超聲輔助美拉德反應對鰱魚酶解產物風味特性的影響

王玉婷,肖乃勇,施文正,2

(1 上海海洋大學食品學院,上海 201306;2 國家淡水水產品加工技術研發分中心,上海 201306)

鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)是中國養殖產量較高的低值淡水魚類,其蛋白質豐富、氨基酸種類齊全,具有較高的營養價值[1]。2021年鰱魚總產量為383.66萬t,約占中國淡水養殖魚類總產量的15%[2]。然而,由于刺多、腥味重并且魚體內部組織酶活躍,大量滯銷的鰱魚易發生腐敗變質,造成了資源的浪費和環境污染。目前,鰱魚主要以鮮銷和初級加工產品為主(如腌制[3]、魚排[4]和冷凍產品[5]等),但原料魚肉風味、質構不佳,且在加工、運輸過程中操作不當極易造成蛋白質的損耗或營養物質的流失,利用率低于60%[6],因此開發淡水魚類深加工新技術以提高其附加值和營養價值已成為近年來的研究熱點。對于鰱魚的深加工,一般通過溫和的酶解技術將鰱魚蛋白轉化為分子量較小的水解物或多肽,利用率高達90%[7],它優于傳統的堿法或酸法,無有機溶劑的加入[8]。酶解法是一種從食用材料中提取風味物質的重要技術,但酶解產物一般不具有顯著的風味特征。此外,有研究發現通過深度酶解得到的鰱魚酶解產物大多會產生不好的味道(如魚腥味和苦味)[9]。因此,需要探索一種有效、安全的方法來改善水解物的風味特征。

美拉德反應是還原糖和蛋白質、肽或氨基酸之間一系列復雜的非酶褐變反應[10],在初級階段會形成各種各樣的風味物質(如糠醛、乙醛和丙酮醛),而類黑精等褐色含氮物質來自美拉德反應終產物,決定了食品的色澤和風味[11]。這些美拉德反應產物是提高多肽或水解物風味特性的有效增強劑,在食品領域引起了廣泛關注[12]。超聲波是一種綠色、安全、高效的加工技術,其強烈的機械作用和空穴效應使蛋白質空間結構及構象發生改變[13],并且在較好地保留食品自身特性的基礎上,可以提高反應產率。Yu等[14]在葡萄糖-甘氨酸模型體系中進行超聲輔助美拉德反應技術的研究,可以生成更多的香味化合物,氣味閾值更低,濃度更高。此外,有相關報道表明,超聲處理也有助于酶解物中更多類型揮發性化合物的生成。Ong等[15]研究發現具有更長/更多側鏈的吡嗪在超聲-美拉德反應模型系統中生成量大于熱反應。Dong等[16]研究得出經過超聲預處理后貽貝肉水解蛋白的美拉德反應產物具有豐富的肉類和海鮮風味,但苦味較熱處理后的樣品低。目前,關于以鰱魚酶解產物為基料的風味改良技術的研究較少。因此,尋找改善鰱魚酶解產物風味的潛在加工方法是十分必要的。

本研究以鰱魚為原料,采用超聲輔助美拉德反應技術處理鰱魚酶解產物制得超聲-美拉德反應產物,以未經超聲處理的美拉德反應產物和鰱魚酶解產物作為對照,對其進行中間產物、褐變程度、熒光強度、游離氨基酸含量、電子舌以及揮發性成分等指標的測定,探索超聲輔助美拉德反應對鰱魚酶解產物風味的影響,以期為鰱魚資源的高值化利用和淡水魚調味基料的開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白鰱,購于上海市浦東新區南匯新城鎮黃衛興水產店;堿性蛋白酶(200 000 U/g)、木瓜蛋白酶(100 000 U/g)、木糖、三氯乙酸(分析純),購于北京索萊寶科技有限公司;2,4,6-三甲基吡啶,購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

H-2050R型高速冷凍離心機,長沙湘儀有限公司;SB-400DTY超聲波多頻清洗機,寧波新芝生物科技股份有限公司;HH-6型數顯恒溫攪拌水浴鍋,常州鴻澤實驗科技有限公司;FE28型pH計,梅特勒-托利多儀器上海有限公司;DHG-9003鼓風干燥箱,上海向北實業有限公司;UV-1800PC紫外可見分光光度計,上海美譜達儀器有限公司;LA-8080超高速氨基酸自動分析儀,日立高新技術有限公司;5975b熱脫附氣相色譜質譜聯用儀,美國Agilent公司;TS-5000Z電子舌,北京盈盛恒泰科技有限責任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理

白鰱魚經過宰殺、清洗、去頭、去內臟、去皮等工序,取可食用部位魚肉用絞肉機絞碎,用密封袋分裝后置于-18 ℃冰箱冷凍,待用。

1.3.2 樣品的制備

參照王紫薇[17]和劉偉[18]的方法進行超聲-美拉德反應產物的制備并略做修改。酶解產物取冷凍碎魚肉4 ℃下自然解凍,與蒸餾水(1∶3,w/v)混合均質后轉移至100 mL錐形瓶中,按照酶添加量5 000 U/g加入木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶(復配比1∶3),密封后水浴55 ℃酶解4 h,待水解反應結束后,迅速置于95℃水浴中滅酶15 min,4℃條件下以5 000 r/min(離心半徑r=10 cm)離心20 min,取上清液制得鰱魚酶解產物。美拉德反應產物:將酶解產物與3%添加量的木糖混合,調pH至6,置于90℃烘箱中反應90 min,制得美拉德反應產物。超聲-美拉德反應產物:將酶解產物與3%添加量的木糖混合,在320 W超聲功率下處理30 min,其他操作同上,制得超聲-美拉德反應產物。

1.3.3 美拉德反應中間產物的測定

參照于珍等[19]的方法并略做修改。各樣品溶液用蒸餾水稀釋50倍,用紫外分光光度計在294 nm處測定吸光度,表示中間產物量的變化。

1.3.4 美拉德反應褐變程度的測定

參照于珍等[19]的方法并略做修改。各樣品溶液用蒸餾水稀釋2倍,以420 nm處測定的吸光度表示美拉德反應晚期階段的褐變程度。

1.3.5 內源性熒光強度的測定

在激發波長為260 nm時測量樣品的熒光光譜,掃描波長范圍為200～460 nm,狹縫為5.0 nm。

1.3.6 游離氨基酸的測定

根據陳實等[20]的方法并略做修改。將5 mL樣液裝與5 mL 15%的三氯乙酸溶液混合,漩渦混勻后冰浴靜置2 h,在4 ℃、10 000 r/min(離心半徑r=10 cm)下離心15 min后,過濾。取5 mL上清液,將pH用3 mol/L NaOH調至2,并定容到10 mL,經0.22 μm的膜過濾后,轉移至進樣瓶中上機待測。

1.3.7 揮發性風味成分的測定

參考唐翠翠等[21]的方法并略做修改。將5 mL樣液裝于15 mL頂空瓶中,再加入20 μL 2,4,6-三甲基吡啶(100 mg/L,溶劑甲醇)作為內標。將老化后的3個規格為2.9 mm×5 mm,孔徑1 mm的Mono Trap RCC18(GL sciences 公司,日本)固定在頂空瓶上方,60℃水浴條件下萃取40 min,將吸附子裝入襯管中進行GC-MS分析。

GC條件:DB-5MS 彈性毛細管柱(60 m×0.32 mm,1 μm);載氣為He,流速1.0 mL/min;升溫程序:起始柱溫40 ℃,保持2 min;以4 ℃/min的速率升至160 ℃,不保持;最后以10 ℃/min的速率升至250 ℃,保持5 min。采用不分流模式,汽化室溫度240 ℃。

MS條件:電子電離源;電子能量 70 eV,離子源溫度 200 ℃;傳輸線溫度280℃;質量掃描范圍35～450 m/z。熱脫附器條件:不分流模式,起始溫度60 ℃,以 180 ℃/min 的速率升至240 ℃,保持6 min。冷卻型進樣口條件:液氮制冷,起始溫度-40 ℃,平衡30 s,以 12 ℃/s的速率升至270 ℃,保持15 min。通過NIST 2005和Wiley質譜數據庫檢索對揮發性物質進行質譜分析,得到正反匹配度均大于800的物質。并計算其保留指數(RI)。

1.3.8 氣味活性值(OAV)

未知揮發性化合物質量濃度以及每種化合物的氣味活度值(odor activity value,OAV)的計算公式如下,當OAV≥1時,表明該化合物對樣品的整體風味有貢獻[22]。(1)

(1)

式中:C為揮發性風味物質質量濃度,μg/kg;T為氣味閾值,μg/kg。

1.3.9 電子舌的測定

使用味覺分析系統進行電子舌測試。50 mL樣品置于食品杯中,測定其酸味、苦味、澀味、咸味、鮮味、豐富性(新鮮的回味)、回味B(收斂的回味)和回味A(新鮮的回味)。每個樣品測定4次。

1.3.10 數據處理

每個試驗均重復3次,采用Excel 2010軟件對數據進行處理,Origin 2021軟件作圖,采用SPSS 23.0進行試驗結果的顯著性分析及鄧肯多重比較(P<0.05),結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 中間產物及褐變程度的變化

美拉德反應在中期階段會形成無色化合物(酮、醛和醇類等),并在294 nm處具有較強吸收峰,通常在顏色形成之前而產生,其微小增量即可使吸光度劇烈增加,因此在294 nm處可間接反映中間產物的生成情況;而在晚期階段會發生褐變反應形成棕色的類黑素等物質,并可在420 nm處測出[23]。從圖1中可以看到不同處理組之間存在顯著差異(P<0.05)。與酶解產物相比,美拉德反應產物在294 nm和420 nm處的吸光度明顯更高,吸光度的增加表明中間產物和褐變化合物的形成[24]。由于氨基的消耗及有機酸的產生,體系的酸性狀態也會引起褐變程度的略微增加。這與Chen等[25]的研究結果相似。此外,超聲-美拉德反應處理組要高于未超聲組。這可能是由于超聲預處理產生的湍流和機械剪切力能加快溶液的高速混合,未反應的多肽鏈完全展開,大量氨基基團暴露出來,增大了底物與木糖的接觸空間,提高了美拉德反應速率[26]。

注:不同小寫字母表示各樣品中中間產物的吸光度差異顯著(P<0.05);不同大寫字母表示各樣品中褐變程度的吸光度差異顯著(P<0.05)圖1 不同處理方式下各樣品中間產物及褐變程度的變化Fig.1 Changes in intermediates and browning degree of samples with different treatments

2.2 內源性熒光強度的變化

據報道,熒光化合物的生成與熱誘導的美拉德反應有關[27]。圖2展示了不同處理組樣品內源性熒光光譜的變化。酶解產物在348 nm處顯示出最大熒光強度,而美拉德反應產物的熒光強度有所下降。這一結果表明,鰱魚蛋白質結構被破壞,蛋白酶裂解氨基酸之間的鍵,釋放氨基酸殘基。隨著具有熒光吸收基團的氨基酸殘基含量的增加,熒光強度也隨之增加[28]。在有木糖參與的情況下,酶解產物的熒光強度下降,超聲-美拉德反應產物的熒光強度低于未超聲組。

圖2 不同處理方式下各樣品內源性熒光光譜的變化Fig.2 Changes in intrinsic fluorescence of different treated samples

這是由于木糖中的羧基與酶解產物中的氨基充分反應,從而通過超聲處理加速了氨基和羧基的分子間運動。Liu等[29]在探究糖基化改性蛋白質構象的變化中,發現美拉德反應產物熒光強度的下降與氨基酸殘基空間位點受阻有關,結果與本研究一致。

2.3 游離氨基酸分析

游離氨基酸不僅是重要的風味物質,而且是參與美拉德反應的風味前體化合物。游離氨基酸按呈味特性可分為鮮味(Asp、Glu)、甜味(Thr、Ser、Gly、Ala和Pro)和苦味氨基酸(Val、Met、Ile、Leu、Tyr、Phe、Lys、His和Arg)[30]。不同處理方式樣品的游離氨基酸含量如表1所示。本研究共檢測了17種游離氨基酸,游離氨基酸含量在不同處理組樣品間均存在顯著差異(P<0.05)。與酶解產物相比,美拉德反應產物和超聲-美拉德反應產物的總游離氨基酸分別降低了14.41%和23.18%。其中苯丙氨酸、精氨酸和蘇氨酸的降低程度較大,說明這些氨基酸主要參與了美拉德反應過程中的斯特勒克(Strecker)降解反應。

表1 不同處理樣品中游離氨基酸的含量 Tab.1 Content of free amino acids in different treated samples

不同處理樣品呈味游離氨基酸含量的變化如圖3所示。

圖3 不同處理樣品呈味游離氨基酸含量的變化Fig.3 Changes of free amino acid content in taste presentation of different treated samples

由圖3可知,酶解產物經美拉德反應后的苦味氨基酸降低了9%,而超聲-美拉德反應處理組降低了18%,表明美拉德反應能有效減少酶解產物中的苦味氨基酸生成,而超聲預處理使產物粒徑變小,美拉德反應速率加快,并使產物的苦味最小化。鮮味氨基酸中谷氨酸含量顯著降低(P<0.05),表明谷氨酸參與美拉德反應的活性較高。美拉德反應產物中鮮、甜味氨基酸的含量有所下降,這些游離氨基酸與木糖發生縮合反應,并在一定程度上影響了酶解產物的口感。

2.4 MMSE-GC-MS分析

采用MMSE-GC-MS技術對揮發性風味成分進行提取,測定其揮發性化合物的含量如表2所示。共鑒定出49種揮發性化合物,酶解產物、美拉德反應產物和超聲-美拉德反應產物中分別檢測到44、47和46種揮發性化合物。其中包括18種醛類、7種醇類、3種酯類、5種酮類、10種烴類、3種雜環類和3種其他類化合物。各樣品組產生的揮發性化合物主要為醛類和烴類化合物。酶解產物經超聲處理后使粒徑變小,易與木糖交聯,形成醛類、烯烴、酮類等揮發性化合物,因此超聲-美拉德反應產物中醛類含量最高。醛類因其較低的閾值而成為食品加工過程中最有價值的揮發性化合物[31]。醛類化合物是由氨基酸和多肽在加熱過程中與木糖反應形成,多肽本身的脫水和縮合也會使其含量增多。由表2可知,己醛和苯甲醛在酶解產物中含量較高。苯甲醛是一種具有櫻桃香的芳香醛,廣泛應用于食品工業中[32]。己醛是由亞油酸氧化生成,具有淡淡的草香和脂肪味[33]。

表2 不同處理樣品中揮發性風味物質的含量 Tab.2 Content of volatile flavor components in different treated samples

此外,美拉德反應前后有新的醛類物質生成。比如2-甲基丁醛,作為常用香料已廣泛應用于食品工業中,具有可可香氣、水果香等風味[34];糠醛是戊糖的相應分解產物,其生成量與美拉德反應程度有關[35];(E,E)-2,4-庚二烯醛呈魚腥味,具有較低的閾值[36],并且在超聲-美拉德反應產物中未檢出,表明超聲輔助美拉德反應可以有效改善酶解液的風味。飽和醇和烴類化合物通常閾值較高,對整體風味貢獻不大但參與雜環物質生成[37]。

2-乙基呋喃等雜環化合物賦予酶解液燒烤、烤肉香或焦香味,經超聲輔助美拉德反應后含量顯著增加(P<0.05)。揮發性風味物質中還檢測到呈酯香味的辛酸乙酯和呈花果香的乙酸乙酯。酮類和其他類揮發性物質對酶解液風味均有一定影響。此外,揮發性化合物的增加與氨基酸的減少相對應。

通過氣味活性值(OAV)鑒定出13種對樣品整體香氣貢獻較大的揮發性成分,如表3所示。OAV值常被用于評價氣味在食品香氣中的重要性。與GC-MS分析不同,OAV考慮了食物基質效應,因為所涉及的氣味閾值取決于單個食物基質。食品香氣中的顯著氣味被認為是OAV≥1的有效氣味,通常被稱為關鍵氣味[38-39]。在超聲處理和美拉德反應作用下,水解物中OAV≥1的揮發性化合物明顯增多,且香味特征更為明顯。與GC-MS分析結果相符合,低閾值的醛類OAV最大,對整體香味的也貢獻最大。

2.5 電子舌分析

鮮味、苦味和豐富度整體的味覺響應值較高,酸味響應值最低,后味B(苦的回味)對不同處理樣品的響應值基本一致。酶解產物經美拉德反應后酸味值增加,但苦澀味、鮮咸味和豐富度降低,這可能與呈苦味的游離精氨酸和苯丙氨酸、呈鮮味的谷氨酸降低有關。而超聲-美拉德反應處理組的酸味、苦澀味和咸味的響應值低于未超聲組。當蛋白質被蛋白酶水解產生肽和氨基酸時,未反應的短肽對咸味、苦味有貢獻,經過超聲預處理后未反應的短肽減少,這是使咸味和苦味響應值降低的主要原因。此外,超聲輔助美拉德反應促進了其他呈味氨基酸的生成,酶解液中的苦味被掩蓋。以上結果表明,超聲輔助美拉德反應能夠改善酶解液的風味。

電子舌雷達圖如圖4所示。

圖4 不同處理樣品的電子舌雷達圖Fig.4 Electron tongue radar map of different treated samples

各樣品電子舌的主成分分析如圖5所示。PC1、PC2的貢獻率分別為68.3%、24.4%,累積貢獻率為92.7%(>85%),表明PC1和PC2能夠很好地反映樣本的總體特征信息。從圖5中可以看出,各樣品的滋味輪廓并無重疊部分,表明電子舌可以將不同樣品很好的區分開,各樣品之間的距離代表樣品種間的整體滋味差異。酶解產物與美拉德反應產物處理組之間距離較遠,滋味輪廓存在顯著差異,而美拉德反應產物和超聲-美拉德產物處理組之間距離較近滋味輪廓相似。

圖5 不同處理樣品的電子舌主成分分析(PCA)Fig.5 Principal component analysis (PCA) of electronic tongues of different treated samples

3 結論

通過超聲-輔助美拉德反應技術對鰱魚酶解產物進行處理,對比未超聲處理組及酶解處理組發現:經美拉德反應后,中間產物和褐變程度增加,超聲-美拉德反應產物高于未超聲組,說明超聲處理促進了美拉德反應速率。美拉德反應產物的熒光強度下降,超聲處理組低于未超聲組,表明超聲處理加速了氨基和羧基的分子間運動,使具有熒光吸收基團的氨基酸殘基含量下降。游離氨基酸和MMSE-GC-MS結果顯示美拉德反應能夠降低苦味氨基酸的生成,苯甲醛、糠醛和2-乙基呋喃等賦予酶解液良好氣味的揮發性化合物含量增加。電子舌結果進一步證實了超聲輔助美拉德反應能夠有效改善酶解產物的風味,為淡水魚風味基料的應用提供了理論依據。