毛蕊花糖苷調(diào)節(jié)HMGB1/RAGE/NF-κB信號通路對動脈粥樣硬化大鼠內(nèi)皮功能障礙的影響

劉艷文，劉水清，林少偉，劉協(xié)紅

動脈粥樣硬化（AS）是一種血管慢性炎癥性疾病，與低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）升高［1］、血管內(nèi)皮功能障礙［2］、炎癥［3］和氧化應(yīng)激［4］有關(guān)。目前關(guān)于AS發(fā)病機制仍不明確，他汀類等降脂藥物已被證明是預(yù)防和治療AS最有效的藥物，但長期服用對肝臟和肌肉會產(chǎn)生不良反應(yīng)，因此仍需開發(fā)安全有效的新型治療藥物［5］。毛蕊花糖苷（Verbascoside，VB）是多種藥用植物的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗衰老、抗癌及神經(jīng)保護(hù)作用［6］。已有研究發(fā)現(xiàn)，VB可以通過抑制炎性介質(zhì)改善高脂飲食誘導(dǎo)的AS 進(jìn)程［7］。高遷移率族蛋白B1（HMGB1）/晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）信號通路在炎癥性疾病中扮演重要角色，可以介導(dǎo)下游核因子κB（NF-κB）的磷酸化，促進(jìn)炎性介質(zhì)的釋放［8］。研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1 在AS中高表達(dá)，可以通過核易位到細(xì)胞質(zhì)并釋放到胞外，與RAGE 結(jié)合發(fā)揮其生物學(xué)功能，促進(jìn)AS 的炎癥進(jìn)展［9］。本研究建立AS 大鼠模型，探討VB 調(diào)節(jié)HMGB1/RAGE/NF-κB 信號通路對大鼠內(nèi)皮功能障礙、炎癥、氧化應(yīng)激和脂質(zhì)代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級7 周齡SD 大鼠80 只，體質(zhì)量210～230 g，購自廣東南模生物科技有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2022-0062。所有大鼠在中國藥科大學(xué)動物實驗中心（藥學(xué)動物實驗中心）飼養(yǎng)1周，無異常后用于后續(xù)實驗。

1.2 試劑與儀器 VB 購自上海麥克林生化科技有限公司；維生素D3 注射液購自上海通用藥業(yè)股份有限公司；辛伐他汀購自康普藥業(yè)股份有限公司；HE染色試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、C 反應(yīng)蛋白（CRP）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）、內(nèi)皮素1（ET-1）、細(xì)胞間黏附分子1（ICAM-1）、內(nèi)脂素、一氧化氮（NO）的酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；兔源HMGB1、RAGE、NF-κB p65、p-NF-κB p65 一抗，山羊抗兔IgG二抗均購自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司。全自動生化分析儀（型號PUZS-600A/B）購自北京普朗新技術(shù)有限公司；光學(xué)顯微鏡（型號GX53）購自奧林巴斯；酶標(biāo)儀（型號Multiskan SkyHigh）購自ThermoFisher。

1.3 方法

1.3.1 造模及分組 造模方法參照文獻(xiàn)［10］進(jìn)行，即將造模大鼠用高脂飼料喂養(yǎng)8 周，同時在前3 d 腹腔注射維生素D3溶液（6×105U/kg），每日1 次。大鼠出現(xiàn)主動脈內(nèi)膜增厚，血管出現(xiàn)斑塊并伴有脂質(zhì)沉積現(xiàn)象則視為造模成功。造模期間大鼠死亡18只，將造模成功的大鼠按隨機數(shù)字表法分為模型組（12 只），毛蕊花糖苷低、中、高劑量（VB-L、M、H）組［7］（各10只），陽性對照（辛伐他汀）組［11］（10只），將正常飼料喂養(yǎng)的大鼠設(shè)為對照組（10 只）。對照組和模型組予生理鹽水灌胃，VB-L、M、H組分別給予2、5、10 mg/kg的VB灌胃，陽性對照組給予5 mg/kg辛伐他汀灌胃。自造模第1天開始給藥，連續(xù)8周，每日1次。

1.3.2 樣本采集 給藥結(jié)束后麻醉大鼠，腹主動脈采血，離心后收集血清待測。采血完畢后，斷頭處死大鼠，75%乙醇消毒后進(jìn)行解剖，分離主動脈用于HE染色觀察和蛋白檢測。

1.3.3 血脂、炎性因子、細(xì)胞因子及氧化應(yīng)激指標(biāo)水平檢測 取1.3.2保留的血清，全自動生化分析儀檢測血清中TC、TG、LDL-C 和HDL-C 水平。ELISA 法檢測血清中TNF-α、IL-1β、CRP、MMP-9 及內(nèi)皮細(xì)胞因子ET-1、ICAM-1、內(nèi)脂素、NO水平。使用微量法試劑盒檢測血清中SOD、GSH-Px、MDA水平。

1.3.4 大鼠腹主動脈病理變化觀察 取1.3.2保存的主動脈，加入固定液固定后，根據(jù)HE染色試劑盒進(jìn)行染色，在光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。

1.3.5 Western blot 檢測蛋白表達(dá) 取1.3.2 保存的主動脈，加入裂解液提取總蛋白，BCA法對蛋白定量后，取30 μg蛋白上樣，電泳、濕法轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉封閉后加入稀釋的一抗HMGB1、RAGE、NF-κB p65、p-NF-κB p65（1∶1 000），以βactin（1∶1 000）為內(nèi)參，4 ℃過夜后，加入二抗（1∶2 000），室溫孵育2 h 后，化學(xué)發(fā)光法顯影，記錄條帶灰度值。蛋白表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 26.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VB 對大鼠血脂水平的影響 與對照組相比，模型組大鼠血清中TC、TG、LDL-C 水平升高，HDLC 水平降低（P＜0.05）；與模型組相比，VB 各組及辛伐他汀組大鼠血清中TC、TG、LDL-C 水平降低，HDL-C 水平升高（P＜0.05）；VB-H 組與辛伐他汀組上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of serum lipid levels between the six groups表1 各組大鼠血脂水平比較（mmol/L，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，c與VB-L組比較，d與VB-M組比較，P＜0.05；表2—5同。

組別對照組模型組VB-L組VB-M組VB-H組辛伐他汀組F n 10 12 10 10 10 10 TC 1.42±0.18 2.08±0.25a 1.80±0.21b 1.65±0.24b 1.49±0.16bc 1.52±0.18bc TG 0.62±0.12 1.41±0.30a 1.12±0.20b 0.79±0.25bc 0.74±0.22bc 0.70±0.20bc HDL-C 2.25±0.34 0.96±0.36a 1.42±0.28b 1.69±0.45b 1.88±0.32bc 1.92±0.30bc LDL-C 1.75±0.40 6.10±0.72a 5.39±0.60b 4.66±0.45bc 3.85±0.51bcd 3.48±0.45bcd 15.589＊＊20.348＊＊18.493＊＊86.051＊＊

2.2 VB 對大鼠主動脈病理變化的影響 對照組大鼠主動脈血管結(jié)構(gòu)清晰，內(nèi)膜完整，血管未出現(xiàn)斑塊；模型組大鼠主動脈血管內(nèi)層結(jié)構(gòu)被破壞，內(nèi)膜增厚，血管內(nèi)出現(xiàn)纖維增生性斑塊并伴有脂質(zhì)沉積，炎性細(xì)胞浸潤明顯；VB-L組與模型組病理變化程度相當(dāng)，血管內(nèi)膜增厚，出現(xiàn)斑塊和脂質(zhì)沉積，隨著VB劑量增加，上述病理學(xué)變化明顯好轉(zhuǎn)；VB-H組與辛伐他汀組相比血管內(nèi)膜未見增厚，斑塊面積有所減少，見圖1。

2.3 VB 對大鼠血清炎性因子的影響 與對照組相比，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、CRP、MMP-9水平升高（P＜0.05）；與模型組相比，VB各組及辛伐他汀組大鼠血清中上述指標(biāo)水平降低（P＜0.05）；VB-H 組與辛伐他汀組上述指標(biāo)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of serum inflammatory factors between six groups表2 各組大鼠血清炎性因子水平比較（±s）

Tab.2 Comparison of serum inflammatory factors between six groups表2 各組大鼠血清炎性因子水平比較（±s）

組別對照組模型組VB-L組VB-M組VB-H組辛伐他汀組F n 10 12 10 10 10 10 TNF-α/（ng/L）189.15±36.74 323.06±34.15a 276.24±38.20b 258.20±39.21b 223.78±36.22bc 245.21±35.25b 17.078＊＊IL-1β/（ng/L）20.32±4.01 30.98±3.57a 26.01±3.70b 24.61±3.78b 21.75±3.12b 22.53±3.01b 12.941＊＊CRP/（mg/L）1.23±0.15 4.68±0.20a 2.73±0.18b 2.70±0.15b 2.45±0.16bcd 2.30±0.14bcd 513.455＊＊MMP-9/（μg/L）70.22±5.15 105.32±8.23a 79.24±7.01b 82.24±8.01bc 78.42±7.52bc 85.20±9.31b 27.992＊＊

2.4 VB 對大鼠血管內(nèi)皮因子的影響 與對照組相比，模型組大鼠血清ET-1、內(nèi)脂素、ICAM-1 水平升高，NO水平降低（P＜0.05）；與模型組相比，VB各組及辛伐他汀組大鼠血清ET-1、內(nèi)脂素、ICAM-1水平降低，NO 水平升高（P＜0.05）；VB-H 組與辛伐他汀組上述指標(biāo)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表3。

Tab.3 Comparison of vascular endothelial factor levels between the six groups表3 各組大鼠血管內(nèi)皮因子水平比較（±s）

Tab.3 Comparison of vascular endothelial factor levels between the six groups表3 各組大鼠血管內(nèi)皮因子水平比較（±s）

組別對照組模型組VB-L組VB-M組VB-H組辛伐他汀組F n 10 12 10 10 10 10 ET-1/（ng/L）106.30±22.12 158.36±25.52a 130.02±18.04b 125.74±22.47b 112.80±23.52b 115.63±20.13b 7.864＊＊內(nèi)脂素/（μg/L）18.32±3.10 45.15±5.23a 39.21±4.60b 28.15±5.12bc 22.45±2.98bcd 22.04±3.01bcd 71.208＊＊ICAM-1/（ng/L）14.02±2.65 57.21±6.78a 50.10±4.52b 37.21±4.85bc 24.72±4.12bcd 28.32±4.74bcd 119.643＊＊NO/（μmol/L）31.02±3.74 18.81±3.23a 23.90±2.61b 25.17±3.02b 28.49±3.42bc 29.33±3.14bc 21.224＊＊

2.5 VB 對大鼠氧化應(yīng)激水平的影響 與對照組相比，模型組大鼠血清中SOD、GSH-Px 活性降低，MDA含量升高（P＜0.05）；與模型組相比，VB各組及辛伐他汀組大鼠血清中SOD、GSH-Px 活性升高，MDA含量降低（P＜0.05）；VB-H組與辛伐他汀組上述指標(biāo)水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表4。

Tab.4 Comparison of oxidative stress indexes between the six groups表4 各組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)水平比較 （±s）

Tab.4 Comparison of oxidative stress indexes between the six groups表4 各組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)水平比較 （±s）

組別對照組模型組VB-L組VB-M組VB-H組辛伐他汀組F n 10 12 10 10 10 10 SOD/（U/mL）234.42±18.14 145.47±17.25a 169.23±17.38b 184.25±15.02b 215.49±16.20bcd 213.78±14.91bcd 43.803＊＊MDA/（μmol/L）2.73±0.45 4.89±0.57a 4.05±0.42b 3.74±0.47b 2.80±0.41bcd 2.85±0.45bcd 37.908＊＊GSH-Px/（U/mL）601.25±23.41 403.58±34.70a 454.21±29.41b 495.23±23.21bc 549.56±24.52bcd 556.69±27.17bcd 75.571＊＊

2.6 VB 對大鼠主動脈HMGB1/RAGE/NF-κB 信號通路蛋白表達(dá)的影響 結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組大鼠主動脈中HMGB1、RAGE、p-NF-κB p65/NF-κB p65 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與模型組相比，VB各組及辛伐他汀組大鼠主動脈中上述蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；VB-H 組與辛伐他汀組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖2、表5。

Tab.5 Comparison of HMGB1/RAGE/NF-κB signaling pathway protein expression between the six groups表5 各組大鼠HMGB1/RAGE/NF-κB信號通路蛋白表達(dá)水平比較（±s）

組別對照組模型組VB-L組VB-M組VB-H組辛伐他汀組F n 10 12 10 10 10 10 HMGB1/β-actin 0.39±0.12 0.99±0.15a 0.82±0.12b 0.64±0.10bc 0.42±0.12bcd 0.45±0.16bcd 38.143＊＊RAGE/β-actin 0.20±0.05 0.63±0.06a 0.50±0.04b 0.42±0.05bc 0.31±0.04bcd 0.33±0.07bcd 90.077＊＊p-NF-κB p65/NF-κB p65 0.19±0.01 0.72±0.08a 0.64±0.05b 0.49±0.05bc 0.38±0.06bcd 0.33±0.05bcd 137.603＊＊

3 討論

AS是血管系統(tǒng)的彌漫性炎癥性疾病，由心血管疾病危險因素（即高血壓、糖尿病、血脂異常和吸煙）引起內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，導(dǎo)致內(nèi)皮失去抗炎和抗血栓特性，致使炎性細(xì)胞滲入主動脈并吸收過氧化脂質(zhì)，在血管中形成纖維性增生斑塊，斑塊破裂后會導(dǎo)致心肌梗死和中風(fēng)，嚴(yán)重者可死亡［12］。VB 因其抗炎、抗氧化等藥理學(xué)特性而備受關(guān)注，可以改善血管內(nèi)皮功能，降低血管內(nèi)皮通透性，抑制細(xì)胞凋亡［13］。本研究建立的AS 模型大鼠主動脈出現(xiàn)明顯的病理改變，內(nèi)皮增厚，出現(xiàn)斑塊并伴有脂質(zhì)沉積，說明造模成功。利用VB進(jìn)行干預(yù)后，大鼠的病理改變隨著劑量增大而逐漸好轉(zhuǎn)。

脂質(zhì)代謝紊亂在AS 的發(fā)病機制中起根本性作用，其中膽固醇合成、轉(zhuǎn)運以及TG、脂蛋白和脂肪酸的代謝均與AS 有關(guān)。AS 患者血漿TC 和TG 水平升高，TC 與LDL 結(jié)合形成的LDL-C 在動脈管壁沉積，LDL氧化生成的ox-LDL也會促進(jìn)泡沫細(xì)胞生成，釋放大量炎性因子（如TNF-α、IL-1β 等）加重AS 的發(fā)展，而HDL-C 則抑制其發(fā)生發(fā)展［14］。促炎因子TNF-α、IL-1β、CRP 和MMP-9 可作為AS 的炎癥標(biāo)志物。TNF-α 能刺激中性粒細(xì)胞釋放溶酶體素，導(dǎo)致局部血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，誘導(dǎo)其他炎性因子分泌；CRP 會抑制受損細(xì)胞修復(fù)，誘導(dǎo)血栓形成［15］；MMP-9 參與血管壁的細(xì)胞外基質(zhì)的降解，可以將胞內(nèi)炎性介質(zhì)釋放至細(xì)胞外，加重炎癥反應(yīng)，促進(jìn)AS 進(jìn)展［16］。本研究中，模型組大鼠血清TC、TG和LDL-C水平升高、HDL-C水平降低，血管壁脂質(zhì)沉積加重，炎性因子水平也明顯升高，血管內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷，引起內(nèi)皮功能障礙。經(jīng)VB 處理后，VB 各組TC、TG和LDL-C 及炎性因子水平均降低、HDL-C 水平升高，脂質(zhì)代謝紊亂改善，動脈血管炎癥反應(yīng)減輕。在AS 發(fā)展過程中，ET-1、內(nèi)脂素、ICAM-1 水平升高，NO 表達(dá)降低，而NO 減少會引起氧化應(yīng)激和血管內(nèi)皮功能障礙，NO 主要抑制促炎因子表達(dá)和LDL-C氧化，在抑制AS病情發(fā)展中尤為重要［17-18］。本研究中，經(jīng)過VB 處理后，VB 各組NO 水平升高，抑制了ET-1、內(nèi)脂素和ICAM-1表達(dá)，改善了氧化應(yīng)激狀態(tài)和內(nèi)皮功能障礙。

HMGB1 是機體損傷后由活化巨噬細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)，可以激活炎性小體產(chǎn)生和炎性細(xì)胞因子釋放，如IL-1β、TNF-α 和MMPs，從而促進(jìn)炎癥進(jìn)展［19］。內(nèi)皮通透性增加是內(nèi)皮功能障礙的早期表現(xiàn)之一，與AS 等心血管疾病的發(fā)展有關(guān)。有研究表明，RAGE可以調(diào)節(jié)炎癥中的血管內(nèi)皮通透性，阻斷RAGE 信號傳導(dǎo)可以減弱內(nèi)皮屏障通透性［20］。HMGB1 可以激活Toll 樣受體4 和RAGE 信號，導(dǎo)致下游NF-κB 的激活，HMGB1/RAGE/NF-κB 激活后，可以刺激其他信號通路，如應(yīng)激活化蛋白激酶/c-Jun 氨基末端激酶、p38 絲裂素活化蛋白激酶、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2，從而導(dǎo)致NF-κB 磷酸化表達(dá)，促進(jìn)AS發(fā)生相關(guān)的細(xì)胞因子、黏附分子和MMPs 的過表達(dá)［21］。本研究中經(jīng)VB 處理后，VB 各組的HMGB1/RAGE/NF-κB信號通路蛋白的表達(dá)下調(diào)，從而抑制炎性因子的表達(dá)。

綜上所述，VB 可以抑制HMGB1/RAGE/NF-κB信號通路表達(dá)，抑制炎癥和氧化應(yīng)激，改善AS 大鼠的脂質(zhì)代謝紊亂和內(nèi)皮功能障礙。接下來將進(jìn)行體外細(xì)胞實驗，以進(jìn)一步明確VB 調(diào)節(jié)該信號通路對AS細(xì)胞內(nèi)皮損傷的作用機制。