生物絮團濃度和枯草芽孢桿菌添加量對生物絮團主要性能的影響

徐思行,賀 希,陳 菲,俞奇力,羅國芝 ,,3

(1 上海水產養殖工程技術研究中心,上海 201306;2 杭州蕭山東海養殖有限責任公司,浙江 杭州 311200;3 上海市水產動物良種創制與綠色養殖協同創新中心,上海海洋大學,上海 201306)

生物絮團技術(Biofloc Technology,BFT)通過添加有機碳源維持水體碳氮比(C/N)在15以上,促使異養細菌同化氨氮優勢生長,和水體中顆粒物結合形成以微生物為主的生物絮團[1]。生物絮團既能去除水體氨氮、硝酸鹽氮等無機氮,對養殖動物也具有一定的營養價值。BFT可以較低成本實現封閉、高密度水產養殖[2],近年來受到國內外水產養殖者的普遍關注。

碳源種類、碳源添加方式、碳源濃度、C/N、鹽度、絮團粒徑大小等操作因素對生物絮團性能有明顯影響[3-4],其中生物絮團濃度是生物絮團養殖過程中重點控制參數[5]。絮團量太低氨氮處理能力低,生物絮團量太高,會增加系統中的氧氣消耗,且可能會對養殖動物產生脅迫[6]。有研究者認為生物絮團量宜控制在500～600 mg/L[7]。枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis,B.subtilis)是水產養殖常用益生菌[8]。已有研究表明,向絮團水體中添加B.subtilis可提高生物絮團粗蛋白和部分氨基酸組成含量,有利于為養殖對象提供更好的營養[8]。

研究了生物絮團濃度(以總懸浮顆粒物濃度表征)與B.subtilis添加量對生物絮團系統中氨氮去除、生物絮團營養組成的影響,為生物絮團技術在水產養殖中的實際應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

生物絮團已提前培養好且性能良好[8]。使用18個250 mL錐形瓶并接種100 mL絮團。每個錐形瓶中裝2個規格相同的石英砂曝氣石,曝氣石連接一個100 W空氣泵,維持反應器溶氧(DO)大于5 mg/L和生物絮團呈懸浮狀態。試驗期間添加適量碳酸氫鈉(NaHCO3)調整水體堿度在250 mg/L CaCO3左右。

1.2 方法

1.2.1 枯草芽孢桿菌來源與添加量

使用的B.subtilis種子液購自中國微生物菌種網,試驗時在100 mL 2216E培養液中接入2%種子液,在培養箱中發酵培養20 h后,用LB培養基平板計數法分別稀釋10、102、103、104、105、106、107倍,用涂布棒快速均勻地將稀釋后的菌液涂布,每個稀釋倍數兩個重復,繼續培養20 h后用30～300 CFU/mL平板計數。根據菌落數目和種子液的稀釋倍數計算出稀釋后的菌濃度。

1.2.2 試驗設計

B.subtilis添加量分別為104CFU/mL(A)、105CFU/mL(B)和106CFU/mL(C),每種添加量設置300 mg/L和600 mg/L生物絮團濃度,分別用A-300、A-600、B-300、B-600、C-300、C-600表示,每組3個平行。添加10 mg/L氨氮(38.46 mg/L氯化銨)至錐形瓶中,再添加葡萄糖使水體溶解有機碳(dissolved organic carbon,DOC)與總氮比為15。每間隔0.5 h進行主要水質指標連續監測。總氨氮降至0.5 mg/L以下時視為試驗結束。取試驗結束時絮團,測定絮團營養組成和主要氮素代謝功能基因拷貝數。

1.2.3 主要水質指標的測定

1.2.4 氨氮去除效率

TAN去除效率按下式計算:

R= (Ci-Ce)/Ci×100%

(1)

式中:R為TAN的去除效率(%);Ci為初始的TAN質量濃度(mg/L);Ce為終末的TAN質量濃度(mg/L)。

1.2.5 生物絮團性能指標

將取得的生物絮團在65℃條件下烘干至恒重,用碳氮元素分析儀(Elmenter Vario Max,德國)測定碳、氮元素質量。生物絮團粗蛋白含量用測得的氮素乘以6.25估算[9],粗灰分含量用稱重法測定,總脂肪含量用氯仿-甲醇法測定,氨基酸相對含量用氨基酸分析儀測定(氨基酸分析儀L-8800,日立公司)。生物絮團沉降性能用5 min絮團沉降體積(Bioflocs volume index in 5 minutes,FVI-5)表征,具體測試方法為:使用英霍夫式(Imhoff)錐形管從生物絮團反應器中取100 mL混合均勻的水樣(含絮團),靜置5 min后,讀取沉淀絮團的體積,單位為mL/L。

1.2.6 絮團相關功能基因拷貝數

從反應器中取50 mL混合均勻的水樣,0.22 μm無菌微孔濾膜過濾,將截留了絮團的濾膜剪碎放進5 ml無菌離心管,零下80 ℃冰箱中保存,送上海微基生物有限公司采用Real-time PCR對ureC、AOB、nxrA、Hao進行基因拷貝數測定,所用引物序列見表1。

表1 ureC、AOB、nxrA、Hao基因引物Tab.1 The Gene Primers of ureC,AOB,nxrA and Hao

1.3 數據處理

試驗數據采用Excel軟件進行結果統計,用Origin 8.5進行相關圖表繪制。試驗數值用平均值±標準差(Mean±SD)形式表示,采用SPSS 19.0統計軟件Tukey方法對試驗數據進行組間多重比較分析,顯著性水平設為0.05。

2 結果

2.1 各處理組的主要水質指標情況

各試驗組溶氧、水溫、pH和堿度等指標差異不顯著(表2)(P>0.05)。

表2 試驗期間各組主要水質指標平均值和范圍Tab.2 Mean values and ranges of primary water quality parameters in experiment groups during the experimental period

表3 不同處理組絮團粗蛋白、粗脂肪、粗灰分含量和C/NTab.3 Crude protein,crude ash,crude fat content and C/N of bioflocs

8 h內各組氨氮去除率均在99%以上(圖1)。

圖2 各組生物絮團的硝化功能基因拷貝數Fig.2 Copies of ureC,amoA,nxrA and Hao in bioflocs of the experiment groups

2.2 生物絮團硝化作用功能基因拷貝數

各組絮團amoA、ureC,Hao拷貝數隨B.subtilis添加量升高而顯著升高。B.subtilis添加量為104CFU/mL的A-300和A-600組nxrA基因拷貝數高于添加量為105CFU/mL和106CFU/mL組(P<0.05)。絮團懸浮物質量濃度為600 mg/L各基因拷貝數高于生物絮團質量濃度為300 mg/L組,但差異不顯著。

標有不同字母表示組間有顯著性差異(P<0.05),標有相同字母表示組間無顯著性差異(P>0.05)

2.3 生物絮團營養組成

B.subtilis添加量為105CFU/mL的試驗組絮團粗脂肪含量高于其他兩組。B.subtilis添加量為106CFU/mL試驗組粗蛋白含量高于其他兩組(P<0.05)。B.subtilis添加量對絮團粗脂肪、粗蛋白、C/N影響顯著(P<0.05),絮團濃度對生物絮團粗脂肪、粗灰分、粗蛋白、C/N影響不顯著(P>0.05)。

絮團濃度對Ser、Glu、Gly、Met、His、Pro含量影響不顯著 (P>0.05),對其余氨基酸含量影響顯著(P<0.05)。B.subtilis添加量對Ser、Glu、Gly、Ala、Tyr、Lys含量影響不顯著,對其余氨基酸影響顯著(P<0.05)。B.subtilis添加量為106CFU/mL組(C-300,C-600)的絮團氨基酸含量高于B.subtilis添加量為104CFU/mL組(A-300,A-600)(表4)。

表4 各組生物絮團17種氨基酸相對含量(%干重)Tab.4 The contents of 17 amino acids in the bioflocs of the experimental groups (Dry weight %)

除Ser、Gly、Lys、His以外,B.subtilis添加量為105CFU/mL組(B-300,B-600)的絮團氨基酸含量均高于B.subtilis添加量為104CFU/mL組(A-300,A-600)。

3 討論

3.1 絮團濃度和枯草芽孢桿菌添加量對絮團氨氮去除速率的影響

生物絮團系統中滯留了絕大部分未被養殖對象利用的氮、磷等營養物質,再加上絮團的絮狀結構[4],可為多種微生物的生長提供適宜環境,進而為無機氮的多種代謝通路提供可能性[11]。生物絮團系統中的氨氮可被異養同化為有機氮,也可能會被自養硝化或異養硝化成硝酸鹽氮[1];產生的硝酸鹽氮可能被反硝化為氮氣、同化為有機氮或異化還原成氨氮[12];水體中的亞硝酸鹽氮可能來源于不完全硝化、不完全反硝化、硝酸鹽異化還原(DNRA)等過程[4]。因此,生物絮團可能同時具有高效的氨氮同化、自養硝化、反硝化等功能。在按照C/N=15補充有機碳源的條件下,各組添加的10 mg/L氨氮均在3～ 9 h降至0.5 mg/L以下(圖1a),說明本試驗使用的生物絮團氨氮處理能力良好[13-15]。試驗過程匯總亞硝酸鹽氮濃度的增加可能是因為發生了不完全的硝化過程、不完全的反硝化過程或/和不完全的DNRA過程[4,16]。A-300組硝酸鹽氮濃度增加,但總氮濃度降低(圖1c、d),這說明A-300組可能有較明顯的硝化過程和反硝化過程。A-600組硝酸鹽氮濃度降低但總氮濃度增加(圖1c、d),這說明可能發生了明顯的同化過程。

芽孢桿菌具有良好的水質凈化能力,能夠有效修復受污染水體,在水產養殖過程中,常用芽孢桿菌去除水體中氨氮[17]。Oliveira等[18]在活性污泥中加入芽孢桿菌能夠優化活性污泥的菌群結構,提高了水處理性能。劉屬彬等[19]研究了B.subtilis在養殖廢水和模擬廢水去除氨氮的效果,表明B.subtilis是凈化水質的良好微生物。本研究中B.subtilis添加量對生物絮團去除氨氮的效率有顯著影響,添加量為106CFU/mL的組的TAN去除速率顯著高于B.subtilis添加量為104CFU/mL和105CFU/mL (P<0.05)。這說明本研究構建的生物絮團反應環境能夠滿足B.subtilis生長需求。后續應開展關于更高B.subtilis添加量對生物絮團TAN去除效率影響的研究。生物絮團附著的微生物能夠有效去除水體中的氨氮、硝酸氮等,絮團濃度越高,附著的微生物數量越多,氨氮處理能力越強。本研究中絮團質量濃度為600 mg/L處理組的氨氮處理效率明顯高于絮團質量濃度為300 mg/L的處理組,這和Chen等[20]和Luo 等[21]的研究結果相同。

3.2 絮團濃度和枯草芽孢桿菌添加量對氮素代謝相關功能基因的影響

3.3 絮團濃度和草芽孢桿菌添加量對絮團營養組成的影響

生物絮團優勢菌群的組成情況會影響絮團營養組成,這可能是因為不同細菌分泌的胞外聚合物性質不同,導致絮團營養成分組成的差異[26-28]。本研究中B.subtilis添加量為106CFU/mL時,生物絮團中各氨基酸濃度高于B.subtilis添加量分別為104CFU/mL和105CFU/mL的試驗組。其可能原因是B.subtilis添加量為106CFU/mL時,B.subtilis添加劑在絮團中富集生長,形成優勢菌,影響了絮團營養成分。生物絮團水體中異養細菌含量的提高,水體中氨氮、硝酸鹽氮等營養物質能夠更加高效地被生物絮團利用[29-30],與本研究結果一致。研究方案設計時考慮到實際操作成本,本研究沒有設計更高濃度的B.subtilis添加量,這不排除添加量越高、粗蛋白提高效果越明顯的可能性,需要進一步確認。

4 結論

添加枯草芽孢桿菌能夠提高生物絮團中各氨基酸含量和粗蛋白含量以及氨氮去除效率。在按照C/N=15補充有機碳源條件下,生物絮團質量濃度為600 mg/L時添加106CFU/mL枯草芽孢桿菌,可取得較好的生物絮團氨氮去除速率和營養價值。