基于網絡藥理學研究瓜子金抗腦缺血損傷的效應機制*

顧瑛媛,張春菲,張浩洪,吳 招,鄒楠婷,莫慶艷,巨鳴謙,萬春平△

(1.常州市中醫醫院,江蘇 常州 213003;2.云南中醫藥大學第一附屬醫院,云南 昆明 650021)

腦缺血(cerebral ischemia,CI)是一種臨床上常見的急性腦血管疾病,患者會發生類似于腦出血或腦梗塞的臨床表現,長期的腦缺血可能會引發持久性或進行性的神經功能和認知功能障礙[1]。腦缺血是致殘的主要原因,是世界范圍內僅次于心血管疾病和癌癥的第三大死亡原因,其發病率隨著年齡的增長而上升[2]。大腦對缺血反應非常迅速,僅僅幾秒鐘的時間大腦功能就會受損,但仍是可逆的。持續幾分鐘或更長時間的腦缺血可能會引發一系列連鎖反應,最終導致細胞損失或是其他結構發生變化導致不可逆轉的缺陷[3]。臨床治療缺血性腦損傷的原則之一是盡早恢復血液再灌注,這將有助于減輕缺血性腦損傷,使某些不可逆損傷至少在功能上得到恢復。但是,腦缺血后再灌注也可能會引起腦損傷,導致腦水腫、腦出血和神經元死亡,這種現象稱為腦缺血/再灌注損傷(I/R)[4]。因此積極研發減輕腦I/R損傷治療方法,是降低患者死亡率和致殘率的重要手段。

瓜子金為遠志科(polygalaceae)遠志屬(polygala)植物瓜子金(polygalajaponicaHoutt.)的全草。具有祛痰止咳,活血消腫,解毒止痛功效,用于咳嗽痰多,咽喉腫痛;外治跌打損傷,疔瘡癤腫,蛇蟲咬傷等癥[5-8]。瓜子金中的主要成分包括皂苷類和黃酮類化合物,另外還有口山酮類化合物、多糖等。研究已表明,瓜子金及活性成分具有神經保護作用,對缺血再灌注損傷具有顯著的治療作用,但確切的抗缺血損傷的作用靶點及活性成分尚未明確。因此本研究通過網絡藥理學鑒定其活性成分成分,預測其潛在的作用靶點及機制,為民間常用草藥瓜子金進一步研究和應用提供思路和方法。

1 材料與方法

1.1 軟件與網站 數據庫和軟件主要包括:化源網(https://www.chemsrc.com/)、TCMSP數據庫(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmcp.php)、Pubchem數據庫、GeneCards數據庫、Uniport 數據庫(http://www.uni-prot.org/)、STRING數據庫、OMIM數據庫、TTD數據庫、ETCM數據庫、DisGeNET數據庫(https://www.disgenet.org/)、VENN圖軟件、Cytoscape3.8.0軟件、R4.1.1軟件等。

1.2 瓜子金的活性成分及靶點預測 前期根據國內外文獻調研尋找瓜子金中所含的化學成分[5-11],利用化源網查詢其各個化學成分的CAS號,TCMSP數據庫檢索所有化學成分,以口服生物利用度≥30%和類藥性≥0.18[13]為標準進行相關活性成分篩選。通過 TCMSP 數據庫篩選活性成分對應靶標,將篩選的靶標成分與UniProt數據庫進行匹配,得到靶標基因。再利用Cytoscape3.8.0軟件構建瓜子金活性成分-作用靶點網絡。

1.3 腦缺血相關基因靶點的篩選 通過OMIM、TTD、TCMSP、ETCM、DisGeNET和GeneCards數據庫檢索與腦缺血相關基因。為了使結果更加全面準確,所使用檢索詞cerebral ischemia進行檢索,獲取與腦缺血相關基因。

1.4 瓜子金活性成分靶點與腦缺血相關靶點相互作用網絡構建與分析 瓜子金活性成分靶點基因和腦缺血相關基因兩者利用R語言韋恩圖進行合并,得到兩者合并的VENN圖,圖中交集的部分即瓜子金活性成分治療腦缺血的靶點基因,導出基因-疾病TSV文件。利用Cytoscape3.8.0軟件構建瓜子金活性成分-疾病-作用靶點網絡,通過網絡分析結果制作藥物-疾病-靶點網絡可視圖。

1.5 蛋白互相作用網絡的構建與核心靶點的分析 將瓜子金活性成分與腦缺血共同靶基因導入String 數據庫,設置連接評分最小值為 0.900,得到蛋白互作關系導出TSV文件。利用R語言計算各主要蛋白之間的互作次數和核心靶點,篩選出前30個核心靶點作PPI網絡核心基因可視化圖。

1.6 GO功能富集分析與KEGG通路富集分析 GO 富集分析包括生物過程、分子功能和細胞組分,闡明在生物過程、分子功能和細胞成分方面哪些基因的代表性過高或過低[14-15]。首先將共同靶基因轉換成 entrezID,在R軟件安裝“Bioconductor”包,輸入藥物和疾病靶點文件,將其基因名轉換為entrezID,根據已轉換的entrezID,以P<0.05進行關鍵靶基因的 GO 和 KEGG 功能富集分析,結果均以條形圖和氣泡圖形式展示。

2 結果

2.1 瓜子金活性成分及靶點預測 通過篩選條件,從 TCMSP 數據庫中共獲得瓜子金4個活性成分,結果如表1。通過 TCMSP 數據庫預測和Uniprot 數據庫校正去重,共獲得144個化合物相關潛在靶點,利用Cytoscape3.8.0軟件構建瓜子金活性成分-作用靶點網絡,結果見圖1。

2.2 腦缺血相關基因靶點的篩選 通過OMIM、TTD、TCMSP、ETCM、DisGeNET和GeneCards數據庫檢索與腦缺血相關基因,通過條件篩選其中OMIM數據庫中得到192個相關基因靶點,TDD數據庫得到4個,TCMSP數據庫得到6個,ETCM數據庫得到58個,DisGeNET數據庫得到118個,GeneCards數據庫得到1550個,篩除相同的基因靶點得到總的腦缺血相關基因靶點有1671個。

2.3 瓜子金活性成分靶點與腦缺血相關靶點相互作用網絡構建與分析 將瓜子金活性成分靶點基因與腦缺血相關基因用R語言韋恩圖進行合并,制作出VENN圖,交集的靶點基因共有105,結果見圖2。推測這些可能為瓜子金治療腦缺血的基因靶點。通過 Cytoscape3.8.0軟件構建瓜子金活性成分-疾病-作用靶點網絡,結果見圖3。圖中黃色代表藥物與疾病共同基因,藍色代表瓜子金的有效成分,并對該網絡圖中的每個節點的 Degree 進行分析。可得出前4位核心成分為常春藤皂苷元(hederagenin)、槲皮素( quercetin)、山奈酚(kaempferol)、1,3,7-三羥基-9H-氧雜蒽-9-酮(Gentisein)分別能與15、132、55、5個關鍵靶點連接,其中對治療腦缺血具有重要的意義,具體見表1,選取 Degree≥3 的活性成分進行展示。

圖3 瓜子金活性成分-疾病-作用靶點網絡

2.4 蛋白互相作用網絡的構建與核心靶點的分析 蛋白互作網絡圖中節點表示蛋白,邊表示蛋白之間的關聯,網絡圖中的最小互助得分為>0.900,共涉及105個節點,374條邊,平均度為 7.12,結果見圖4。利用R語言計算各主要蛋白之間的互作次數,并據此找到核心靶點,篩選出前30個核心靶點作PPI網絡核心基因可視化,結果見圖5。左側為前30個核心基因名稱,X軸代表其節點數目,共獲得AKT1、IL-6、TNF、IL1B、CASP3、TP53、JUN、MMP9、PTGS2、CXCL8、EGFR、HIF1A、PPARG、MYC、HSP90AA1、IL10、CCND1、FOS等核心蛋白。

圖4 PPI蛋白互作網絡

圖6 GO富集分析柱狀圖(前20)

圖7 GO富集分析氣泡圖(前20)

2.6 KEGG通路分析 對105個共同靶點進行KEGG通路富集分析,顯示參與 KEGG代謝通路共有163條,篩選前20 條發現通路主要與AGE-RAGE信號通路、血脂和動脈粥樣硬化、Toll樣受體信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、IL-17 信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、Th17 細胞分化、乙肝、PI3K-Akt信號通路和C型凝集素受體信號通路等相關,結果見圖8～圖10。相關通路涉及到炎癥反應、細胞凋亡與免疫調節等多個環節,提示瓜子金可能通過調控該信號通路從而起到治療作用及調節多種代謝通路共同發揮治療腦缺血的作用。

圖8 KEGG通路分析柱狀圖(前20)

圖9 KEGG通路分析氣泡圖(前20)

3 討論

瓜子金為遠志科(polygalaceae)遠志屬(polygala)植物瓜子金(polygalajaponicaHoutt.)的干燥全草,《中國藥典》2015 年版一部收載用藥,瓜子金又名瓜子草、來麻回、散血丹、小遠志、金鎖匙、地藤草[6-8]。“瓜子金”是一種廣泛分布于中國南方的多年生草本植物。全草在民間醫學中被用作祛痰、消炎和抗菌藥物,主要含有黃酮、皂苷和類固醇等活性成分[16]。研究表明,遠志屬植物瓜子金的藥理活性包括:抗抑郁、抗炎作用、改善學習記憶和減輕認知障礙、抗腫瘤、抗肝癌和抑制乙肝病毒及保肝作用、抗血和凝血作用、保護心腦血管、抗衰老、鎮靜催眠作用及神經保護作用等[17]。臨床上主要用于治療骨髓炎、關節炎、失眠癥等疾病。已有研究表明,瓜子金皂苷己對缺血再灌注損傷的神經細胞具有明顯的保護作用[18],然而確切的作用機制尚未明確,有待進一步研究。

本研究通過網絡藥理學證實,從瓜子金中所含9個皂苷成分和41個黃酮類成分中篩選得到4個活性化合物,分別是常春藤皂苷元、槲皮素、山奈酚、1,3,7-三羥基-9H-氧雜蒽-9-酮,在腦缺血中相關靶點有1671個,瓜子金活性成分與疾病共作用靶點有105個,通過對交集基因進PPI互作分析發現,AKT1、IL6、TNF、IL1β、CASP3、TP53、JUN、MMP9、PTGS2、CXCL8、EGFR、HIF1A、PPARG、MYC、HSP90AA1、IL10、CCND1、FOS、IFNG等為關鍵基因。進一步分析這些靶點和交集基因,瓜子金可顯著抑制炎癥反應和介導免疫調節作用,以上核心成分可能作為瓜子金治療腦缺血的主要藥效群。KEGG通路富集結果中,其通路包括AGE-RAGE信號通路、血脂和動脈粥樣硬化、Toll樣受體信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、IL-17 信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、Th17 細胞分化、乙肝、PI3K-Akt信號通路和C型凝集素受體信號通路等。血脂代謝和動脈粥樣硬化以及流體剪切應力與動脈粥樣硬化與腦缺血發病密切相關,已作為短暫性腦缺血發作的重要危險因素[19-20],而AGE-RAGE信號通路一組特異性組合,通過激發多種細胞因子的形成與釋放,導致機體神經、血管的病理改變。同時導致氧化應激的發生,進而激活NF-κB信號通路,使血流調節受損,導致神經內膜血流灌注減少[21]。腫瘤壞死因子信號通路、IL-17 信號通路和Th17 細胞分化為治療腦缺血的關鍵炎癥通路。腫瘤壞死因子(TNF)作為關鍵的炎癥細胞因子,參與細胞凋亡、炎癥和免疫,誘導全身炎癥反應,IL-17家族可激活MAPK,NF-κB和C/EBPs途徑中的抗細胞因子和趨化因子,在免疫炎癥介質的產生、免疫細胞的趨化遷移等發揮關鍵作用[22-23]。PI3K-Akt信號通路參與細胞生長、轉錄、翻譯、細胞增殖、細胞運動及糖原代謝,同時PI3K/AKT信號通路參與星形膠質細胞Cx43的調節可能會對腦缺血損傷引起的氧化應激、炎癥反應和細胞凋亡具有神經保護作用[24]。Toll樣受體信號通路中Toll樣受體TLRs廣泛分布在免疫細胞尤其非特異免疫細胞以及某些體細胞表面,它是生物一種模式識別受體,通過識別病原相關分子模式PAMPs來啟動免疫反應。研究表明,Toll樣受體4(TLR4)通過其信號通路誘導炎癥級聯反應,產生大量的細胞因子,是腦缺血再灌注損傷的機制之一,可能成為預防腦缺血再灌注損傷的新靶點[25]。

綜上所述,本論文運用網絡藥理學預測了瓜子金的活性成分及其在腦缺血治療中的潛在靶點,發現瓜子金中的常春藤皂苷元、槲皮素、山奈酚和1,3,7-三羥基-9H-氧雜蒽-9-酮可能通過調控PI3K-Akt信號通路與Toll樣受體信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、AGE-RAGE信號通路、IL-17 信號通路以及藥物結合、質膜區響應與神經元影響等生物功能進而影響機體內的免疫調節、炎癥反應、細胞生存、細胞周期和細胞凋亡進程,從而發揮對腦缺血的治療作用,為進一步開發利用瓜子金治療腦缺血中提供了新的視角和線索,也為深入的機制研究和臨床應用提供了方向。但數據庫中納入的信息有一定的局限性,還需進一步通過疾病動物模型和臨床進行論證。