左歸丸靶向C-X-C趨化因子受體4對人臍帶間充質干細胞體外遷移的影響

焦 存 楊麗曉 張 艷 王 哲 李亦晗 蘆現杰

(1 山東省聊城市人民醫院,聊城,252000; 2 山東大學附屬聊城人民醫院,聊城,252000; 3 山東中醫藥大學,濟南,250355)

卵巢早衰(Premature Ovarian Failure,POF)是指女性在40歲以前出現閉經、促性腺激素水平升高和雌激素水平降低,常伴有不同程度的圍絕經期癥狀。中醫辨證多與腎虛有關。左歸丸始于《景岳全書》,是中醫補腎的經典方劑,具有滋陰補腎、填精生髓的功效,近年來廣泛應用于卵巢早衰等生殖疾病的治療[1]。干細胞具有多向分化的特性,人臍帶間充質干細胞(Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells,hUC-MSCs)作為組織損傷修復與再生的理想種子細胞之一,在治療卵巢早衰方面亦得到大量研究[2-3]。左歸丸和hUC-MSCs相結合為卵巢早衰治療提供了新的思路。研究發現,干細胞歸巢率低等問題嚴重制約其治療效果,基質細胞衍生因子-1(Stromal Cell-derived Factor-1,SDF-1)/C-X-C趨化因子受體4(C-X-C Chomekine Receptor 4,CXCR4)信號通路在間充質干細胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)遷移和歸巢中發揮著關鍵作用[4-5]。左歸丸可能通過調控骨髓間充質干細胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)的體內遷移與歸巢從而增強其治療效果[6]。但是,關于左歸丸對hUC-MSCs體外遷移作用及與CXCR4表達關系的研究,國內外鮮見報道。因此,本研究擬探討左歸丸對hUC-MSCs體外遷移的影響及可能的分子機制,以期為左歸丸聯合hUC-MSCs治療卵巢早衰提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 hUC-MSCs,采用組織塊法分離培養健康產婦足月分娩胎兒的臍帶樣本,經聊城市人民醫院倫理委員會批準(倫理審批號:2019016)。培養液為DMEM/F12培養液(含10% FBS和1%雙抗),條件為37 ℃和5%CO2。

1.1.2 藥物 左歸丸(仲景宛西制藥股份有限公司,批號:181012)。

1.1.3 試劑與儀器 杜爾貝科改良伊格爾培養基/營養混合物F-12(Dulbecco′s modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12,DMEM/F12)(貨號:11330032)、青霉素-鏈霉素(貨號:15140122)、TrypLE酶(貨號:12605010),以上均購自美國Gibco公司;胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)(ScienCell公司,美國,貨號:0510);普樂沙福(AMD3100)(MCE公司,美國,貨號:HY-10046);CD34抗體(貨號:348057)、CD45抗體(貨號:555483)、CD73抗體(貨號:561014)、CD90抗體(貨號:555595),以上均購自美國BD公司;PrimeScriptTMRT Master Mix(Takara公司,日本,貨號:RR036A);SYBR Green Master Mix(Thermo Fisher公司,美國,貨號:4309155);結晶紫染色液(貨號:E607309)、一步法動物細胞活性蛋白提取試劑盒(貨號:C500022)、改良BCA法蛋白質濃度測定試劑盒(貨號:C503051)、ECL超敏化學發光試劑盒(貨號:D601039),以上均購自生工生物工程(上海)股份有限公司;CCK-8試劑盒(貨號:C0037)、SDF-1α(貨號:P6537)、QuickBlockTMWestern溶液套裝(貨號:P0239)、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)(貨號:A0216),以上均購自碧云天公司;β-actin抗體(貨號:sc-47778)、CXCR4抗體(貨號:sc-53534)、CXCR4-FITC抗體(貨號:sc-53534 FITC),以上均購自美國Santa Cruz公司。CO2培養箱(Thermo Fisher公司,美國,型號:371);超凈工作臺(蘇凈安泰公司,型號:SW-CJ-1FD);光學顯微鏡(Nikon公司,日本,型號:TS100-F);離心機(Eppendorf公司,德國,型號:5810);流式細胞儀(BD公司,美國,型號:FACS AriaIII);熒光定量PCR儀(ABI公司,美國,型號:7500);酶標儀(型號:iMark)、電轉電泳系統(型號:PowerPac)、凝膠成像分析系統(型號:ChemiDoc),以上均購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 hUC-MSCs分離培養 剔除臍帶動靜脈血管,分離出華通氏膠,機械剪切約3 mm組織塊,覆蓋無菌玻片,置于含10% FBS的DMEM/F12培養液中培養。每2～3天換液1次,待細胞融合度為80%～90%,用TrypLE酶消化5 min,加入完全培養液中止消化,201×g,離心5 min,去除上清液,按1∶3進行傳代,記為P1。此后每4～5天按1∶3比例傳代,進行擴增培養。

1.2.2 hUC-MSCs流式鑒定 取第3代對數期hUC-MSCs,制成單細胞懸液,調整細胞濃度為1×106/mL。取200 μL細胞懸液于樣本管,分別加入CD34、CD45、CD73和CD90熒光抗體各2 μL,充分混勻后常溫避光孵育30 min。杜氏磷酸鹽緩沖液(Dulbecco′s Phosphate-buffered Saline,DPBS)洗滌2次,201×g,離心5 min,棄上清液,加入500 μL DPBS混勻,細胞篩過濾后用流式細胞儀進行分析。

1.2.3 CCK-8檢測 取第3～5代對數期hUC-MSCs,按2×103/孔細胞量接種到96孔板,24 h后加入不同培養液各200 μL,分為空白組(不加細胞)、對照組和左歸丸組(濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.0 mg/mL),培養48 h后棄上清液,每孔加入無血清培養液90 μL和CCK-8 10 μL,繼續培養2 h。用酶標儀測定波長450 nm的吸光度值。每組均設5個復孔。

1.2.4 細胞劃痕實驗 取第3～5代對數期hUC-MSCs,按2×105/孔細胞量接種于6孔板,48 h后用1 mL槍頭劃痕,DPBS洗滌3次,分別加入不同的無血清培養液,分為對照組、左歸丸0.1 mg/mL組、左歸丸0.2 mg/mL組和左歸丸+普樂沙福組(左歸丸0.2 mg/mL+普樂沙福10 μmol/L),繼續培養24 h后觀察細胞遷移情況。利用Image J軟件分別計算0 h和24 h的劃痕面積,采用劃痕愈合面積百分比比較各組細胞的遷移能力。

1.2.5 Transwell實驗 用無血清培養液調整hUC-MSCs密度為1×105/mL,加100 μL到24孔Transwell上室(孔徑8.0 μm),下室為500 μL含100 ng/mL SDF-1α的正常培養液,分為對照組、左歸丸0.1 mg/mL組、左歸丸0.2 mg/mL組和左歸丸+普樂沙福組(左歸丸0.2 mg/mL+普樂沙福10 μmol/L),培養1天后取出小室,用棉簽輕輕擦去膜上層細胞,DPBS洗滌3次,4% PFA固定15 min,結晶紫染色10 min。

1.2.6 實時聚合酶鏈反應(Real-time PCR) TRIzol提取細胞RNA,利用PrimeScriptTMRT Master Mix逆轉錄為cDNA。β-actin(Forward:CATGTACGTTGCTATCCAGGC,Reverse:CTCCTTAATGTCACGCACGAT)和CXCR4(Forward:GGGCAATGGATTGGTCATCCT,Reverse:TGCAGCCTGTACTTGTCC)引物,均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反應體系為10 μL SYBR Green Master Mix(2×)、1 μL cDNA、8 μL RNase-free dd H2O及正反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL。反應條件為95 ℃ 10 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,40個循環。以β-actin作為內參,采用公式2-△△Ct計算CXCR4基因的相對表達量。

1.2.7 蛋白質印跡法 裂解液提取細胞總蛋白,BCA法測定蛋白濃度。取10 μg蛋白上樣,在SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳膠上電泳(濃縮膠5%:80 V,30 min;分離膠10%:120 V,60 min),250 mA轉聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenefluoride,PVDF)膜1 h。常溫封閉30 min,加入CXCR4抗體(1∶100)和β-actin抗體(1∶1 000),常溫孵育2 h,洗膜后加HRP標記的二抗(1∶1 000),常溫孵育1 h,ECL顯影。利用Image J軟件進行灰度分析。

1.2.8 CXCR4表達流式分析 取各組hUC-MSCs,制成單細胞懸液(濃度為1×106/mL)。取500 μL細胞懸液于樣本管,加入CXCR4-FITC抗體5 μL,充分混勻后常溫孵育1 h。DPBS洗滌2次,201×g,離心5 min,棄上清液。加入500 μLDPBS混勻,細胞篩過濾后上機檢測。

2 結果

2.1 hUC-MSCs的分離培養與流式鑒定 分離的hUC-MSCs形態多為梭形(圖1A),增殖力強,傳代后4～5天即可長滿。利用流式細胞儀分析第3代hUC-MSCs表面標志物,發現hUC-MSCs高表達CD73(87.3%)和CD90(99.4%),極低表達CD34(0.3%)和CD45(0.2%)。見圖1B。分離培養的細胞符合hUC-MSCs的特征。

2.2 左歸丸對hUC-MSCs增殖的影響 應用不同濃度左歸丸處理hUC-MSCs 48 h后,CCK-8檢測發現,與對照組比較,0.1、0.2 mg/mL左歸丸能明顯促進hUC-MSCs增殖(P<0.05),0.5 mg/mL左歸丸對細胞增殖無明顯影響,而1.0 mg/mL左歸丸則明顯抑制hUC-MSCs增殖(P<0.05),其中0.2 mg/mL為最佳濃度(圖2A)。合適濃度的左歸丸對hUC-MSCs增殖有明顯促進作用。

圖2 左歸丸對hUC-MSCs增殖和體外遷移的影響

2.3 左歸丸對hUC-MSCs體外遷移的影響 細胞劃痕實驗結果顯示:左歸丸0.1、0.2 mg/mL組細胞劃痕愈合速度顯著快于對照組,最佳作用濃度為0.2 mg/mL(P<0.05);加入普樂沙福(CXCR4拮抗劑)后,與左歸丸0.2 mg/mL組比較,細胞劃痕愈合速度則顯著下降(P<0.05)。見圖2B和2C。Transwell實驗結果顯示:左歸丸0.1、0.2 mg/mL組遷移細胞數量明顯多于對照組,最佳作用濃度為0.2 mg/mL(P<0.05);加入普樂沙福后,與左歸丸0.2 mg/mL組比較,遷移細胞數量則明顯下降(P<0.05)。見圖2D和2E。合適濃度的左歸丸對hUC-MSCs體外遷移有明顯促進作用,最佳作用濃度為0.2 mg/mL,應用CXCR4拮抗劑則能抑制左歸丸誘導的hUC-MSCs促遷移作用。

2.4 左歸丸對hUC-MSCs中CXCR4表達的影響 實時PCR分析發現,左歸丸0.2 mg/mL組CXCR4 mRNA表達水平明顯高于對照組(P<0.05);與對照組比較,普樂沙福組CXCR4 mRNA表達水平明顯下降(P<0.05);與左歸丸0.2 mg/mL組比較,左歸丸+普樂沙福組CXCR4 mRNA表達水平明顯下降(P<0.05)。見圖3A。蛋白質免疫印跡法結果顯示,與對照組比較,左歸丸0.2 mg/mL組CXCR4蛋白表達水平顯著高于對照組(P<0.05),普樂沙福組CXCR4蛋白表達水平顯著下降(P<0.05);與左歸丸0.2 mg/mL組比較,左歸丸+普樂沙福組CXCR4蛋白表達水平明顯下降(P<0.05)。見圖3B和3C。流式細胞術分析發現,與對照組比較,左歸丸0.2 mg/mL組CXCR4陽性率顯著升高(P<0.05),普樂沙福組CXCR4陽性率顯著下降(P<0.05);左歸丸+普樂沙福組CXCR4陽性率顯著高于普樂沙福組(P<0.05),左歸丸0.2 mg/mL組CXCR4陽性率顯著高于左歸丸+普樂沙福組(P<0.05)。見圖3D和表1。左歸丸能上調hUC-MSCs中CXCR4 mRNA和蛋白表達水平,并促進CXCR4蛋白在細胞膜的表達,左歸丸通過上調CXCR4表達促進hUC-MSCs體外遷移。

表1 各組CXCR4表達

圖3 左歸丸對hUC-MSCs中CXCR4表達的影響

3 討論

卵巢早衰發病呈上升和年輕化趨勢,嚴重損害育齡女性的生殖健康。目前西醫主要采用激素替代療法治療卵巢早衰,雖然能改善患者臨床癥狀,但是其長期療效欠佳,且有一定不良反應[1]。腎藏精,主生殖。左歸丸由熟地黃、菟絲子、牛膝、龜甲膠、鹿角膠、山藥、山茱萸和枸杞子組成,其補腎填精的功效能夠顯著改善卵巢功能[7]。崔曉萍教授遵循月經陰陽周期規律,取左歸丸“純補無瀉,陽中求陰”之義,辨證運用左歸丸加減治療卵巢早衰,幫助患者重建正常的月經周期,臨床療效顯著[8]。臨床研究發現,左歸丸聯合地屈孕酮通過調節“腎-天癸-沖任-胞宮”的平衡功能,促進卵巢早衰患者卵巢功能恢復,并改善圍絕經期癥狀,有效降低不良反應發生率[9]。干細胞具有自我更新和多向分化的潛能,是“先天之精”在細胞層次的存在形式[10]。hUC-MSCs具有取材方便、增殖能力強、免疫原性低和無倫理學爭議等特點,能夠分化為成骨細胞、軟骨細胞、生殖細胞及神經細胞等不同類型細胞,且具有旁分泌及免疫調節作用[2-3]。2018年,世界首例hUC-MSCs治療卵巢早衰臨床研究在南京鼓樓醫院獲得成功,為hUC-MSCs移植治療卵巢早衰打下堅實的基礎。近年來,中國科學院聯合北京婦產醫院、廣州醫科大學附屬第三醫院合作開展hUC-MSCs干預卵巢早衰的多中心臨床試驗,結果顯示hUC-MSCs移植能夠改善患者卵巢內血流,恢復卵巢功能,促進卵泡活動[11]。左歸丸“腎主生殖”理論與干細胞“先天之精”屬性是相通的,中西醫結合療法將左歸丸和hUC-MSCs相結合,即補腎填精和再生修復相結合,有望為治療卵巢早衰提供新的方案。

干細胞定向遷移歸巢至損傷組織是其發揮治療作用的前提,SDF-1/CXCR4的相互作用在MSCs遷移、歸巢至損傷組織及組織再生修復過程中具有關鍵作用,提高MSCs中CXCR4表達能夠促進其歸巢至損傷組織。研究發現,損傷組織中SDF-1表達升高,能夠募集參與血液循環的CXCR4陽性細胞的定向遷移與歸巢[4,12]。LUO等[13]發現卵巢早衰小鼠卵巢組織中SDF-1表達水平顯著升高,SDF-1/CXCR4通路激活及細胞凋亡同卵巢損傷的發展密切相關。但是經過體外擴增培養的MSCs表面CXCR4表達率很低,限制其在體內的定向遷移[14]。雖然基因修飾和酶修飾能提高MSCs中CXCR4表達,但是存在影響細胞功能和活力的問題。利用低氧、化合物和細胞因子等預處理MSCs增強其CXCR4表達,正在成為促進MSCs定向遷移與歸巢的重要手段[15-16]。ZHENG等[17]研究發現,雷帕霉素通過上調hUC-MSCs的CXCR4表達促進其體外遷移和體內歸巢至損傷部位,從而改善hUC-MSCs移植的治療效果。

現代藥理學探討了左歸丸及其組分對BMSCs的增殖和遷移的影響及可能的機制。張晨[18]研究發現左歸丸水煎液能促進BMSCs體外衰老模型的增殖能力,其機制可能與p21和干細胞因子表達有關。李杰斌[10]發現,左歸丸能夠促進BMSCs的體內定向歸巢,可能機制為促進BMSCs分泌SCF。牛膝提取物杯莧甾酮可能通過上調CXCR4表達促進大鼠BMSCs的體外遷移[19];龜甲水提物能激活SDF-1/CXCR4軸促進BMSCs遷移[20]。這些研究結果證實,左歸丸及其組分能夠促進BMSCs增殖和遷移。但是,左歸丸對hUC-MSCs體外遷移的影響及作用機制仍不清楚。

本研究利用組織塊法對hUC-MSCs進行分離培養,流式細胞術分析其表面標志物(CD34、CD45、CD73和CD90)表達情況,說明分離培養的細胞符合hUC-MSCs的特征。CCK-8實驗結果提示,左歸丸具有類生長因子作用,能促進hUC-MSCs增殖。細胞劃痕和Transwell實驗結果提示,合適濃度的左歸丸對hUC-MSCs體外遷移有明顯促進作用,其具體機制可能與CXCR4表達有關。實時PCR、蛋白印跡法和流式細胞術分析發現,左歸丸能上調hUC-MSCs中CXCR4 mRNA和蛋白表達水平,并促進CXCR4蛋白在細胞膜表達,證實左歸丸通過上調CXCR4表達促進hUC-MSCs體外遷移。上述研究結果提示,左歸丸干預將有利于hUC-MSCs定向遷移至組織損傷區域。

綜上所述,左歸丸能促進hUC-MSCs體外增殖和遷移;左歸丸促進hUC-MSCs遷移的機制可能與上調CXCR4表達、激活SDF-1/CXCR4信號通路有關,但其作用機制有待進一步研究。本研究結果提示,左歸丸干預不僅能夠增強hUC-MSCs增殖活力,還可以促進hUC-MSCs定向遷移與歸巢,從而改善細胞移植治療效果,為左歸丸聯合hUC-MSCs治療卵巢早衰提供理論和實驗依據。

致謝:感謝聊城市人民醫院韓發彬和谷萬里主任的指導,感謝干細胞與再生醫學重點實驗室和中原生物醫學研究院提供的實驗平臺。

利益沖突聲明:無。