-6′), 117.9 (C-5), 116.1 (C-5′), 111.6 (C-2),110.9 (C-2′), 102.8 (C-1′′), 87.5 (C-7′), 87.1 (C-7),78.2 (C-5′′), 77.8 (C-3′′), 74.9 (C-2′′), 72.7 (C-9′), 72.7(C-9), 71.3 (C-4′′), 62.5 (C-6′′), 56.7 (3-OMe), 56.4(3′-OMe), 55.5 (C-8′), 55.4 (C-8)。以上數據與文獻報道一致[32]，故鑒定化合物13 為 (+)-pinoresinol-β-Dglucopyranoside。

化合物14：白色粉末狀結晶（甲醇），分子式為C15H20O6，HR-ESI-MSm/z: 319.115 2 [M＋Na]+（計算值319.115 2）。1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ:6.36 (1H, d,J= 15.8 Hz, H-7), 6.15 (1H, dq,J= 15.8,6.5 Hz, H-8), 3.80 (5H, m, H-2′～6′), 1.85 (3H, d,J=6.5 Hz, H-9)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ: 158.1(C-4), 133.8 (C-1), 131.6 (C-7), 127.8 (C-2, 6), 124.8(C-8), 117.8 (C-3, 5), 102.4 (C-1′), 78.1 (C-3′), 77.9(C-5′), 74.9 (C-2′), 71.4 (C-4′), 62.5 (C-6′), 18.5 (C-9)。以上數據與文獻報道一致[33]，故鑒定化合物14 為trans-4-(1-propenyl)-phenol-β-D-glucopyranoside。

化合物15：白色粉末狀結晶（甲醇），分子式為C15H20O6，HR-ESI-MSm/z: 319.114 9 [M＋Na]+（計算值319.115 2）。1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ:7.11 (2H, d,J= 8.6 Hz, H-2, 6), 7.03 (2H, d,J= 8.6 Hz, H-3, 5), 5.95 (1H, m, H-8), 5.06 (1H, d,J= 15.4 Hz, H-9b), 5.02 (1H, d,J= 8.9 Hz, H-9a), 3.90 (1H,dd,J= 12.0, 1.9 Hz, H-6b), 3.71 (1H, dd,J= 12.0, 4.8 Hz, H-6a), 3.45 (4H, m, H-2′～5′), 3.33 (2H, d,J= 7.1 Hz, H-7)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ: 157.5(C-4), 139.2 (C-8), 135.2 (C-1), 130.5 (C-3, 5), 117.8(C-2, 6), 115.7 (C-9), 102.5 (C-1′), 78.0 (C-3′), 77.9(C-5′), 74.9 (C-2′), 71.4 (C-4′), 62.5 (C-6′), 40.3(C-7)。以上數據與文獻報道一致[34]，故鑒定化合物15 為1-O-β-D-glucopyranosyl-4-allybenzene。

化合物16：無定形粉末，分子式為C16H22O7，HR-ESI-MSm/z: 350.1292 [M ＋Na]+（計算值350.129 2）。1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ: 7.03(1H, d,J= 2.0 Hz, H-2), 6.93 (1H, d,J= 8.3 Hz, H-5),6.83 (1H, dd,J= 8.3, 2.0 Hz, H-6), 5.96 (1H, ddt,J=17.0, 10.0, 6.8 Hz, H-2′), 5.69 (1H, d,J= 7.0 Hz,H-1′′), 5.09 (1H, dd,J= 10.0, 2.0 Hz, H-3′), 5.02 (1H,dd,J= 17.0, 2.0 Hz, H-3′), 3.84 (3H, s, 4-OMe), 3.32(2H, d,J= 6.8 Hz, H-1′)。13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ: 149.1 (C-3), 147.9 (C-4), 139.0 (C-2′),134.6 (C-1), 123.8 (C-6), 118.5 (C-2), 115.8 (C-3′),113.8 (C-5), 102.9 (C-1′′), 78.2 (C-3′′), 77.8 (C-5′′),74.9 (C-2′′), 71.3 (C-4′′), 62.5 (C-6′′), 56.9 (4-OMe),40.5 (C-1′)。以上數據與文獻報道一致[35]，故鑒定化合物16 為3-hydroxyestragole β-D-glucopyranoside。

化合物17：淡黃色粉末，分子式為C16H12O5，HR-ESI-MSm/z: 307.057 0 [M＋Na]+（計算值307.057 7）。1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ: 7.45(2H, d,J= 8.5 Hz, H-2′, 6′), 7.02 (2H, d,J= 8.5 Hz,H-3′, 5′), 6.22 (1H, d,J= 2.1 Hz, H-8), 6.19 (1H, d,J= 2.1 Hz, H-6), 3.78 (3H, s, 5-OMe)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ: 175.9 (C-4), 162.1 (C-7), 160.5(C-4′), 160.1 (C-2), 159.8 (C-5), 159.6 (C-9), 127.5(C-2′, 6′), 121.6 (C-1′), 115.9 (C-3′, 5′), 106.9 (C-3),106.7 (C-10), 96.7 (C-6), 96.0 (C-8), 57.6 (4-OMe)。以上數據與文獻報道一致[36]，故鑒定化合物17 為黃花夾竹桃黃酮。

化合物18：無色針狀結晶（甲醇），分子式為C16H22O8，HR-ESI-MSm/z: 365.120 6 [M＋Na]+（計算值365.120 7）。1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ:6.55 (1H, d,J= 2.0 Hz, H-2), 6.41 (1H, d,J= 2.0 Hz,H-6), 5.93 (1H, ddt,J= 16.9, 10.0, 6.7 Hz, H-2′), 5.73(1H, d,J= 7.0 Hz, H-1′′), 5.07 (1H, dd,J= 16.9, 2.2 Hz, H-3′b), 5.02 (1H, dd,J= 2.2, 1.0 Hz, H-3′a), 3.83(3H, s, 4-OMe), 3.25 (2H, d,J= 6.7 Hz, H-1′)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ: 152.1 (C-5), 151.6(C-3), 138.7 (C-2′), 137.6 (C-4), 136.7 (C-1), 115.9(C-3′), 111.6 (C-6), 109.2 (C-2), 102.6 (C-1′′), 78.1(C-3′′), 78.0 (C-5′′), 74.9 (C-2′′), 71.3 (C-4′′), 62.5(C-6′′), 61.6 (4-OMe), 40.0 (C-1′)。以上數據與文獻報 道 一 致[37]， 故 鑒 定 化 合 物 18 為 3,5-dihydroxyestragole 3-O-β-D-glucopyranoside。

化合物19：白色結晶性粉末，分子式為C7H6O3，HR-ESI-MSm/z: 139.038 2 [M ＋H]+（計算值139.039 0）。1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ: 8.02(1H, dd,J= 7.8, 1.8 Hz, H-6), 7.77 (1H, dd,J= 8.3,1.8 Hz, H-4), 7.34 (1H, t,J= 7.8 Hz, H-5), 6.81 (1H,d,J= 8.3 Hz, H-3)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ:174.3 (C=O), 163.1 (C-2), 136.1 (C-4), 131.6 (C-6),119.9 (C-5), 117.9 (C-3), 110.9 (C-1)。以上數據與文獻報道一致[38]，故鑒定化合物19 為水楊酸。

化合物 20：白色無定形粉末，分子式為C13H18O6，HR-ESI-MSm/z: 293.099 3 [M＋Na]+（計算值293.099 6）。1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ:7.31 (5H, m, H-2～6), 4.91 (1H, d,J= 11.8 Hz,H-7b), 4.63 (1H, d,J= 11.8 Hz, H-7a), 4.32 (1H, d,J= 7.7 Hz, H-1′α), 3.86 (1H, dd,J= 11.9, 2.1 Hz,H-6′b), 3.66 (1H, dd,J= 11.9, 5.7 Hz, H-6′a)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ: 139.0 (C-1), 129.3(C-3, 5), 129.2 (C-2, 6), 128.7 (C-4), 103.2 (C-1′),78.1 (C-3′), 78.0 (C-5′), 75.1 (C-2′), 71.7 (C-7), 71.7(C-4′), 62.8 (C-6′)。以上數據與文獻報道一致[39]，故鑒定化合物20 為benzyl β-D-glucopyranoside。

5.2 化合物對酪氨酸酶抑制活性的影響

采用酪氨酸酶催化L-酪氨酸的方法，對小茴香醋酸乙酯部位分離出的20 個化合物進行體外酪氨酸酶抑制活性篩選，共篩選出5 個活性較好的具有酪氨酸酶抑制作用的化合物（4、13～15、17），其中以化合物15 和17 對酪氨酸酶的抑制作用最為明顯，在實驗濃度范圍內，化合物17 對酪氨酸酶的抑制率已達到88.27%。各化合物IC50結果見表1。5 個化合物IC50均小于陽性藥β-熊果苷，其中化合物15 和17 的IC50值最小，表明這2 個化合物對酪氨酸酶抑制作用最強，抑制效果最好，化合物13和14 對酪氨酸酶的抑制率相當，化合物4 在其中抑制效果較弱。

表1 各化合物的酪氨酸酶抑制活性 (, n = 3)Table 1 Tyrosinase inhibitory activity of compounds (,n = 3)

表1 各化合物的酪氨酸酶抑制活性 (, n = 3)Table 1 Tyrosinase inhibitory activity of compounds (,n = 3)

與β-熊果苷相比：*P＜0.05*P < 0.05 vs β-arbutin

化合物 IC50/(mg·mL?1)4 0.783±0.024 13 0.532±0.091 14 0.575±0.022*15 0.113±0.032*17 0.092±0.011*β-熊果苷 1.784±0.240

5.3 分子對接結果

通過對酪氨酸酶抑制活性最好的2 個化合物（15、17）進行分子對接并對其打分。

化合物15 對接結果如圖1 所示，化合物15 分別通過與酪氨酸酶蛋白中的半胱氨酸（Cys）、甘氨酸（Gly）殘基形成氫鍵，其鍵長分別為1.9、2.0、2.3、2.8、3.2，分子對接結合能為?3.5 kJ/mol，表明其具有良好的自由能結合能力。

圖1 化合物15 分子對接結果Fig. 1 Molecular docking results of compound 15

化合物17 對接結果如圖2 所示，化合物17 分別通過與酪氨酸酶蛋白中的Cys 殘基形成氫鍵，其鍵長分別為2.0、2.0、2.4、2.8，分子對接結合能為?5.74 kJ/mol，表明其具有良好的自由能結合能力。

圖2 化合物17 分子對接結果Fig. 2 Molecular docking results of compound 17

6 討論

酪氨酸酶是一種氧化還原酶，廣泛存在于植物和動物體中，是生物體合成黑色素的關鍵酶。黑色素的生物合成是由酪氨酸酶催化體內L-酪氨酸（L-Tyr）生成多巴，多巴經過進一步氧化生成多巴醌，多巴醌再經過一系列的化學反應，最后生成黑色素的過程，研究表明[40]，酪氨酸酶的活性與黑色素合成量相關，控制其活力即可控制黑色素生成量。

本研究報道了20 個從小茴香醋酸乙酯部位分離出來的化合物，并對其進行抑制酪氨酸酶活性實驗，實驗結果顯示化合物4、13～15、17 具有良好的酪氨酸酶抑制活性，抑制效果均高于陽性藥β-熊果苷，其中化合物15 和17 效果最好，其IC50分別為0.113、0.092 mg/mL，基于此對化合物15 和17進行分子對接，分子對接結果顯示化合物15 具有更好的與酪氨酸酶蛋白結合的能力，該結果與活性實驗結果一致。化合物15 抑制效果優于化合物14，可能由于化合物15 的末端雙鍵具有更好的代替多巴被氧化成黑色素這一過程，因此化合物15 的效果優于化合物14。本研究結果將為小茴香化學成分美白效果的進一步開發和利用提供科學依據和參考價值。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突