木犀草素對白血病K562/ADR細胞多藥耐藥的逆轉作用及機制研究

周欣宇，李京敏，張婷，賈秀紅△

慢性髓系白血病（chronic myelogenous leukemia，CML）是一種血液系統惡性腫瘤，其特征是染色體易位t（9；22）（q34；q11）導致BCR-ABL 融合基因的形成。BCR-ABL 融合基因編碼的蛋白具有極高的酪氨酸激酶活性，可激活Ras，使磷酸肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin，mTOR）等信號通路異常活化，導致造血干細胞增殖失控［1-2］。酪氨酸激酶抑制劑是目前治療CML的一線藥物，治療效果良好。然而，仍有10%～20%的患者在治療過程中出現耐藥性，使病程進展至晚期或原始細胞危象［3］。因此，探究白血病的相關耐藥機制，尋找高效、低毒的白血病治療藥物成為亟待解決的問題。中藥提取物對逆轉腫瘤的多藥耐藥具有靶點多、毒性低等特點，可以通過不同的機制逆轉腫瘤細胞的耐藥性。木犀草素（Lut）是植物中廣泛存在的一類黃酮類化合物，可通過誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞免疫耐受、促進腫瘤細胞DNA 損傷等方式發揮抗腫瘤作用［4］。Lut可在CML、骨肉瘤等腫瘤中發揮抗癌及化療藥物增敏作用［5-6］，但目前有關Lut 對K562/ADR 細胞多藥耐藥的研究報道尚少見。本研究旨在探討Lut 逆轉K562/ADR 細胞多藥耐藥的作用及機制，為白血病的治療提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 Lut購自阿拉丁生化科技股份有限公司，純度≥98%；阿霉素（adriamycin，ADR）購自MCE 公司，純度≥98%；CCK-8試劑盒購自亞科因生物技術有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；谷胱甘肽（GSH）試劑盒購自南京建成生物工程研究所；核因子E2相關因子2（nuclear factor erythroid2-related factor 2，Nrf2）、多藥耐藥相關蛋白1（multidrug resistance protein-1，MRP1）、P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）、谷胱甘肽-S-轉移酶pi（glutathione S-transferase Pi，GST-pi）、GAPDH 引物及RT-PCR 試劑盒均購自艾科瑞生物工程有限公司；鼠抗人Nrf2、MRP1、P-gp、GST-pi、GAPDH 單克隆抗體及辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG購自武漢三鷹生物技術有限公司。BDCanto Ⅱ流式細胞儀購自美國BD 公司；QuantStudio 3 實時熒光定量PCR 儀購自美國Thermo 公司；tanon5200 化學發光成像儀購自上海天能公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 K562細胞株由濱州醫學院神經生物研究所提供；K562/ADR 耐藥細胞株購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；K562 細胞、K562/ADR 細胞均置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，在37 ℃、5%CO2的無菌培養箱中培養。以1 000 μg/L ADR 維持K562/ADR 細胞的耐藥性，實驗前2 周培養液中停用ADR，于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養基內繼續培養。當細胞生長融合度達70%～80%時，取對數生長期細胞用于后續實驗。

1.2.2 CCK-8 實驗檢測K562/ADR 細胞耐藥倍數 以每孔5×103個K562、K562/ADR細胞接種于96孔板，分別加入不同質量濃度的ADR（K562 細胞中為0、0.2、0.4、0.8 和1.6 mg/L，K562/ADR細胞中為0、16、32、64和128 mg/L）。干預24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育4 h。用酶標儀檢測450 nm波長處的光密度（OD）值，計算半數抑制率（half maximal inhibitory concentration，IC50）和耐藥倍數。耐藥倍數=IC50（K562/ADR細胞）/IC50（K562細胞）。實驗獨立重復3次。

1.2.3 CCK-8 實驗篩選Lut 對K562/ADR 細胞的無毒劑量 以每孔5×103個K562/ADR 細胞接種于96 孔板，分別加入0、2、4、8、16、32、64、128 μmol/L的Lut。干預24 h后，每孔加入10 μL 的CCK-8 溶液后繼續孵育4 h。用酶標儀測定450 nm波長處各孔的OD值，計算各濃度下細胞的抑制率，抑制率（%）=［1-（實驗組OD值/對照組OD值）］×100%。為減少Lut對K562/ADR細胞的影響，選擇無毒性（抑制率＜10%）的Lut濃度用于后續實驗。實驗獨立重復3次。

1.2.4 CCK-8 實驗檢測Lut 逆轉K562/KDR 細胞的耐藥倍數 以5×103細胞的密度接種于96 孔板，分別向0、2、4 μmol/L 的Lut 中加入不同質量濃度的ADR（0、16、32、64、128 mg/L），分為0 μmol/L Lut+ADR 組、2 μmol/L Lut+ADR 組和4 μmol/L Lut+ADR 組，干預培養24 h 后，采用CCK-8 法檢測細胞活力，計算細胞增殖抑制率、IC50值和耐藥逆轉倍數，以評估Lut 的逆轉效力。耐藥逆轉倍數=IC50（0μmol/LLut+ADR組）/IC50（2或4μmol/LLut+ADR組）。實驗獨立重復3次。

1.2.5 實驗分組及干預 以每孔1×106個K562/ADR 細胞接種于6 孔板，將實驗設為0 μmol/L Lut 組、2 μmol/L Lut 組、4 μmol/L Lut組，每組設3個復孔。各組干預24 h后進行后續實驗，實驗獨立重復3次。

1.2.6 流式細胞術檢測Lut對K562/KDR細胞內ADR蓄積的影響 按1.2.5干預分組，向各組中加入3 mg/L ADR，培養1 h后，1 000 r/min 離心5 min，PBS 洗去游離的ADR。流式細胞儀檢測激發波長485 nm、發射波長580 nm 處各組細胞的平均熒光強度，以評估各組細胞中ADR的蓄積量。

1.2.7 GSH試劑盒檢測Lut對K562/ADR 細胞內GSH水平的影響 按1.2.5干預分組，收集干預后的細胞，用超聲波細胞粉碎機破碎細胞，1 000 r/min 離心5 min取上清液，按試劑盒說明書用酶標儀測定405 nm波長處各孔的OD值，計算每組細胞中GSH的含量。

1.2.8 RT-PCR 法檢測Nrf2、MRP1、P-gp、GST-pi mRNA 的表達 按1.2.5 干預分組，收集干預后的細胞，采用Trizol 法提取細胞中的總RNA，應用分光光度計檢測提取RNA 的濃度和純度。按試劑盒說明書將提取的RNA逆轉錄為cDNA。根據SYBRGreen 試劑盒說明書檢測MRP1、P-gp、GST-pi、Nrf2 mRNA表達，以GAPDH為內參基因。各基因引物序列見表1。反應體系（20 μL）：1 μL cDNA（50 mg/L），10 μL 2×SYBR qPCR Mix，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，8 μL ddH2O。反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火及延伸30 s，共40個循環。以2-ΔΔCt法表示目的基因的相對表達水平。

Tab.1 Primer sequence of RT-PCR表1 RT-PCR引物序列

1.2.9 Western blot 檢測Nrf2、MRP1、P-gp、GST-pi 蛋白的表達 按1.2.5 干預分組，收集干預后的細胞，1 000 r/min 離心5 min，棄上清液，加入120 μL 裂解液，提取各組細胞中的總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。配制SDSPAGE 凝膠，每孔加30 μg 蛋白樣品，以80 V 恒壓電泳30 min，然后轉120 V電泳90 min。電泳結束后，將蛋白條帶轉移至PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉2 h。然后加入兔抗人Nrf2（1∶2 000）、MRP1（1∶1 000）、P-gp（1∶2 000）、GST-pi（1∶2 000）和GAPDH（1∶10 000）單克隆抗體，4 ℃孵育過夜。次日加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG，室溫搖床上孵育2 h。條帶用200 μL ECL 發光液進行曝光。蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內參蛋白灰度值。

1.3 統計學方法 采用GraphPad Prism 9.0軟件進行數據分析。計量資料以±s表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行Tukey檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 K562/ADR細胞的耐藥性 經不同濃度ADR處理24 h 后，ADR 對K562 和K562/ADR 細胞的IC50值分別為（1.96±0.34）mg/L 和（105.23±4.83）mg/L，差異有統計學意義（n=3，t=36.910，P＜0.05）；與K562 細胞相比，K562/ADR細胞對ADR具有明顯的耐藥性，耐藥倍數為53.69倍。

2.2 無細胞毒性的Lut 濃度 2、4、8、16、32、64、128 μmol/L Lut 處理K562/ADR 細胞24 h 后，細胞增殖抑制率分別為（2.35±0.76）%、（8.93±1.07）%、（18.23±1.43）%、（22.78±0.49）%、（51.93±3.62）%、（65.72±2.33）%、（72.77±3.12）%，差異有統計學意義（n=3，F=523.600，P＜0.05）。其中，2 μmol/L Lut 和4 μmol/L Lut 對K562/ADR 細胞的增殖抑制率＜10%，為無毒性的Lut濃度。

2.3 Lut 增強K562/ADR 細胞對ADR 的敏感性 與0 μmol/L Lut+ADR 組比較，2 μmol/L Lut+ADR 組和4 μmol/L Lut+ADR 組對K562/ADR 細胞的增殖抑制率更高（P＜0.05），見圖1。0 μmol/L Lut+ADR 組、2 μmol/L Lut+ADR 組、4 μmol/L Lut+ADR 組對ADR的IC50值（mg/L）分別為112.56±1.42、79.16±2.67 和34.63±0.49，依次降低（n=3，F=1 462.000，P＜0.05）。2、4 μmol/L Lut對ADR耐藥的逆轉倍數分別為1.42、3.25倍。

Fig.1 Effect of different concentrations of Lut on the sensitivity of K562/ADR cells to ADR圖1 不同濃度Lut對K562/ADR細胞ADR敏感性的影響

2.4 Lut 增加K562/ADR 細胞內ADR 的蓄積量 結果顯示，0 μmol/L Lut 組、2 μmol/L Lut 組、4 μmol/L Lut 組細胞內的平均熒光強度分別為371.00±26.06、410.00±10.15 和733.67±0.57，依次增強（n=3，F=456.000，P＜0.05）。

2.5 Lut降低K562/ADR細胞內GSH含量 0 μmol/L Lut 組、2 μmol/L Lut 組、4 μmol/L Lut 組GSH 含量（μmol/g）分別為34.05±0.56、23.37±0.17 和13.85±0.80，依次降低（n=3，F=932.800，P＜0.05）。

2.6 Lut 下調K562/ADR 細胞中Nrf2、MRP1、P-gp、GST-pi mRNA 的表達 與0 μmol/L Lut 組相比，2 μmol/L Lut 組和4 μmol/L Lut 組細胞內MRP1、Pgp、Nrf2、GST-pi mRNA 表達水平均降低（P＜0.05）；與2 μmol/L Lut 組相比，4 μmol/L Lut 組細胞內MRP1、P-gp、GST-pi mRNA 表達水平均降低（P＜0.05），Nrf2 mRNA 表達水平差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of relative expression levels of MRRP1,P-gp,Nrf2 and GST-pi mRNA between the three groups表2 各組MRRP1、P-gp、Nrf2、GST-pi mRNA相對表達水平比較（n=3，±s）

Tab.2 Comparison of relative expression levels of MRRP1,P-gp,Nrf2 and GST-pi mRNA between the three groups表2 各組MRRP1、P-gp、Nrf2、GST-pi mRNA相對表達水平比較（n=3，±s）

＊P＜0.05；a 與0 μmol/L Lut 組比較，b 與2 μmol/L Lut 組比較，P＜0.05。

組別0 μmol/L Lut組2 μmol/L Lut組4 μmol/L Lut組F MRP1 1 0.76±0.05a 0.67±0.02ab 101.700＊P-gp 1 0.53±0.07a 0.36±0.05ab 130.300＊Nrf2 1 0.57±0.14a 0.35±0.20a 15.650＊GST-pi 1 0.88±0.04a 0.64±0.08ab 48.690＊

2.7 Lut 下調K562/ADR 細胞中Nrf2、MRP1、P-gp、GST-pi 蛋白的表達 與0 μ mol/L Lut 組相比，2 μmol/L Lut 組和4 μmol/L Lut 組細胞內MRP1、Pgp、Nrf2、GST-pi 蛋白表達水平均降低（P＜0.05）；與2 μmol/L Lut 組相比，4 μmol/L Lut 組細胞內MRP1、P-gp、GST-pi 蛋白表達水平均降低（P＜0.05），Nrf2蛋白表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2、表3。

Fig.2 The expressions of MRP1,P-gp,Nrf2 and GST-pi detected by Western blot assay圖2 Western blot檢測各組細胞MRP1、P-gp、Nrf2、GST-pi蛋白表達

Tab.3 Comparison of relative expression levels of MRP1,P-gp,Nrf2 and GST-pi proteins between the three groups表3 各組細胞MRP1、P-gp、Nrf2、GST-pi蛋白相對表達水平比較（n=3，±s）

Tab.3 Comparison of relative expression levels of MRP1,P-gp,Nrf2 and GST-pi proteins between the three groups表3 各組細胞MRP1、P-gp、Nrf2、GST-pi蛋白相對表達水平比較（n=3，±s）

＊P＜0.05；a 與0 μmol/L Lut 組比較，b 與2 μmol/L Lut 組比較，P＜0.05。

組別0 μmol/L Lut組2 μmol/L Lut組4 μmol/L Lut組F MRP1 1.15±0.10 0.78±0.13a 0.51±0.06ab 31.370＊P-gp 1.42±0.03 1.04±0.03a 0.69±0.06ab 237.800＊Nrf2 1.89±0.19a 1.18±0.17a 0.85±0.17a 27.090＊GST-pi 1.20±0.11 0.78±0.05a 0.47±0.07ab 63.940＊

3 討論

多藥耐藥是指腫瘤細胞同時對不同功能和作用機制的藥物產生耐藥的現象，化療耐藥是目前CML治療失敗的主要原因。研究證實，Lut 可以通過PI3K/Akt信號通路逆轉宮頸癌細胞對阿霉素的耐藥性［7］。本研究發現Lut對穩定耐藥的K562/ADR細胞具有明顯的細胞毒性作用，可以增強K562/ADR 細胞對ADR的敏感性，并且隨著Lut的濃度升高，其逆轉耐藥的效果增強。

目前，對化療藥物作用于腫瘤多藥耐藥的機制研究主要集中在ATP結合盒（ABC）轉運蛋白超家族的過表達，主要包括MRP1、P-gp、乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）［8-9］。這類蛋白是一種跨膜蛋白，在腫瘤細胞中可以利用ATP水解酶產生的能量逆濃度梯度將長春新堿、ADR 等抗腫瘤藥物及GSH、葡萄糖醛酸或硫酸鹽結合的有機陰離子輸送出細胞［10］。隨著對Nrf2 轉錄靶點的深入研究，發現Nrf2 作為MRP1 和P-gp的上游靶點，其表達水平與腫瘤細胞耐藥呈正相關，當Nrf2 過度激活時會導致藥物外排蛋白的過度表達［11-12］。研究發現，紫膠素P 可通過抑制PI3K/Nrf2 信號通路下調MRP1 表達，增強ADR 對MCF-7和K562 細胞的毒性作用［13］。橘皮素可通過抑制Nrf2 及其下游靶點P-gp 表達來增高非小細胞肺癌細胞中紫杉醇濃度，提高非小細胞肺癌細胞對紫杉醇的敏感性［14］。本研究發現Lut 作用于K562/ADR細胞后，Nrf2、MRP1 和P-gp 表達隨Lut 濃度增高而降低，而細胞內ADR 的蓄積量則隨Lut 濃度增高而增加，提示Lut 可通過抑制Nrf2 下調藥物外排蛋白MRP1和P-gp的表達，使細胞外排藥物減少，增加細胞內ADR 的累積量，提高K562/ADR 細胞對ADR 敏感性。這與上述文獻報道的抑制Nrf2可以靶向抑制MRP1、P-gp藥物蛋白表達的研究結果一致。

GST-pi 是Ⅱ相代謝酶GST 同工酶的主要形式，在肺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤細胞中異常表達，其作用機制主要是通過激活腫瘤細胞膜上ATP依賴的GST，催化GSH與化療藥物結合形成復合物，然后谷胱甘肽-S 結合泵（如MRP1、P-gp 等）促進GSH 結合物外排，從而加強對化療藥物的外排作用，降低化療敏感性［15-16］。大多數過表達MRP1/P-gp的耐藥細胞均維持較高的細胞內GSH水平，以確保抗腫瘤藥物在細胞內處于較低濃度，而這些轉運蛋白對化療藥物的轉運能力與GSH水平呈正相關［17］。研究發現，下調GST-pi 蛋白表達可顯著降低K562/A02 細胞對的ADR 耐藥性［18］。本研究結果顯示，Lut 可降低K562/ADR 細胞內GST-pi 表達和GSH 含量，進而減少細胞內GSH-ADR 結合物生成及ADR 外排，提高K562/ADR細胞對化療藥物的敏感性，逆轉其多藥耐藥。這與上述文獻報道的降低GST-pi、抑制MRP1及P-gp轉運功能可提高化療敏感性一致。

綜上所述，Lut 能抑制K562/ADR 細胞生長并逆轉其多藥耐藥，其作用機制可能是：一方面Lut 可降低GST-pi 表達水平及細胞內GSH 含量，從而減少GSH-ADR結合物的生成；另一方面，Lut可通過下調Nrf2 及其下游轉錄因子MRP1、P-gp 的表達，抑制K562/ADR 細胞對GSH-ADR 結合物的泵出，使細胞中ADR得到積累以增強ADR的療效。本研究為Lut治療CML 提供了實驗依據，但Lut 在CML 動物體內的藥理作用及具體作用機制尚需深入研究。