維藥羅歐咳祖帕抗哮喘活性評價和作用機制研究

郭朋程 王 婷 童應鵬 謝振達 姜春筱 周 戚 王建新,

(1 復旦大學藥學院藥劑學系,智能化遞藥教育部重點實驗室,上海,201203; 2 復旦大學中西醫結合研究院藥物研究所,上海,201203; 3 臺州學院,高等研究院天然產物與健康產品研究所,臺州,318000)

哮喘是一種以氣道炎癥和氣道高反應性為主要特征的慢性免疫疾病,也是最常見的兒童慢性疾病,對不同年齡段的人群均有影響,目前,全球約有3億人患有哮喘[1-2]。哮喘的發病與環境污染密切相關,研究表明,48%的兒童哮喘與空氣污染有關[3]。此外,遺傳因素、影響健康的社會壓力均密切相關,使其發病率和死亡率均急劇增加,尤其是中低收入的國家[4]。

維吾爾醫學(簡稱“維醫”)在哮喘的治療上積累了豐富的臨床經驗,根據維醫體液論,哮喘可分為異常黑膽質型哮喘、異常黏液質型哮喘、異常膽液質型哮喘[5]。異常黏液質型哮喘患者的臨床表現主要體現為喉中聞及哮鳴有聲、咳痰稀白、不易咯、面色白澤或晦黃、唇色淡白、口不干、胸膈滿悶、大便溏薄,色淡黃氣腥臭、小便清長舌質淡舌形胖,舌涎多,舌苔薄而潤,或白膩,脈粗緩弱[5]。維醫認為羅歐咳祖帕(LKZP)是治療異常黏液質型哮喘的有效方劑,它主要由神香草和鳶尾根組成,具有溫肺平喘、止咳化痰作用[6]。方中神香草為唇形科(Labiatea)硬尖神香草(HyssopuscuspidatusBoriss.)干燥全草,可調節異常黏液質,為主藥[7];鳶尾根為鳶尾科(Iridanceae)植物喜堿鳶尾(IrishalophilaPall.)的干燥根莖,在方中主要是協助神香草清理膿性黏液質的作用[8]。藥理學研究也結果顯示,神香草和(或)鳶尾根均具有抗哮喘[9]、抗炎[10-11]、調節免疫力[12]等活性,但是目前還尚未對神香草和鳶尾根的組合方劑——LKZP抗哮喘的活性進行藥理學評價,其抗哮喘作用機制研究也不深入,為此,本研究首先采用卵蛋白(Ovalbumin,OVA)誘導的哮喘模型小鼠評價了LKZP抗哮喘活性,隨后采用網絡藥理學方法和分子對接技術分析了LKZP治療哮喘的物質基礎和作用機制,為后期制劑開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 BALB/c雌性小鼠,6～8周齡,體質量(20±2)g,購于上海杰思捷實驗動物有限公司,合格證號為SCXK(滬)2018-0004。所有小鼠被置于模擬晝夜變化(12 h白天,12 h黑夜)的清潔室內,溫度20～24 ℃,濕度50%。所有的動物實驗方案均獲得復旦大學實驗動物倫理委員會的批準(倫理審批號:2020華山醫院JS-675)。

1.1.2 藥物 LKZP提取物由復旦大學藥學院制備,制備方法為取神香草250 g和鳶尾根250 g,加入3.6 L水溶液,煎煮2次,1 h/次,然后濃縮至1 000 mL(相當于500 g生藥材/1 000 mL),臨用前稀釋成15 g生藥材/kg動物重量。陽性對照藥為醋酸地塞米松片(浙江仙琚制藥股份有限公司,國藥準字H33020822)。

1.1.3 試劑與儀器 卵蛋白(OVA)(Sigma公司,美國,貨號:A5503),氫氧化鋁佐劑(Thermo Fisher Scientific公司,美國,貨號:77161),戊巴比妥鈉(Sigma公司,美國,貨號:P3621進口分裝),乙酰甲膽堿(Sigma公司,美國,貨號:A2251)。氣道阻力及肺順應性測量系統(FinePointe RC System,Buxco公司,美國,型號:RC),光學顯微鏡(Nikon公司,日本,型號:ECLIPSE 80i)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 48只小鼠適應性喂養1周后,隨機分為正常組、模型組、水提組和地塞米松組。模型組、水提組和地塞米松組小鼠于第0天一次性腹腔注射OVA20 μg和氫氧化鋁2 mg的生理鹽水混懸液0.2 mL,使小鼠處于致敏狀態。分別在第7天、第14天和第21天以相同的方法再加強致敏3次。第25天起每天超聲霧化吸入3%OVA誘發哮喘約30 min,以小鼠出現呼吸加快、口唇發紺、腹肌痙攣、點頭呼吸及站立不穩等表現為模型建立成功的標志,連續7 d。

1.2.2 給藥方法 給藥組小鼠于第24天開始灌胃服用相應的藥物,每次霧化吸入前30 min給藥,每次灌胃給藥0.3 mL,連續灌服藥物8 d。

1.2.3 哮喘小鼠氣道高反應性(Airway Hyperresponsiveness,AHR)的測定 最后一次超聲霧化吸入3%OVA的24 h后,用戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉小鼠,然后采用氣道阻力及肺順應性測量系統測量小鼠的氣道阻力。實驗是通過霧化吸入不同劑量的乙酰甲膽堿(0、3.125、6.25和12.5 mg/mL)以激發小鼠發生后的產生的變化,以評估藥物對哮喘小鼠AHR的影響,數據以與基線值的百分比變化表示。

1.2.4 肺組織病理學分析 AHR測定結束后,迅速取出肺組織,把肺組織周圍所連接的組織剝離干凈后,在4 ℃生理鹽水中迅速漂洗,去除血漬和污物。將右肺上葉連同右主支氣管置于4%的中性甲醛中浸泡固定,石蠟包埋,用5 μm切片進行組織病理學分析。肺切片用蘇木精-伊紅(Hematoxylin Eosin,HE)染色,以評估肺部組織的變化。使用光學顯微鏡進行拍照,并對所得圖像進行分析。

1.3 基于網絡藥理學的LKZP抗哮喘的活性成分和作用機制研究

1.3.1 LKZP的化學成分及其作用靶點的收集和整理 通過檢索國家知識基礎設施數據庫(China National Knowledge Infrastructure,CNKI)和web of science等數據庫[13],收集硬尖神香草和喜堿鳶尾的化學成分[8-9,11,14-21],并采用chemdraw 16.0軟件繪制化合物的結構式,整理成SMILES格式;將所有化合物導入SwissADME數據庫(http://www.swissadme.ch/),篩選出符合Lipinski規則的化合物,再通過SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)預測上述化合物的作用靶點。

1.3.2 LKZP抗哮喘的作用靶點 以“asthma”為關鍵詞,分別檢索在線人類孟德爾遺傳數據庫(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM,(https://www.omim.org/)和DisGeNET數據庫(https://www.disgenet.org/)的與哮喘相關的基因[22-26],然后通過交集分析,確定LKZP作用靶點與疾病靶點的交集,上述交集靶點被認為是LKZP治療哮喘的潛在靶點。

1.3.3 蛋白質-蛋白質相互作用(Protein-protein Interaction,PPI)網絡的構建 將上述交集靶點數據導入STRING數據庫(https://string-db.org/)[27],物種選擇為“homo sapiens”,構建PPI網絡,將最小互作值設定為high confidence(0.7),同時隱藏了網絡中沒有連接的節點,PPI網絡的分析結果以tsv數據格式導入Cytoscape 3.8.2軟件中,進行拓撲分析,以Degree值大于中位數2倍的靶點作為LKZP治療哮喘的關鍵靶點。

1.3.4 基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析 采用David 6.8數據庫(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)對LKZP治療哮喘的關鍵靶點進行GO功能和KEGG信號通路的富集分析[28],采用Prism 7軟件繪制GO功能柱狀圖,采用聯川生物云分析平臺(https://www.omicstudio.cn/tool/11)繪制KEGG氣泡圖。

1.3.5 活性成分-作用靶點-信號通路網絡的構建 利用Cytoscape 3.8.2軟件[29],以LKZP化學成分、抗哮喘作用靶點和信號通路為節點,將化合物及其作用的抗哮喘疾病靶點以及抗哮喘作用靶點與其富集的KEGG信號通路分別以邊相連接;若化合物的作用靶點富集到某一信號通路中,則將化合物與該信號通路也以邊相連接,構建出LKZP抗哮喘活性成分-作用靶點-信號通路的網絡。再利用Analyze Network工具對上述網絡進行分析,將化合物、靶點和信號通路三類節點中,Degree值排名前10的節點提取出來,構建出LKZP抗哮喘的核心網絡,從而確定其抗哮喘關鍵活性成分、作用靶點及信號通路。

1.4 分子對接研究 依據1.3項下LKZP抗哮喘活性成分-作用靶點-信號通路網絡的分析結果,使用ChemOffice 2014軟件繪制關鍵活性成分的結構并使其能量最小化,保存為mol2格式;接著從PDB數據庫中下載關鍵靶點的PDB格式數據,采用Pymol軟件完成去水和去掉配體等操作;然后采用AutoDock Tools 1.5.6軟件將關鍵活性成分和關鍵靶點的格式都轉換為pdbqt格式;最后采用AutoDock Vina 1.1.2進行分子對接,采用Pymol軟件進行可視化操作。

1.5 統計學方法 采用SPSS 21.0統計軟件進行數據分析,組間比較采用t檢驗,以P<0.05為差異有統計學意義。采用GraphPad Prism 8.0軟件作圖。

2 結果

2.1 LKZP對哮喘小鼠氣道高反應性的影響 如圖1所示,隨著乙酰甲膽堿劑量的增加,短期OVA致敏和激發能夠明顯增加小鼠氣道阻力,在12.5 mg/mL乙酰甲膽堿劑量下,小鼠氣道阻力(P<0.01)增加尤為顯著。與哮喘模型組比較,水提組能顯著降低氣道阻力。隨著乙酰甲膽堿劑量增加,降低氣道阻力的作用越明顯(P<0.05),且與陽性對照藥物地塞米松組差別無統計學意義(P>0.05)。

圖1 LKZP對哮喘小鼠氣道高反應性的影響

2.2 LKZP不同提取物對哮喘小鼠肺組織病變的影響 肺部病理學結果顯示,正常組中肺組織支氣管結構、輪廓相對完整。與正常小鼠比較,OVA激發引起大量炎癥細胞向支氣管周圍浸潤,OVA誘導的哮喘小鼠肺部有大量黏液分泌,炎性細胞大量浸潤,基底膜顯著增厚,氣管平滑肌明顯增厚,肺組織結構被破壞。LKZP水提取物干預顯著降低支氣管和血管周圍炎癥細胞浸潤,緩解氣道的損傷,改善平滑肌的增厚。見圖2。

圖2 LKZP對哮喘小鼠肺組織病理學的影響(HE染色,×200)

2.3 LKZP抗哮喘網絡藥理學的研究結果

2.3.1 LKZP潛在活性成分和潛在靶點 LKZP中符合Lipinski規則的化合物共有136個,其中硬尖神香草和喜堿鳶尾根的成分分別有53個和83個。在SwissTargetPrediction數據庫中共獲得上述成分的無重復作用靶點共841個。

2.3.2 PPI網絡的構建與分析 通過LKZP作用靶點與哮喘疾病靶點的交集分析,共獲得312個交集靶點。在由STRING數據庫和Cytoscape 3.8.2軟件繪制的PPI網絡中,共含有297個節點和2 457條邊,節點Degree值的中位數為12,其中Degree值>24的核心靶點共66個。

2.3.3 核心靶點的GO功能富集及KEGG通路富集分析 依據DAVID數據庫對66個核心靶點的GO功能和KEGG信號通路分析結果,發現共有391個GO條目(P<0.05),其中生物過程(Biological Process,BP),細胞組分(Cellular Component,CC)和分子功能(Molecular Function,MF)的條目分別有298、32和61條,分別占條目總數的76.21%,8.18%和15.60%。見圖3A。每組前10個條目的GO富集分析條形圖見圖3B(按照P值從小到大排列)。由此可見,LKZP的核心靶點主要參與了胞質鈣離子濃度的正調控(Positive Regulation of Cytosolic Calcium Ion Concentration)、血小板活化(Platelet Activation)、炎癥反應(Inflammatory Response)、一氧化氮生物合成過程的正調控(Positive Regulation of Nitric Oxide Biosynthetic Process)、磷脂酰肌醇3-激酶信號轉導的調控(Regulation of Phosphatidylinositol 3-kinase Signaling)、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控(Positive Regulation of Transcription from RNA PolymeraseⅡ Promoter)、平滑肌細胞增殖的正調控(Positive Regulation of Smooth Muscle Cell Proliferation)、ERK1和ERK2級聯的正調控(Positive Regulation of ERK1 and ERK2 Cascade)、磷脂酰肌醇介導的信號轉導(Phosphatidylinositol-mediated Signaling)和脂多糖介導的信號通路(Lipopolysaccharide-mediated Signaling Pathway)等生物過程。細胞組分主要涉及質膜(Plasma Membrane)、質膜的組成部分(Integral Component of Plasma Membrane)、磷脂酰肌醇3-激酶復合物(Phosphatidylinositol 3-kinase Complex)、細胞質(Cytoplasml)、蛋白質復合物(Protein Complex)等方面。分子功能主要與蛋白磷酸酶結合(Protein Phosphatase Binding)、酶結合(Enzyme Binding)、相同蛋白結合(Identical Protein Binding)、蛋白結合(Protein Binding)、磷脂酰肌醇-4、5-二磷酸3-激酶活性(Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase Activity)等有關。

圖3 LKZP作用靶點的GO功能分析

共富集得到了119條信號通路(P<0.05),其中有39條信號通路的P<1×10-9。在上述39條信號通路中,有16條與疾病相關的途徑,又分為癌癥和微生物感染性疾病等2大類。見圖4A。在非疾病信號通路中。見圖4B。有12條信號通路是與調節炎癥反應相關,包括PI3K-AKT信號通路(PI3K-AKT Signaling Pathway,hsa04151)、FcεRI信號通路(Fc Epsilon RI Signaling Pathway,hsa04664)、TNF信號通路(TNF Signaling Pathway,hsa04668)、ErbB信號通路(ErbB Signaling Pathway,hsa04012)、Toll樣受體信號通路(Toll-like Receptor Signaling Pathway,hsa04620)、催乳素信號通路(Prolactin Signaling Pathway,hsa04917)、T細胞受體信號通路(T cell Receptor Signaling Pathway,hsa04660)、自然殺傷細胞介導細胞毒性(Natural Killer Cell Mediated Cytotoxicity,hsa04650)、趨化因子信號通路(Chemokine Signaling Pathway,hsa04062)、白細胞跨內皮遷移(Leukocyte Transendothelial Migration,hsa04670)、Jak-STAT信號通路(Jak-STAT Signaling Pathway,hsa04630)和B細胞受體信號通路(B Cell Receptor Signaling Pathway,hsa04662)等。有3條信號通路是與調節支氣管血管有關的,包括HIF-1信號通路(HIF-1 Signaling Pathway,hsa04066)、VEGF信號通路(VEGF Signaling Pathway,hsa04370)和鈣信號通路(Calcium Signaling Pathway,hsa04020)。剩余的8條信號通路,包括鞘脂信號通路(Sphingolipid Signaling Pathway,hsa04071)、破骨細胞分化(Osteoclast Differentiation,hsa04380)、FoxO信號通路(FoxO Signaling Pathway,hsa04068)、甲狀腺激素信號通路(Thyroid Hormone Signaling Pathway,hsa04919)、黏著斑(Focal Adhesion,hsa04510)、雌激素信號通路(Estrogen Signaling Pathway,hsa04915)、mTOR信號通路(mTOR Signaling Pathway,hsa04150)和胰島素抵抗(Insulin Resistance,hsa04931)等。

圖4 LKZP核心靶點富集的KEGG信號通路

2.3.4 活性成分-作用靶點-信號通路網絡的分析 在構建的LKZP抗哮喘的“活性成分-核心靶點-信號通路”的網絡中(圖5A),共包含了120個化合物(綠色和黃色節點分別代表來源于硬尖神香草和喜堿鳶尾的化學成分)、66個核心靶點(藍色節點)及其富集到的119條信號通路(紅色節點),上述3類節點的中位數Degree值分別為80、25和76,說明LKZP中很多化合物可以干預多個作用靶點,從而作用于多條信號通路。而在LKZP抗哮喘“活性成分-核心靶點-信號通路”的核心網絡中(圖5B),化合物、靶點和信號通路等三類節點的平均Degree值可達到118.5、79.9和117.2,均遠高于Degree中位數值,因此,這些靶點是LKZP抗哮喘作用網絡中的關鍵樞紐。

圖5 LKZP化學成分-作用靶點-信號通路的網絡(A)及其核心網絡(B)

從圖5B和表1中也可知,LKZP可能主要通過作用于MAPK1、EGFR、MAPK3、PIK3CA、AKT1、PIK3CB、PIK3CD、PIK3R1、PRKCA、ESR1等關鍵靶標發揮治療哮喘的作用。其中MAPK1和MAPK3為編碼細胞外信號調節蛋白激酶(ERK),PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD和PIK3R1均編碼磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K),EGFR、AKT1、PRKCA和ESR1分別編碼表皮生長因子受體蛋白(EGFR)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)、蛋白激酶C alpha(PKCα)和雌激素受體1(ESR1)。

表1 LKZP抗哮喘的潛在活性成分、作用靶點和信號通路

LKZP作用的關鍵信號通路包括HIF-1信號通路(hsa04066)、VEGF信號通路(hsa04370)、鈣信號通路(hsa04020)、PI3K-AKT信號通路(hsa04151)、ErbB信號通路(hsa04012)、甲狀腺激素信號通路(hsa04919)、黏著斑(hsa04510)、雌激素信號通路(hsa04915)、Rap1信號通路(Rap1 signaling pathway,hsa04015)、催產素信號通路(Oxytocin signaling pathway,hsa04921)。這些信號通路基本和調節炎癥反應和支氣管血管有關。

按照化學結構分類,LKZP中治療哮喘的關鍵活性成分可以分為3大類。見表1和圖6。分別為萜類,共計6種,包括(7S,10R)-11-hydroxy-4,5-seco-guai-1-ene-4-one(S15)、desacetylmatricarin(S36)、(4aR,5R)-6-hydroxy-4a,5-dimethyl-3-(prop-1-en-2-yl)-3,4,4a,5,6,7-hexahydronaphthalen-1(2H)-one(S8)、Hyssopusin A(S17)、eudesmane-1β,5α,11-triol(S4)和Cryptomeridiol(S6);苯丙素類成分2種,包括Caffeic Acid(S92,Y11)和(+)-isolariciresinol(S43);黃酮類成分2種,分別為5,6,7,4′-tetrahydroxy-8-methoxy isoflavone(Y78)和Naringenin(Y36)。其中來源于神香草和鳶尾根的活性成分分別有8種和3種,二者共有成分有1種,為Caffeic Acid。

圖6 LKZP治療哮喘潛在的關鍵活性成分

2.4 分子對接分析 將LKZP抗哮喘的7個關鍵核心靶點蛋白ESR1(1A52)、EGFR(1M17)、AKT1(1UNQ)、MAPK1(2Y9Q)、PIK3CA(4JPS)、MAPK3(4QTB)和PIK3CD(5DXU)與前10種關鍵活性成分進行了分子對接。從表2可知,僅AKT1與Hyssopusin A(S17)、Caffeic Acid(S92,Y11)之間的結合能>-5 kcal/mol;結合能<-7 kcal/mol(1 cal=4.184 J)的有43組,占總數的61.42%。并且有5組之間的結合能<-9.0 kcal/mol,分別為MAPK1與Desacetylmatricarin(S36)、5,6,7,4′-tetrahydroxy-8-methoxy isoflavone(Y78),MAPK3與Desacetylmatricarin(S36)、5,6,7,4′-tetrahydroxy-8-methoxy isoflavone(Y78)、Naringenin(Y36),二者的共有高結合能成分為Desacetylmatricarin(S36)、5,6,7,4′-tetrahydroxy-8-methoxy isoflavone(Y78),其與MAPK1和MAPK3的結合模式見圖7。其中MAPK1與Desacetylmatricarin結合的氨基酸殘基為LYS-54 GLN-105和LYS-114,MAPK1與5,6,7,4′-tetrahydroxy-8-methoxy isoflavone結合的氨基酸殘基為LYS-54和MET-108,二者相同的氨基酸殘基為LYS-54;MAPK3與desacetylmatricarin和5,6,7,4′-tetrahydroxy-8-methoxy isoflavone則沒有相同的氨基酸殘基。

表2 LKZP抗哮喘關鍵靶點與活性成分之間的結合能

圖7 LKZP抗哮喘關鍵靶點與活性成分分子對接可視化

3 討論

哮喘是由多種氣道炎癥細胞和細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病,在臨床治療上,藥物首先需要抑制炎癥細胞活化和介導產生抗炎因子,以減輕氣道炎癥反應,緩解哮喘癥狀。實驗中LKZP水提組能顯著降低氣道阻力,同時病理結果LKZP水提組中OVA誘導的哮喘小鼠肺部有大量黏液分泌,炎癥細胞大量浸潤,基底膜顯著增厚,氣管平滑肌明顯增厚,肺組織結構被破壞的情況具有改善作用。本研究發現,LKZP治療哮喘的排前10位關鍵靶點中,至少有8個靶點是參與介導了炎癥反應,包括MAPK、PI3K、AKT、PKC等,它們可能主要參與介導HIF-1信號通路、PI3K-AKT信號通路、ErbB信號通路等與炎癥反應密切相關的通路。在LKZP治療哮喘的潛在活性成分中,有6種倍半萜類成分(S15,S36,S8,S17,S4和S6),這些成分均來源于神香草,已有研究表明,神香草中的倍半萜類成分能夠抑制脂多糖誘導的RAW264.7細胞NO的釋放[19]。此外,黃酮類成分也能減輕氣道炎癥反應,如周旋等[30]利用OVA誘導建立哮喘大鼠模型發現柚皮素(Y36)能顯著性降低哮喘大鼠的氣道炎癥反應。

氣道重塑也是哮喘的重要病理機制之一,它與氣道炎癥在哮喘的發病機制中起同樣重要的作用。細胞內鈣離子(Intracellular Ca2+)可以調控氣道平滑肌的收縮,影響氣道平滑肌管徑大小和氣道阻力大小,對氣道重塑發揮重要作用[31]。有研究表明,血管內皮生長因子通過刺激內皮細胞釋放相應的因子導致平滑肌細胞增殖是氣道重塑的前提條件[32]。缺氧誘導因子-1(Hypoxia-inducible Factor-1,HIF-1)可調控血管內皮生長因子的表達,因此也被認為參與了哮喘的氣道重塑[32]。本研究發現,LKZP的化學成分可能可以通過同時調控鈣信號通路、VEGF信號通路和HIF-1信號通路等發揮調控氣道重塑的作用的。很多黃酮類成分都可以通過調節鈣離子水平,舒張血管平滑肌[33]。

此外,LKZP還可能通過作用于雌激素信號通路發揮治療哮喘的作用,目前發現女性哮喘患者的臨床癥狀更各生命階段(青春期、月經期、懷孕和更年期)有關,推測哮喘可能與雌激素密切相關[34]。而雌激素有可能是通過干預核因子κB/NLRP3信號通路減輕氣道炎癥,從而緩解哮喘癥狀的[35]。

本研究通過網絡藥理學的研究方法對維藥LKZP治療哮喘的潛在活性成分和作用機制進行預測,結果發現LKZP中的倍半萜類、黃酮類和苯丙素類成分可能是其治療哮喘的主要活性成分,它們主要通過調節氣道炎癥和氣道重塑發揮哮喘的治療作用。

利益沖突聲明:無。