動物細胞懸浮培養技術在獸用疫苗生產中的應用

劉玉靜，劉召明，楊香芳，趙同淵，王翠菊，王琳

（青島易邦生物工程有限公司 山東青島 266113）

在20 世紀60-70 年代，科學家們建立了微載體懸浮培養體系，同時創建了空纖維細胞培養技術，為在體外進行大規模的細胞培養創造了可能[1]。細胞懸浮培養技術是指通過使用生物反應器，在人工條件下，對用于生物制品當中的動物細胞進行大規模高效率的培養技術。隨著生物技術的不斷革新、發展，動物細胞懸浮培養技術已經廣泛地用于病毒的大規模培養當中，這項培養技術具有非常高效的生產效率，同時還具有高質量與生物安全容易掌控等多方面的優點。在細胞懸浮培養中用于體外培養的細胞絕大多數為動物源性，因此這項技術在獸用疫苗的制備當中得到了很好的運用。細胞懸浮技術根據動物細胞貼壁能力的差異，又被分為了全懸浮和貼壁懸浮這兩種培養方式。

1 細胞懸浮培養的關鍵技術

1.1 選擇和懸浮馴化動物細胞系

在動物疫苗的生產過程當中，安全性、有效性和成本控制是疫苗生產最主要的幾點考慮因素，只有如此才能提高獸用疫苗生產的生產效率，同時確保生物產品的質量具有可靠性。在生產過程中，做好動物細胞系的選擇和馴化這兩個方面，對以上幾點要求的優化達標具有非常重要的意義。由于同一種細胞和準備擴增的病毒之間能夠產生相互作用，因此在應用某細胞系進行大規模的疫苗生產之前，應該提前與目標病毒進行相互的適應性選擇。同時，所選細胞的生長特性對能否進行大規模增殖培養，以及使用哪種工藝進行增殖培養具有決定性的作用，這是由于同一種細胞在不同的培養狀態下對病毒的敏感程度也不盡相同[2]。另一方面，這項技術對懸浮細胞的繁殖效率、活力以及生物穩定性等均具有較高的要求，馴化是細胞懸浮的首要任務，特別是對于貼壁細胞來說，在微載體懸浮培養的狀態下會明顯的改變貼壁細胞的生長狀態，因此穩定性是細胞馴化過程中最重要的考慮因素，在實際的生產過程中，可以通過逐漸降低培養基中血清的濃度來達到維持較高穩定性的目的。若在培養過程中細胞受到了損傷，就難以恢復原狀，因此在整個馴化的過程中，最好能夠令細胞的活力維持在90%以上。

1.2 最適培養基的選擇

選擇適宜的培養基是細胞懸浮培養技術中最為關鍵性的環節。一般情況下，動物細胞的生長必須存在血清這種營養成分，但由于血清的組成成分比較復雜，并且存在價格高昂，不同批次間血清組成成分差異較大等弊端，導致這種培養基在實際的疫苗生產當中難于應用。當前，隨著技術的不斷革新，這種血清培養基已經被逐漸替代為無血清培養基，有效降低了血清培養基容易被污染的情況，同時還在一定程度上降低了生產的成本。但由于細胞培養對培養基具有較高的選擇性，單一一種無血清培養基無法適用于多種細胞系的培養，這就促使了個性化無血培養基的快速發展，可以在無血清培養基當中加入適量的轉鐵蛋白、胰島素或者纖連蛋白等特定的生物活性物質，以促進動物細胞的快速繁殖生長[2]。據當前的研究報道，在大部分疫苗生產和組織工程細胞擴大培養過程中已經融入了無血清微載體培養技術[3]。但在實際操作中發現由無血清培養所引發的細胞凋亡問題，仍然阻礙著細胞懸浮技術的應用發展。

1.3 選擇恰當的生物反應器

作為細胞懸浮培養技術中心的關鍵性設備，生物反應器主要是利用細胞或者酶作為生物催化劑，同時還能夠為細胞的生長繁殖提供一種無菌環境。其最大的優勢就是能夠進行逐級放大，而由于疫苗生產的成本會受生產細胞規模的影響，因此生物反應器的選擇就直接影響到了疫苗生產成本。在疫苗生產中對生物反應器的要求通常包括以下幾點：生產效率高、可靠性較強、生產成本較低、安全性能強、活性較強、便于控制質量和回收，同時具有較高的細胞密度。在實際生產中應用較多的有以下幾種生物反應器，分別是：流床式生物反應器、氣升式生物反應器和旋轉式細胞培養系統等[2]。

1.4 生產工藝的選擇

生產工藝的選擇決定了細胞懸浮培養技術最后的投入加工過程，按照培養方式的不同可以分為以下5 種：分批式、流加式、半連續式、連續式以及灌流式操作等幾種操作模式。不同的生產工藝具有其自身的特點與優勢，同時還具有自身相對應的生物反應器的類型，在實際生產過程中，可以根據所培養細胞的不同和所生產的疫苗種類，進行靈活的優化選擇。

2 動物細胞懸浮培養技術在獸用疫苗生產中的應用

2.1 在豬病疫苗生產中的應用

隨著我國生豬養殖業規模化與集約化程度的不斷加深，各種傳染性疫病的發生率也在逐年提高，如常見的豬藍耳病、偽狂犬病、豬瘟、豬細小病毒以及豬圓環病毒病等均會對生豬養殖業造成巨大的危害。而控制這些疾病最好的辦法就是按照規定接種相關的疫苗，正是得益于動物細胞懸浮培養技術的成熟與發展，讓各種獸用疫苗的大批量生產成為現實，同時還保證了生物安全性。例如馮磊等[4]就利用了微載體懸浮培養技術將豬藍耳病病毒在Marc-45細胞上進行了大規模的培養，并且成功地取得了較高的病毒效價。王建超等[5]則利用Vero 細胞懸浮培養系統大規模地生產出了豬流行性腹瀉病毒，并且發現隨微載體濃度的提高，所獲得的最高細胞密度也在提高，同時利用CelliGen 生物反應器，將培養條件進一步優化，制備出了具有較好免疫原性的疫苗。

2.2 在雞病疫苗生產中的應用

雞是我國重要的畜禽產品，特別是雞蛋、肉類在國民生活中占據著重要的地位，但雞病的控制也給養殖業帶來了巨大的困擾。尤其是一些病毒性的傳染性疾病，可以給養殖者帶來巨大的危害，通過科學合理的接種疫苗，能夠最大限度地降低傳染性疫病給雞養殖業所帶來的損失。在我國利用SPF 雞胚進行擴增是生產禽用疫苗最為常見的方法，但這種方法對于雞胚的培養周期、操作、來源以及是否受到了污染等因素具有較高的要求，同時難于在短時間集齊大規模生產所用的數百萬枚的SPF 雞蛋。基于細胞懸浮培養技術，在國內外已經實現了利用細胞懸浮培養大批量的生產禽用疫苗。在我國有公司利用Vero 細胞懸浮培養技術成功生產出禽流感疫苗，也利用該項技術生產出了符合國內獸用生物制品標準的雞傳支H120 細胞弱毒疫苗[2]。石崗等[6]通過Vero 細胞懸浮培養技術實現了雞傳染性法氏囊病疫苗的規模化生產。

2.3 在其他畜禽疫苗生產中的應用

除上述對單一的物種傳染性較強的致病源以外，還有一些人畜共患的致病源，流行的范圍較為廣泛，危害性也比較強，可以通過接種疫苗的方式進行預防控制。例如李薇等[7]通過Vero 細胞懸浮培養技術對乙型腦炎病毒疫苗的大規模生產進行了探究，并且為進一步放大創造了新思路。國內外研究人員利用細胞懸浮培養技術均對甲型H1N1 流感疫苗的制備進行了探究，并且發現在MDCK細胞中使用微載體培養能夠達到較高的細胞密度。

3 結語

綜上所述，動物細胞懸浮技術以其獨特的自身優勢，已經被廣泛應用于獸用疫苗的生產應用當中，為實現大規模、質量可靠的生物制品性疫苗提供了技術支持。并且隨著工藝與技術的不斷更新與發展，動物細胞懸浮培養也變得更加容易，更加促進了獸用疫苗規模化生產的發展。■