荊防顆粒對脂多糖致小鼠急性肺損傷的預防和保護作用

趙玉升 張 盈 程國良 姚景春 曹天佑 吳 同 孔 慧 屈會化 趙 琰 張貴民

(1 北京中醫藥大學中醫學院,北京,100029; 2 魯南制藥集團股份有限公司/中藥制藥共性技術國家重點實驗室,臨沂,276000; 3 北京中醫藥大學中藥學院,北京,100029; 4 北京中醫藥大學中醫藥研究院,北京,100029)

急性肺損傷(Acute Lung Injury,ALI)是急性呼吸窘迫綜合征的早期階段,其特點是由于促炎途徑和氧化途徑的激活而引起迅速而強烈的炎癥反應,導致肺組織中性粒細胞積聚,間質水腫,肺泡上皮損傷,隨后肺細胞外基質重塑,在臨床上表現為呼吸障礙和頑固性低氧血癥,可進一步發展為嚴重的呼吸障礙[1-2]。盡管在治療策略和對相關呼吸生理的認識方面取得了重大進展,ALI患者的死亡率仍高達40%[3]。研究表明,革蘭氏陰性菌感染是引起ALI的重要原因之一,革蘭氏陰性菌外膜的主要成分脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)可引起肺損傷和一系列炎癥反應[4-5]。目前為止,臨床上尚未有有效的治療方法來提高該病的存活率,世界各地的患者只能接受支持性治療,現有治療ALI的藥物多為皮質類固醇藥物,但這些藥物往往會產生嚴重的不良反應。因此,迫切需要安全有效的防治藥物。

荊防顆粒源于古代抗疫名方荊防敗毒散,由提取物浸膏和大量輔料組成,是采用現代制藥工藝加工而成的中成藥制劑。荊防敗毒散出自明代的《攝生眾妙方》,主要由荊芥、防風、柴胡、川芎、羌活、獨活、前胡、茯苓、桔梗、枳殼、甘草共11味中藥組成,具有解表散寒、宣肺祛濕的功效,是治療病毒性呼吸道感染疾病的經典名方[6]。該方以荊芥、防風為君藥,祛風解表;羌活、獨活祛濕止痛,柴胡和解表里,川芎祛風止痛,為臣藥;佐藥桔梗開提肺氣,枳殼降氣行痰,一升一降,寬胸利氣,配前胡以疏風化痰,升降清濁,茯苓滲濕利水,使補而不滯;甘草調和諸藥為使藥。諸藥合用,具有發汗解表、散風祛濕、宣利肺氣之功效。

荊防顆粒已在臨床上用于治療病毒性呼吸道感染疾病和人支原體肺炎,且療效確切,患者臨床癥狀改善明顯[7-8]。自2020年已被國內新疆、云南、四川等地的《新冠病毒感染的中醫藥防治方案》中指定為新冠肺炎預防推薦用藥,用以治療新冠病毒感染輕癥[9-10]。本研究擬從實驗角度探討荊防顆粒對LPS所致ALI模型小鼠的治療作用,從炎癥和氧化應激水平來研究其治療ALI的作用機制,為其進一步的臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級C57BL/6雄性小鼠50只,體質量18～22 g,由北京斯貝福生物技術有限公司提供,生產合格證號為SYXK(京)2020-0033。實驗期間動物均飼養于同一環境下,保持室溫(24.0±1.0)℃,相對濕度55%～65%,12 h明暗交替,通風良好,飼養期間內自由進水、進食,適應性喂養3 d后進行實驗,取材前12 h小鼠禁食不禁水。本實驗相關動物實驗遵循北京中醫藥大學有關實驗動物管理和使用的規定,并通過倫理委員會批準(倫理批準號:BUCM-4-2021-092202-3084)。

1.1.2 藥物 荊防顆粒(魯南制藥集團股份有限公司,批號:80022202002);LPS(Sigma公司,德國,批號:L2880)。

1.1.3 試劑與儀器 單核細胞趨化蛋白-1(Monocyte Chemotactic Protein 1,MCP-1)試劑盒(武漢云克隆科技股份有限公司,批號:SEA087Mu);白細胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)ELISA試劑盒(武漢云克隆科技股份有限公司,批號:SEA079Mu);白細胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)ELISA試劑盒(武漢云克隆科技股份有限公司,批號:SEA563Mu);腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-alpha,TNF-α)ELISA試劑盒(武漢云克隆科技股份有限公司,批號:SEA133Mu);考馬斯亮藍蛋白定量試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號:A045-2-2);髓過氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號:A044-1-1);誘導型一氧化氮合酶(Inducible Nitric Oxide Synthase,iNOS)試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號:A014-1-2);丙二醛(Malondialdehyde,MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號:A003-1-2);超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號:A001-3-2);谷胱甘肽(Glutathione,GSH)試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號:A006-2-1)。電子分析天平(賽多利斯,德國,型號:BS124-S);電熱恒溫培養箱(上海森信實驗儀器有限公司,型號:DRP-9082);酶標儀(美國伯騰儀器有限公司,美國,型號:EL 800);超速冷凍離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司,型號:HC-2518R);石蠟包埋機(沈陽譽德電子儀器有限公司,型號:SYD-B-F);石蠟切片機(徠卡,美國,型號:Leica RM2016);倒置熒光顯微鏡(尼康,日本,型號:Nikon Eclipse Ti-SR)。

1.2 方法

1.2.1 分組和模型制備 將50只C57BL/6J小鼠隨機分為5組,每組10只,分別為對照組、模型組、荊防顆粒低劑量組(1.25 g/kg)、荊防顆粒中劑量組(2.5 g/kg)、荊防顆粒高劑量組(5 g/kg)。動物適應飼養環境后,各荊防顆粒給藥組按照相應濃度連續灌胃給藥6 d,對照組和模型組均以灌胃的方式給予同體積的生理鹽水,連續6 d。在第6天時,稱重,給藥1 h后,模型組和各荊防顆粒給藥組進行LPS氣管滴注(5 mg/kg),制備出ALI模型,對照組小鼠氣管滴入相同體積生理鹽水。

1.2.2 給藥方法 荊防顆粒制備:荊芥、防風、羌活、獨活、柴胡、前胡、枳殼、茯苓、桔梗、川芎各4.5 g,炙甘草1.5 g,制備成浸膏,1 g浸膏相當于原藥材1.082 34 g,配置荊防顆粒低、中、高劑量組(1.25 g/kg、2.5 g/kg和5 g/kg,分別相當于臨床劑量的0.156 25、0.312 5和0.625倍),放入冰箱保存,使用時混合均勻即可。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 一般情況觀察 觀察各組小鼠造模前后的一般情況,包括精神、呼吸、膚色、毛發、排泄物和對外界刺激的反應,并記錄各組造模前后小鼠的體質量、死亡數量。

1.2.3.2 肺組織形態學觀察 造模12 h后,對小鼠進行麻醉,脫頸椎處死,剪開胸廓,暴露并小心取出全肺,避免取出過程中對肺組織造成損傷。之后使用生理鹽水來反復輕柔沖洗肺組織上殘留血液,用濾紙輕輕擦拭多余水分后進行拍照、稱重。

1.2.3.3 病理學分析 將小鼠左肺放入4%多聚甲醛溶液中進行固定,經不同濃度的乙醇梯度洗脫后,經常規石蠟包埋,切片厚6 μm,進行蘇木精-伊紅(Hematoxylin and Eosin,HE)染色,中性樹膠封片,于光學顯微鏡下觀察肺組織病理學變化,并進行病理學評分。評分標準參考相關研究,在雙盲狀態下觀察肺水腫、肺泡及間質炎癥細胞浸潤、間質出血形成3個檢查項目,主觀定量評分分別為0～4分,標本無病變為0分,全視野為4分,病理評分為上述各項指標之和。

1.2.3.4 肺組織中炎癥介質指標檢測 將肺組織置于4 mL離心管中,按重量(g):體積(mL)加入9倍體積生理鹽水勻漿,3 500 r/min,離心10 min,取上清為待測樣品。采用ELISA法檢測MCP-1、TNF-α、IL-1β和IL-6的水平,所有操作步驟嚴格根據試劑盒的說明書進行。

1.2.3.5 肺組織中氧化應激指標檢測 取上述凍存后的剩余肺組織,室溫解凍后,在冰水浴中研磨制成10%的肺組織勻漿液,3 500 r/min,離心10 min,離心半徑15 cm,離心后取上清液,按照試劑盒說明書進行操作,分別檢測肺組織中MPO、MDA、iNOS、SOD和GSH的含量。

2 結果

2.1 荊防顆粒對ALI小鼠一般情況的影響 造模前各組小鼠精神狀態良好,呼吸穩定,活動正常,對外界刺激敏感,無震顫、俯臥等異常行為,排泄正常。造模12 h后,與對照組比較,模型小鼠精神狀態較差,幾乎無活動,平躺且毛發凌亂、暗淡無光澤,排泄物變稀。在給藥6 d以及造模12 h后,小鼠體質量前后變化不大,且造模后均未出現小鼠死亡情況。

2.2 荊防顆粒對ALI小鼠肺組織宏觀形貌的影響 ALI的主要病理特征為肺組織中性粒細胞積聚,間質水腫,肺泡上皮損傷。與對照組比較,氣管滴注LPS的小鼠肺部出現廣泛的厚層暗紅色出血,提示肺部有嚴重的出血以及炎癥反應,處于強烈受損狀態。見圖1A～1B。在經過預給藥后,荊防顆粒各給藥組肺部受損狀態均得到不同程度的恢復,肺部出血面積減少。與模型組比較,荊防顆粒低劑量組的肺部顏色較模型組更紅潤光滑,但仍有一部分出血點,治療效果最差;荊防顆粒中劑量組肺部出血面積情況得到一定程度好轉,治療效果居中;荊防顆粒高劑量組肺部呈現紅潤,僅可隱約見到小部分出血點,治療效果最好。見圖1C～1E。從宏觀形態上可以看出,荊防顆粒可以一定程度上逆轉LPS所致ALI,具有一定的預防治療效果。

圖1 荊防顆粒改善LPS誘導ALI小鼠肺組織的宏觀圖像

2.3 荊防顆粒對ALI小鼠肺組織病理變化的影響 觀察對照組肺組織中肺泡結構正常,肺泡腔室清晰可見,肺泡壁細長且結構清晰,未見到明顯的紅細胞和炎癥細胞浸潤。見圖2A。與對照組比較,模型組小鼠肺組織中的肺泡上皮細胞和肺毛細血管內皮細胞損傷,肺泡壁毛細血管擴張充血,炎癥細胞和紅細胞穿透肺泡腔和肺間質,肺泡形狀發生改變,肺泡壁和間隔明顯增厚,肺組織受損明顯,這提示LPS造模成功。見圖2B。與模型組比較,荊防顆粒各劑量給藥組受損肺組織在經過預給藥治療后均能夠得到不同程度的恢復。其中,荊防顆粒高劑量組小鼠肺組織病變明顯改善,紅細胞以及炎癥細胞數量程度得到減輕,肺組織形態結構趨于正常;荊防顆粒中劑量、低劑量組小鼠肺組織的肺泡腔和肺間質炎癥細胞和紅細胞的浸潤程度減輕,但仍可見部分出血點。見圖2C～2E。

圖2 荊防顆粒對LPS誘導ALI小鼠肺組織病理學影響(HE染色,×100和×200)

從病理評分結果可以看出,與對照組比較,模型組小鼠肺組織病理評分顯著升高,提示肺組織受損情況嚴重,差異有統計學意義(P<0.01);與模型組比較,在經過荊防顆粒預給藥治療后,各給藥組小鼠肺組織的病理評分均顯著下降,差異有統計學意義(P<0.01),以荊防顆粒高劑量組的治療效果最優。見表1。以上結果表明,荊防顆粒對LPS所致ALI具有一定的治療效果,且呈現一定的劑量依賴性。

表1 荊防顆粒對ALI小鼠肺組織病理變化的影響

2.4 荊防顆粒對ALI小鼠肺組織中MCP-1含量的影響 與對照組比較,模型組小鼠肺組織中的MCP-1含量顯著升高,差異有統計學意義(P<0.01),表明單核細胞被LPS激活,并從外周血液循環進入肺組織,從而導致肺內單核細胞數量激增;與模型組比較,荊防顆粒低、中、高劑量組就能有效抑制ALI小鼠肺組織中MCP-1的異常表達,差異有統計學意義(P<0.01),其中以高劑量組的治療效果最優。見表2。

表2 荊防顆粒對ALI小鼠肺組織中MCP-1含量的影響

2.5 荊防顆粒對ALI小鼠肺組織中TNF-α、IL-1β和IL-6含量的影響 與對照組比較,模型組小鼠肺組織中TNF-α的含量明顯升高,差異有統計學意義(P<0.01);與模型組比較,經過預給藥治療后的荊防顆粒低、中、高劑量均能不同程度降低TNF-α的水平,差異有統計學意義(P<0.01),其中,以中、高劑量組的治療效果較優。荊防顆粒對ALI小鼠肺組織中IL-1β的水平的影響與TNF-α類似。與對照組比較,模型組小鼠肺組織中IL-1β含量顯著增加,差異有統計學意義(P<0.01);與模型組比較,荊防顆粒中、高劑量組均能明顯降低肺組織中IL-1β的水平,差異有統計學意義(P<0.01),荊防顆粒低劑量組也具有一定的治療效果,差異有統計學意義(P<0.01)。與對照組比較,模型組小鼠肺組織中IL-6含量顯著增加,差異有統計學意義(P<0.01);與模型組比較,荊防顆粒高劑量組能顯著降低IL-6的水平,差異有統計學意義(P<0.01),荊防顆粒中、低劑量組對IL-6的異常升高也具有一定的抑制作用,但以高劑量組的效果最優。見表3。

表3 荊防顆粒對ALI小鼠肺組織中TNF-α、IL-1β和IL-6含量的影響

2.6 荊防顆粒對ALI小鼠肺組織中MPO、iNOS和MDA含量的影響 與對照組比較,模型組中的MPO含量顯著升高,差異有統計學意義(P<0.01);與模型組比較,荊防顆粒低、中、高劑量組均能顯著降低肺組織中MPO的含量,差異有統計學意義(P<0.01),其中以荊防顆粒高劑量組的治療效果最為顯著。與對照組比較,模型組小鼠的iNOS水平顯著升高,差異有統計學意義(P<0.01);與模型組比較,荊防顆粒高、中劑量組能明顯降低iNOS含量,差異有統計學意義(P<0.01),荊防顆粒低劑量組也表現出一定的抑制效果,差異有統計學意義(P<0.01)。與對照組比較,模型組小鼠的MDA水平顯著升高,差異有統計學意義(P<0.01)與模型組比較,荊防顆粒高、中、低劑量組均能在一定程度上降低MDA的含量,差異有統計學意義(P<0.01,P<0.05)。見表4。

表4 荊防顆粒對ALI小鼠肺組織中MPO、iNOS和MDA含量的影響

2.7 荊防顆粒對ALI小鼠肺組織中抗氧化酶SOD和GSH含量的影響 與對照組比較,模型組中的SOD和GSH水平明顯降低,差異有統計學意義(P<0.01),反映出LPS所致ALI小鼠肺組織的氧化應激水平較為嚴重;與模型組比較,荊防顆粒高、中劑量組能明顯升高肺組織中的SOD和GSH含量,差異有統計學意義(P<0.01),提高了機體的抗氧化能力,荊防顆粒低劑量組也能增加肺組織中的SOD和GSH水平,差異有統計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 荊防顆粒對ALI小鼠肺組織中SOD和GSH含量的影響

3 討論

荊防顆粒化學成分種類豐富,含有黃酮以及黃酮苷、香豆素類、木脂素類、萜類、醛類、酯類、芳香醚類、有機酸類、糖苷類等化合物,梁紅寶等[10]利用GC-MS技術和UPLC-Q Exactive MS技術對荊防顆粒中的醇溶性有機成分以揮發性成分進行定性分析,共分離鑒定出109個化合物,并對其進行藥材歸屬,這為荊防顆粒的藥效物質基礎研究及質量標準制定提供了可靠的實驗依據。同時,化合物的有效性和安全性是其成藥性的關鍵,團隊前期對荊防顆粒的毒性作用開展了深入研究,結果表明荊防顆粒在10 g/(kg·d)劑量下不會引起動物一般體征、體質量、攝食量、血液生化學、組織病理學、性發育和性激素水平、生長發育等指標的異常改變,且對大鼠圍產期發育、大鼠胚胎-胎仔發育無毒性反應,這為其進一步的藥理研究以及臨床應用提供了劑量依據[11-15]。

荊防顆粒的處方來源于明代《攝生眾妙方》一書中所載的荊防敗毒散,荊防敗毒散在治瘟疫功效顯著,為古代治疫第一方,而荊防顆粒在現代多用于治療流行性及傳染性疾病。現代研究表明,荊防顆粒具有廣泛的藥理作用,如調節轉化生長因子-β(Transforming Growth Factor-β,TGF-β)/Sma和Mad相關蛋白(Smad)4信號通路來抑制四氯化碳所致小鼠肝纖維化;激活磷脂酰肌醇-3激酶(Phosphatidylinositol 3-Kinase,Pi3K)/蛋白激酶B(Protein Kinase B,AKT)信號通路來發揮解酒保肝作用;抑制細胞外信號調節激酶(Extracellular Signal-regulated Kinase,ERK1/2)、p38絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen Activated Protein Kinases,MAPK)信號通路來減輕角叉菜膠所致小鼠尾部血栓;抑制Ⅰ型變態反應抗體IgE的生成和組胺的釋放,有效控制大鼠蕁麻疹[16-19]。此外,荊防顆粒的臨床療效也得到了初步評價,如荊防顆粒治療風寒證感冒方面療效顯著,能降低患者血清中TNF-α、IL-1、IL-6水平,有效縮短病程,改善臨床癥狀與體征;荊防顆粒聯合阿奇霉素治療成人支原體肺炎患者療效確切,能有效減少患者體溫恢復時間、咳嗽消失時間以及肺部啰音消失時間;荊防顆粒內服治療扁平疣也具有較好的臨床療效[8,20-22]。可見,荊防顆粒藥效明確,尤其治療肺部感染疾病療效甚佳。

ALI是由感染、有害物質吸入、創傷、休克等多種非心源性致病因素作用下導致的一種臨床常見危重癥之一,其實質是過度的炎癥反應將引起肺泡毛細血管膜損傷,血管通透性增強,導致含蛋白質的液體流入肺間質和肺泡腔,造成非心源性肺水腫[23]。目前,對于ALI造模方法包括LPS誘導[24]、石墨粉誘導[25]、高氧誘導[26]、流感病毒誘導[27]等。其中,LPS所致ALI模型是用來評價藥物療效的經典模型,其病理機制是LPS能引發中性粒細胞在肺內的聚集和激活,進一步釋放氧自由基、彈性蛋白酶等誘導免疫細胞釋放炎癥介質,而炎癥介質能夠促進中性粒細胞的大量滲出及黏附,從而引起級聯性炎癥反應,最終引起肺損傷[28]。本實驗結果表明,無論從宏觀圖像還是病理切片上來看,經過不同劑量的荊防顆粒預給藥治療后均可以明顯抑制LPS所引起的肺部水腫、炎癥細胞浸潤以及出血癥狀,肺組織破壞程度得到有效改善,這表明荊防顆粒在預防和治療LPS所引起的肺損傷具有良好的療效。

急性炎癥反應在ALI中起著關鍵作用,可直接或間接導致肺泡上皮和微血管內皮的損傷,是LPS所致ALI發病的主要來源。MCP-1是單核細胞和嗜堿性粒細胞的趨化因子,參與炎癥反應以及免疫調節過程,在以單核細胞浸潤為特征的疾病發病機制中發揮關鍵作用[29]。近年來研究表明,MCP-1在人類多種肺部疾病中,如膿毒癥、新冠肺炎等疾病中的表達水平會出現異常上升[30-31]。本研究結果表明,荊防顆粒高、中、低劑量組均可有效抑制LPS所致肺部MCP-1含量的異常升高,減少肺部炎癥細胞的浸潤。TNF-α是LPS所致肺損傷過程中最早由單核-巨噬細胞釋放的細胞因子,不僅可以破壞內皮細胞,還能刺激其他炎癥介質的釋放[32]。IL-1β和IL-6是機體重要的炎癥介質,可誘導中性粒細胞在肺部聚集,從而加重炎癥反應[33]。同時,中性粒細胞的聚集是肺部炎癥的關鍵環節,作為中性粒細胞的功能和驅動標志,MPO是衡量中性粒細胞浸潤組織的有效指標[34]。LPS作用于機體后,能夠引起IL-1β、IL-6和MPO的異常升高,是評價ALI嚴重程度的特征指標。本實驗檢測結果表明,荊防顆粒高、中、低劑量組均能不同程度降低模型小鼠肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-6和MPO的含量,且以高劑量的治療效果最優,這表明荊防顆粒可有效抑制LPS所引起的肺部急性炎癥反應,且呈現出一定的劑量依賴性。

氧化應激是指活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的持續生成使有機抗氧化防御系統的能力超負荷,導致DNA、蛋白質和脂質損傷,是ALI發生的重要機制之一[35]。LPS作用于機體后能夠增加ROS的產生,導致體內氧自由基生成與抗氧化電位的不平衡,進而誘導炎癥細胞聚集,加重肺部損傷[36]。iNOS是存在于機體的重要炎癥介質,在氧化應激損傷時表達增加,可產生大量一氧化氮,進而誘導組織損傷[37]。MDA是氧自由基作用于脂類的氧化產物,其含量隨著脂類膜結構和功能的破壞而增加,而SOD和GSH是人體內重要的抗氧化酶,在過度的氧化應激水平下可減少自由基的產生,提高機體的抗氧化能力[38]。從實驗結果來看,荊防顆粒高、中、低劑量組一方面能夠降低模型小鼠肺組織中的MDA含量,同時還能提高SOD和GSH等抗氧化酶的活性水平,這表明荊防顆粒能有效LPS所誘導的氧化損傷,提高機體的抗氧化和清除自由基的能力。

綜上所述,荊防顆粒對LPS致小鼠肺損傷具有一定的預防和保護作用,能有效改善肺組織形態及病理學變化,其作用機制一方面可能是抑制炎癥細胞的分泌,從而發揮抗炎作用;另一方面可能與降低氧化應激水平、提高機體的抗氧化能力有關。以上實驗結果為荊防顆粒臨床應用提供了實驗依據。同時,荊防顆粒藥效緩和,臨床適用人群范圍廣,更有利于在臨床上推廣應用。

利益沖突聲明:無。