至寶三鞭丸對腺嘌呤誘導的腎陽虛證大鼠模型的改善作用研究

王官連 劉佳霖 張詠梅 鮑 磊 劉傳文 冉慶森 李 琦 杜茂波

(1 中國中醫科學院中藥研究所,北京,100700; 2 煙臺中亞保健酒有限公司,煙臺,264000)

腎陽虛證是一種中醫診斷病證,主要病因是腎陽虛衰、溫煦失職、氣化失權所表現的一類虛寒證候,是一種由神經內分泌紊亂引起的代謝性疾病。男性腎陽虛證患者的主要臨床表現為育齡不育、性欲降低或性冷淡、精液少、精子活性低、腰痛、夜尿多。嚴重者甚至可能導致生精功能障礙,導致不育和出生缺陷[1-3]。

至寶三鞭丸處方由海狗鞭、狗鞭、鹿鞭、人參、鹿茸、海馬、蛤蚧、肉蓯蓉、枸杞子、杜仲等40多味名貴中藥材組成,多年的臨床研究表明該方具有明顯的延緩衰老、抗疲勞作用,是一種強力的補腎藥。作用顯著,療效確切,臨床上廣泛用于治療男性不育,少精,弱精,性功能低下等腎陽虛所致男性性功能障礙[4-6]。但是,目前關于至寶三鞭丸如何實現補腎壯陽功效的作用機制尚不清楚。

通過構建腺嘌呤所致腎陽虛證大鼠模型,研究至寶三鞭丸對腎陽虛大鼠的改善作用,并初步圍繞下丘腦-垂體-性腺軸(Hypothalamic-Pituitary-Gonadal Axis,HPGA)為立足點,對“神經”“內分泌”“生殖”3個節點分別開展至寶三鞭丸相關的藥效評價研究。為至寶三鞭丸誘發生殖功能變化的潛在機制和器官互作模式做了初步的探索,以期對至寶三鞭丸補腎壯陽功效的功效原理和科學內涵進行闡釋。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取6周齡無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)SD大鼠98只,雄性,體質量(220±10)g,購自北京維通利華實驗動物有限公司,動物許可證號:SCXK(京)2016-0006。飼養于中國中醫科學院中藥研究所藥物非臨床研究質量管理規范(Good Laboratory Practice,GLP)中心。飼養溫度20～25 ℃,濕度65%～70%,自由飲水進食。實驗通過中國中醫科學院中藥研究所動物倫理委員會批準(倫理審批號:2021B069)。

1.1.2 藥物 至寶三鞭丸(中亞醫藥保健有限公司,批號:Z37021007);金匱腎氣丸(北京同仁堂醫藥有限公司,批號:Z11020147);左卡尼汀口服液(東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司,批號:H19990372)。

1.1.3 試劑與儀器 腺嘌呤(上海麥克林生化科技有限公司,批號:A800685);雌二醇(Estradiol,E2)ELISA試劑盒(上海江萊生物科技有限公司,批號:JL13135);睪酮(Testosterone,T)ELISA試劑盒(上海江萊生物科技有限公司,批號:JL13284);促卵泡素(Follicle-Stimulating Hormone,FSH)ELISA試劑盒(上海江萊生物科技有限公司，批號：JL13103)，黃體生成素(Luteinizing Hormone,LH)ELISA試劑盒(上海江萊生物科技有限公司,批號:JL13135),多巴胺(Dopamine,DA)ELISA試劑盒(上海江萊生物科技有限公司,批號:JL13316),5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)ELISA試劑盒(上海江萊生物科技有限公司,批號:JL13048),去甲腎上腺素(Norepinephrine,NE)ELISA試劑盒(上海江萊生物科技有限公司,批號:JL13034),蘇木精-伊紅(Hematoxylin-Eosin,HE)染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,批號:G1120),Masson三色染色試劑盒(北京雷根生物科技有限公司,批號:G1346),Nikon精子質量分析系統高倍顯微鏡(尼康株式會社,日本,型號:TS2),Molecular Devices酶標儀(Molecular Device科技有限公司,美國,型號:ID3)。

1.2 方法

1.2.1 分組和模型制備 將98只SD雄性大鼠按照體質量隨機區組法分為7組,每組14只,正常組、模型組、三鞭丸高劑量組[0.72 g/(kg·d)]、三鞭丸中劑量組[0.36 g/(kg·d)]、三鞭丸低劑量組[0.18 g/(kg·d)]、金匱腎氣丸組[中藥陽性對照,10 g/(kg·d)]和左卡尼汀組[西藥陽性對照,口服液,10 mL/(kg·d)]。除正常組灌胃生理鹽水(25 mL/kg)外,其余各組灌胃腺嘌呤(10 mg/mL),按照200 mg/(100 g·d)劑量,1次/d,連續30 d,制備腎陽虛證大鼠模型,實驗全過程中沒有動物死亡。造模后,每日觀察體征變化并記錄體質量變化,出現體質量及活動能力下降,畏寒,體毛稀疏失去光澤等體征,可判定為造模成功。

1.2.2 給藥方法 至寶三鞭丸、金匱腎氣丸和左卡尼汀口服液均用蒸餾水進行溶解,按照人與大鼠藥物體表換算的方式配成對應的濃度[7],放入冰箱保存,使用時混合均勻即可。

1.2.3 檢測指標與方法

造模成功后最后一次給藥2 h后,稱定大鼠體質量,腹主動脈取血后,取出腎臟、睪丸、附睪、輸精管等器官進行稱重,器官指數計算采用:器官/體質量×100%[8]。

1.2.3.1 腎臟、睪丸組織病理學檢測 大鼠腹主動脈取血后,取出腎臟、睪丸和附睪組織,浸入4%多聚甲醛固定液中固定,待用。腎臟、睪丸和附睪組織切片用HE染色。將腎臟和睪丸組織切片在二甲苯中脫蠟,在乙醇分級中再水化至去離子水,根據說明書進行染色,其中使用Weigert蘇木精(細胞核)、比布里希猩紅酸品紅(細胞質/肌肉)和苯胺藍(膠原蛋白)。然后,通過Nikon TS2顯微鏡觀察并用數碼相機記錄,其中每個切片檢查5個隨機區域。采用Image J軟件選中炎癥細胞浸潤區域,同一方法計算3張同一組HE圖片面積,計算平均值,即為該組炎癥反應強度[9]。

此外,使用Masson三色染色試劑盒檢測腎臟纖維化程度。按照說明書中的操作步驟進行染色。觀察拍照及計算方法同HE染色。使用Image J軟件對Masson染色下腎小球纖維化程度進行評估(腎小球內藍色膠原纖維面積)[10]。

1.2.3.2 精子計數及活力檢測 腹腔注射戊巴比妥鈉后,取出大鼠的附睪。將附睪放入到1 mL的37 ℃預孵育的生理鹽水(精子解育液)中,用眼科剪成均勻的小碎塊,200目篩過濾,加入預熱生理鹽水,制成精子懸液。取1滴精子懸液在Nikon TS2精子質量分析系統高倍顯微鏡下計數。根據世界衛生組織手冊[11],精子活力分為4個等級:A級為快速向前運動;B級為緩慢向前運動;C級為非前向運動;D級為精子原地不動。計算出A+B級精子的比例。

1.2.3.3 大鼠血清中性激素和神經遞質表達水平檢測 收集大鼠血液10 mL,靜置1 h后,1 000 g/min,離心5 min,吸取上層血清。采用酶聯免疫吸附試驗(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)檢測大鼠血清中性激素(E2、T、FSH、LH)和神經遞質(DA、5-HT、NE)的含量。

2 結果

2.1 至寶三鞭丸對腎陽虛型大鼠體質量和器官指數的影響 與正常組比較,模型組大鼠的體質量均有下降,差異有統計學意義(P<0.01);與模型組比較,三鞭丸中劑量組、高劑量組、金匱腎氣丸組和左卡尼汀組體質量明顯升高,差異均有統計學意義(均P<0.01),三鞭丸低劑量組與模型組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

肉眼觀察可見正常組大鼠雙腎呈淡粉紅色,未見異常;模型組雙腎腫大、表面白色,有實變感,表現為“大白腎”;給予三鞭丸藥物干預后,雙腎逐步恢復至正常大小,白色部分逐漸轉變為淡粉紅色。見圖1。

圖1 大鼠腎臟(A)和輸精管(B)

正常組輸精管形態正常,管內部充盈,管壁表面呈淡黃色且有光澤,并且左右側大小基本相同;模型組輸精管出現皺縮,管內部不夠飽滿,管壁表面有紅色充血,無光澤,并且左右側大小不同;給予三鞭丸藥物干預后,輸精管的形態趨于正常,管內部也逐漸充盈,管壁紅色充血部分減少,逐步恢復光澤,并且左右兩側也逐漸恢復至大小相同。

與正常組腎臟比較,模型組大鼠的腎臟系數明顯升高,差異有統計學意義(P<0.01);與模型組比較,三鞭丸中劑量組、高劑量組、金匱腎氣丸組和左卡尼汀組的腎臟系數顯著下降,差異均有統計學意義(均P<0.01),三鞭丸低劑量組腎臟系數也均有所下降,但與模型組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 大鼠體質量(A)、腎臟指數(B)、睪丸指數(C)、附睪指數(D)和輸精管指數(E)變化

與正常組比較,模型組大鼠的輸精管系數明顯下降,差異有統計學意義(P<0.01);與模型組比較,三鞭丸中劑量組、高劑量組、金匱腎氣丸組和左卡尼汀組的輸精管系數顯著升高,差異均有統計學意義(均P<0.05),三鞭丸低劑量組輸精管系數也均有升高的趨勢,但與模型組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

與正常組比較,模型組的睪丸和附睪系數均有所升高,差異均有統計學意義(均P<0.05);與模型組比較,三鞭丸高劑量組睪丸系數下降顯著(P<0.05),三鞭丸低劑量組、中劑量組、金匱腎氣丸組和左卡尼汀組的睪丸系數均有所下降,但與模型組比較差異無統計學意義(P>0.05);同樣,與模型組比較,三鞭丸高劑量組和金匱腎氣丸組的附睪系數同樣下降顯著,差異均有統計學意義(均P<0.05),三鞭丸低劑量組、中劑量組和左卡尼汀組的附睪系數均有所下降,但與模型組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 腎臟、睪丸組織病理分析 與正常組比較,模型組大鼠腎臟中,腎小球萎縮,腎小管管腔擴大,間質中炎癥細胞大量聚集并且小管間質纖維化。與模型組比較,三鞭丸各給藥組和金匱腎氣丸組腎小管間質中炎癥細胞浸潤數目減少。纖維細胞減少,腎小管趨于正常。見圖3A。

圖3 大鼠腎(A)、睪丸(B)和附睪組織(C)組織學(HE染色,×100)

與正常組比較,模型組睪丸萎縮,生精小管管徑變小,排列稀疏,管內各級生精細胞排列紊亂,管腔內精子數目減少。與模型組比較,三鞭丸低劑量組生精小管結構基本正常;三鞭丸中劑量組大鼠睪丸組織結構趨于正常,生精小管結構基本正常;三鞭丸高劑量組生精小管中各級生精細胞排列趨于規整,生精小管結構趨于正常;金匱腎氣丸組大鼠睪丸組織結構趨于正常,生精小管結構基本正常;左卡尼汀組大生精小管結構趨于正常。見圖3B。

與正常組比較,模型組附睪管管壁增厚,排列疏松,間質增大,腔內精子聚集成團,數量減少,排列欠規整。三鞭丸低、中、高劑量組和金匱腎氣丸組附睪管管壁增厚情況明顯改善,排列緊密,腔內精子量增多,分布均勻。左卡尼汀組腔內精子量增多,分布均勻,但是附睪管管壁增厚,排列疏松,管腔增生萎縮。見圖3C。

大鼠腎臟Masson染色結果顯示,與正常組比較,模型組大鼠腎小球和腎小管中觀察到大量藍色的膠原纖維,系膜細胞成團,與管腔壁之間的間隙增大,表明腎臟膠原纖維的表達明顯升高,腎臟細胞間質纖維化程度高。與模型組比較,大鼠在三鞭丸藥物干預后,尤其是三鞭丸高劑量組,腎臟的纖維化程度有明顯改善,系膜細胞排列趨于正常,且與管腔壁之間的間隙縮小,表明腎臟細胞間質纖維化程度減小。金匱腎氣丸組和左卡尼汀組管腔壁之間的間隙縮小。見圖4。

圖4 大鼠腎組織學(Masson染色,×100)

2.3 至寶三鞭丸對腎陽虛型大鼠精子的影響 與正常組比較,模型組的精子數量顯著減少;與模型組比較,三鞭丸低、中、高劑量組的精子數量均顯著增高提示三鞭丸具有改善精子腎陽虛所致的精子數量減少問題;金匱腎氣丸組和左卡尼汀組的精子數量與模型組比較也都顯著升高。見圖5A。

圖5 大鼠精子形態和大鼠精子活力

在精子活力方面,與正常組比較,模型組的精子形態上,頭部出現有雙頭、圓頭,并且還出現有頭部與身體分離,精子不呈線性運動,原地打轉,并且大部分精子處于靜止狀態,無活力;與模型組比較,給予三鞭丸后精子活力與形態均有所改善,精子頭部大部分是鉤狀,基本無斷頭心形態,精子的活力增強。見圖5B。

與正常組比較,模型組的精子濃度,精子運動能力和精子存活率均顯著降低,差異有統計學意義(P<0.01),而精子的畸形率則顯著升高,差異有統計學意義(P<0.01);而在給予三鞭丸藥物干預后,大鼠的精子濃度,精子運動能力和精子存活率均較模型組顯著提升,差異有統計學意義(P<0.01),而畸形的精子也較模型組顯著降低,差異有統計學意義(P<0.01),其中三鞭丸高劑量組效果最好。比較之下,金匱腎氣丸組和左卡尼汀組雖均能改善精子活力,數量和形態,但效果均不如三鞭丸高劑量組。見圖5C～F。

2.4 至寶三鞭丸對大鼠血清中性激素和神經遞質表達的影響 與正常組比較,模型組的性激素E2、FSH、LH的含量均顯著升高,差異有統計學意義(P<0.01);T含量顯著下降,差異有統計學意義(P<0.01);與模型組比較,除三鞭丸低劑量和金匱腎氣丸組(P>0.05),其余三鞭丸給藥組和左卡尼汀組均能顯著降低E2的含量,差異有統計學意義(P<0.05),且三鞭丸高劑量組效果最好;針對T的影響,三鞭丸各給藥組、金匱腎氣丸組和左卡尼汀組均能顯著升高T的含量,差異有統計學意義(P<0.05),三鞭丸高劑量組效果最優;針對FSH和LH的含量影響,三鞭丸各給藥組、金匱腎氣丸組和左卡尼汀組均顯著降低,且差異有統計學意義(P<0.01),三鞭丸高劑量組效果最優。見表1。

表1 大鼠血清中神經遞質和內分泌激素的含量

關于對神經遞質的影響,與正常組比較,模型組的神經遞質DA、NE和5-HT的含量均有顯著升高,差異有統計學意義(P<0.01);與模型組比較,三鞭丸各給藥組金匱腎氣丸和左卡尼汀組的DA、NE、5-HT含量均顯著下降,差異有統計學意義(P<0.01)。

3 討論

至寶三鞭丸是一種強力的補腎藥,其作用顯著,療效確切,在臨床廣泛用于腎陽虛并伴有性功能低下者為宜。該方中人參、鹿茸、3種鞭藥相互配伍,有效改善腎陽衰微之性欲低下、陽痿等癥狀[12-13]。本實驗通過構建腺嘌呤誘導的腎陽虛大鼠模型,分別從大鼠整體表征,性器官指數變化,組織病理學變化以及與HPGA相關的性激素和神經遞質等角度評價了至寶三鞭丸對腎陽虛大鼠的改善作用。實驗結果表明了至寶三鞭丸可改善腺嘌呤致腎陽虛模型大鼠的腎陽虛癥狀,從不同程度地減輕腺嘌呤對大鼠HPGA的抑制作用,且對腺嘌呤造模引起的大鼠睪丸和附睪組織損傷有一定程度的保護作用,呈現出良好的補腎助陽功效。

有研究表明,在HPGA與腎虛關系中,發現男性腎陽虛證患者T較正常下降,E2較正常升高。在HPGA的調控下,垂體合成并釋放LH和FSH,進而促進性腺睪丸釋放T,T、LH和FSH對下丘腦有反饋抑制作用,形成健康成年男性良好的內分泌循環[14]。另外,有研究表明神經遞質DA、5-HT和NE的合成與釋放能夠調控HPGA的功能[15]。本研究結果顯示腺嘌呤會誘發大鼠的一般體征發生改變;HE染色結果說明三鞭丸可以有效緩解腺嘌呤所誘導的腎臟,睪丸,附睪等生殖器官的病理改變;大鼠腎臟Masson染色結果顯示,三鞭丸能有效緩解腺嘌呤所致的腎纖維化程度;三鞭丸可以通過對相關性激素和神經遞質來有效緩解腺嘌呤所致腎陽虛動物的病理狀態,并且三鞭丸高劑量組效果最優,這也與以往研究結果相符。

本實驗也選取了補腎藥金匱腎氣丸作為陽性對照藥,但是,至寶三鞭丸在緩解一些腎陽虛病理狀態的藥效方面要優于金匱腎氣丸。腺嘌呤誘導的腎陽虛主要是腎陽衰微的腎功能不全、性欲低下和陽痿,至寶三鞭丸可以通過滋補腎陽、益氣活血有效地改善腺嘌呤誘發的腎陽衰微等[16-17]。而金匱腎氣丸主要是針對腎陰虧損,虛火內生所致腎陽虛癥狀,其改善腎虛的癥狀主要是通過化氣行水,滋補陰血的功效[4,18-19]。

研究發現,HPGA的功能障礙是腎陽虛證的基礎,HPGA由3個水平組成:下丘腦、垂體、性腺(男性睪丸、女性卵巢)。更為重要的是,性腺功能直接與激素-內分泌系統功能穩態緊密關聯[20-21]。一般認為,性反應過程與神經內分泌的調控相關。不同神經中樞通過接受各種激素(DA、5-HT、NE)刺激,下丘腦進一步接收信息,加工轉換為神經內分泌信號,釋放促性腺激素釋放激素(Gonadotropin-releasing Hormone,GnRH),刺激腺垂體嗜堿性細胞釋放FSH、E2、LH和T。這4種促性腺激素進一步刺激性腺,分泌性激素,促使男性生殖器官發育成熟,并作為維持正常性功能的基本條件[22-23]。上述現代醫學認識形成了公認的HPGA,從生理功能整合、系統調節的角度,揭示出生殖功能改變的深層次、系統性原因,也大大拓展了人們對生殖相關疾病的認識領域和治療策略認識[24-25]。

隨著臨床和科研對HPGA與腎陽虛證的深入探究,已經形成了具有科學意義且相對統一的評價標準[25],主要對血清中E2、T、LH、FSH等微觀指標的檢測。經至寶三鞭丸干預后,大鼠血清中LH、T的水平均得以改善,E2/T比值失衡亦得以糾正,尤以高劑量對FSH、LH、E2/T比值的改善最佳。上述研究結果表明,至寶三鞭丸可基于對HPGA的調控改善腺嘌呤致腎陽虛證模型大鼠的腎陽虛癥狀,呈現出良好的補腎助陽功效。

4 結論

本研究評價至寶三鞭丸對于腺嘌呤所致腎陽虛證模型動物生殖系統結構和對HPGA功能的改善作用,對于該藥物針對腎陽虛證治療有效性評價和科學內涵揭示具有積極意義。

利益沖突聲明:無。